BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH
TÔ MINH HIỆP
NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊNH LƢỢNG AXIT KAURENOIC
TRONG MỘT SỐ CÂY THỰC VẬT THUỘC CHI NA
(ANNONA) Ở VIỆT NAM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC
KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Vinh – 2014
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài " NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊNH LƢỢNG AXIT
KAURENOIC TRONG MỘT SỐ CÂY THỰC VẬT THUỘC CHI NA (ANNONA)
Ở VIỆT NAM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO"
Đề tài luận văn này đƣợc hoàn thành với sự hƣớng dẫn khoa học và chỉ bảo
tận tình của PGS.TS. Trần Đình Thắng – Phó Trƣởng khoa – Khoa Hóa,
Trƣờng Đại học Vinh. Thầy đã dành nhiều thời gian hƣớng dẫn và giải đáp
thắc mắc của tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn
sâu sắc đến thầy.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị ở phòng thực hành thí nghiệm
Hóa phân tích tại Trƣờng Đại Học Vinh đã tận tình giúp đở tôi trong quá trình
tôi phân tích mẫu vật và làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các quý cơ quan đã tạo điệu kiện giúp đỡ về
mọi mặt để luận văn này hoàn thành đúng kế hoạch.
Tôi xin cảm ơn các Thầy Cô khoa Hóa, Phòng Đào tạo sau Đại Học
Trƣờng Đại Học Vinh và Trƣờng Đại Học Đồng Tháp, các Thầy Cô tham gia
giảng dạy Cao học khóa 20, lớp Hóa phân tích năm học 2012 – 2014 lời cảm
ơn sâu sắc công ơn dạy dỗ trong suốt quá trình giáo dục, đào tạo của nhà
trƣờng. Đồng thời Tôi cũng gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Cao học Hóa phân
tích Khóa 20 đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn.
Tuy nhiên do sự hiểu biết của bản thân và khuôn khổ của luận văn thạc
sĩ, nên chắc trong quá trình nghiên cứu không tránh khỏi những thiếu sót, Tôi
rất mong đƣợc sự đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô và độc giả quan tâm đến
luận văn này, chân thành cám ơn !
Nghệ An, ngày 26 tháng 10 năm 2014
Tác giả


1.4.3. Cách thức xây dựng và thực hiện phƣơng pháp sắc ký
fingerprint 20

2
1.5. Hệ thống phân tích HPLC 30
1.5.1. Nguyên lý 30
1.5.2. Phân loại 31
1.5.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo 32
1.5.4. Pha động trong sắc ký pha đảo 33
1.5.5. Các bộ phận của hệ thống HPLC 36
1.5.6. Phƣơng pháp tiến hành sắc ký 37
1.5.6.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc 37
1.5.6.2. Chuẩn bị dung môi pha động 37
1.5.6.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC 38
1.5.6.4. Cách đo HPLC 38
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 39
2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu 39
2.1.1. Thu mẫu 39
2.1.2. Phân lập chất chuẩn axit kaurenoic 40
2.2. Phƣơng pháp phân tích 41
2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 41
2.3.1. Thiết bị 42
2.3.2. Dụng cụ 42
2.3.3. Hóa chất 42
2.4. Kỹ thuật thực nghiệm 42
2.4.1. Chuẩn bị hóa chất phân tích 42
2.4.2. Xây dựng đƣờng chuẩn 43
2.4.3. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu 43
2.4.4. Tiến hành phân tích trên máy HPLC/UV 45
2.4.5. Tối ƣu hóa phƣơng pháp 45

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
CC: Column Chromatography (Sắc ký cột)
FC: Flash Chromatography (Sắc ký cột nhanh)
TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)
IR: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)
MS: Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng)
EI-MS: Electron Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối va chạm electron)
ESI-MS: Electron Spray Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng phun
mù electron)
1
H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy
13
C-NMR: Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy
DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer.
HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation
HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation
COSY: Correlation Spectroscopy
s: singlet
br s: singlet tï
t: triplet
d: dublet
dd: dublet của duplet
dt: dublet của triplet
m: multiplet
TMS: Tetramethylsilan
DMSO: DiMethylSulfoxide

DANH SÁCH CÁC BẢNG

DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH Trang
Hình 1.1:
Công thức cấu tạo các hợp chất lignan
7
Hình 1.2:
Công thức cấu tạo các hợp chất acetogenin
9
Hình 1.3:
Công thức cấu tạo các hợp chất flavonoit
12
Hình 1.4:
Công thức cấu tạo: 16, ent-kaur-15-en-17,19-diol
16
Hình 1.5:
Công thức cấu tạo của axit kaurenoic
17
Hình 1.6:

45
Hình 3.1:
Phổ UV-Vis của hợp chất axit kaurenoic
50
Hình 3.2:
Phổ IR của hợp chất axit kaurenoic
50
Hình 3.3:
Phổ EI-MS của hợp chất axit kaurenoic
51
Hình 3.4:
Phổ
1
H-NMR của hợp chất axit kaurenoic
51
Hình 3.5:
Phổ
13
C-NMR của hợp chất axit kaurenoic
52
Hình 3.6:
Phổ DEPT của hợp chất axit kaurenoic
52
Hình 3.7:
Phổ DEPT dãn của hợp chất axit kaurenoic
53
Hình 3.8:
Phổ HMBC của hợp chất axit kaurenoic
54
Hình 3.9:

Sắc đồ mẫu na 004 (vỏ na xiêm)
66
Hình 3.19:
Sắc đồ mẫu na 005 (lá na xiêm)
66
Hình 3.20:
Sắc đồ mẫu na 006 (lá bình bát)
67 1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Thảo dƣợc có mặt ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là các khu vực
nhiệt đới. Thảo dƣợc đóng vai trò quan trọng trong các liệu pháp chữa bệnh
bằng y học cổ truyền tại các nƣớc phƣơng Đông. Nguồn tài nguyên thiên
nhiên này không những mang nguồn lợi về kinh tế cho cộng đồng dân cƣ sinh
sống tại những nơi có thảo dƣợc mà còn đóng góp vào các liệu pháp chữa
bệnh cho cộng đồng ở những khu vực khác. Từ xa xƣa con ngƣời đã biết sử
dụng những thảo dƣợc thiên nhiên nhằm mục đích bồi bổ sức khỏe, làm chậm
lại quá trình lão hóa, kéo dài tuổi thọ.
Việt Nam đƣợc ghi nhận là một trong những trung tâm đa dạng sinh
học của thế giới. Các hợp chất thiên nhiên luôn đóng vai trò hết sức quan
trọng trong đời sống con ngƣời trong việc sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc
bảo vệ thực vật, nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, hƣơng liệu, mỹ
phẩm…
Ở các vùng nhiệt đới, tất cả các bộ phận của các cây họ Na đƣợc sử
dụng trong các liệu pháp thiên nhiên, nhƣ là: vỏ cây, lá, rễ, quả, và hạt của
quả. Những tính chất và ứng dụng khác nhau phụ thuộc vào các bộ phận khác
nhau của cây. Nói chung, quả và nƣớc ép từ quả có thể tẩy giun và ký sinh

trong thảo dƣợc, để đánh giá và quản lý chất lƣợng thảo dƣợc. Ví dụ nhƣ
phƣơng pháp phân lập hợp chất theo định hƣớng hoạt tính sinh học và xác
định cấu trúc hóa học, phƣơng pháp này có thể phát hiện và phân lập một số
hợp chất có hoạt tính trong thảo dƣợc. Tuy nhiên trong thảo dƣợc tồn tại rất
nhiều hợp chất, nhiều hợp chất chỉ tồn tại với hàm lƣợng rất thấp, đôi khi
không bền, dạng đồng phân, dạng dễ bị phân hủy ngay khi bị phân lập. Do đó
việc sử dụng phƣơng pháp phân lập thông thƣờng gặp rất nhiều khó khăn
trong việc đánh giá và kiểm soát thành phần của thảo dƣợc. Trong điều kiện
đó một phƣơng pháp đang đƣợc phát triển và ứng dụng đó là phƣơng pháp sắc

3
ký, phƣơng pháp này kết hợp với các phƣơng pháp phân lập, xác định cấu trúc
và hoạt tính đang đƣợc ứng dụng nhiều trong việc đánh giá, kiểm soát chất
lƣợng dƣợc liệu [4].
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu và định
lƣợng axit kaurenoic trong một số cây thực vật thuộc chi Na (Annona)
bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” làm luận văn tốt nghiệp
thạc sỹ.
2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu các phƣơng pháp định lƣợng axit kaurenoic.
- Nghiên cứu quy trình tách, chiết axit kaurenoic trong các mẫu cây thuộc
chi Na thu đƣợc trong quá trình lấy mẫu thực tế.
- Nghiên cứu quy trình định lƣợng axit kaurenoic bằng phƣơng pháp
HPLC.
3. Đối tƣợng – phạm vi nghiên cứu
Định lƣợng axit kaurenoic trong một số loài thuộc chi Na (Annona): Na
(Annona squamosa), Na Xiêm (Annona muricata), Bình Bát (Annona
reticulata).

4

khuẩn và đặc biệt là khả năng sử dụng trong hóa học trị liệu từ một số thành
phần hóa học của lá, rễ và vỏ cây, quả, vỏ của quả…
Một số loài đƣợc trồng làm cây cảnh, đặc biệt là Polyalthia longifolia
pendula.
Những năm gần đây họ Na đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới quan
tâm nghiên cứu.
Đặc biệt, nhóm nghiên cứu của Yang-Chang Wu (Đài Loan) đã tìm
đƣợc hơn 100 hoạt tính sinh học của các chất tách ra từ cây họ Na
(Annonaceae). Trong đó có nhiều chất có độc tính, hoạt tính kháng vi trùng,
ức chế sự tái tạo tế bào HIV, chống đông tụ tiểu cầu.
Nhóm nghiên cứu của De-Quan Yu (Trung Quốc) [18] đã nghiên cứu
và tách đƣợc các chất có khả năng chống u bƣớu từ thực vật họ Na: có
khoảng 50 acetogenin, 12 styrylpyron và 25 polyoxygenat cyclohexen mới
đƣợc tách ra từ 5 loài Uvaria, 4 loài Goniothalamus và 1 loài Annona. Bƣớc
đầu kiểm tra hoạt tính sinh học, phần lớn các chất mới tách ra có các hoạt
tính chống u, bƣớu quan trọng.
1.2 Chi Annona
Chi Annona L. có 125 loài, phân bố tập trung ở các vùng nhiệt đới châu
Mỹ và châu Phi. Ở Việt Nam, có 4 loài, trong đó có 3 loài là cây trồng, gồm:
Na (Annona squamosa L.), Mãng cầu xiêm (A. Muricata L.), Bình bát (A.
Reticulata L.).
Từ Chi Annona các nhà khoa học đã phân lập đƣợc nhiều loại hợp chất
khác nhau nhƣ: cacbohydrat, chất béo, amino acid, protein, polyphenol, tinh
dầu, tecpen, các hợp chất thơm, cyclopeptit, flavonoit, ent-kauran
ditecpenoit, lignan

6
1.2.1 Các hợp chất lignan
Có 9 chất lignan (38-47) của chi Annona đƣợc Yang và cộng sự; Wu
và cộng sự công bố. Các lignan đƣợc tìm thấy ở loài A. montana, A.

''
2
''
3
''
4
''
5
''
6
''
O
O
CH
3
O
OH
OMe
H
H
OH
OMe
OMe
RO
CH
3
O
OMe

38, R=H 39


7
1
O
O
H
H
OMe
CH
3
O
R
3
R
R
2
OMe

43, R
1
=R
2
=R
3
=OCH
3

44, R
1
=H, R

với các nhóm chức nhƣ –OH, =O, C=C và diol kề nhau trong mạch dài.

O
(CH
2
)
9
OH
O
OH
Me
(CH
2
)
4
OH
(CH
2
)
5
48
erythro
trans
threo
threo
trans
OH
O
O
Me

=OH 8
O
OH
O
OH
Me
(CH
2
)
5
(CH
2
)
10
O
O
Me
trans
trans
50
threo
threo
threoO
OH

OH
(CH
2
)
5
O
O
Me
Me
erythro
erythro
trans
trans
threo
threo
55

O
OH
O
OH
(CH
2
)
5
OH
(CH
2
)
10

Isodesacetyluvaricin
A. artemoya
51
Neoannonin
A. artemoya
52
rollimusin*
R. mucosa
53
rolliniastatin-1
R. mucosa
54
rolliniastatin-2 (bullatacin)
A. reticulata
A. artemoya
R. mucosa
55
Rollitacin
R. mucosa
56
Squamocin
A. cherimola
A. reticulata
A. squamosa
A. artemoya
R. mucosa
O
(CH
2
)

(20,23-cis)-trans-bullatalicinon*
R. mucosa
59
12,15-cis-squamostatin-A*
A. artemoya
60
12,15-cis-squamostatin-D*
A. artemoya
61
aromin-A
A. cherimola
62
Bullatanocin
A. artemoya
63
Bullatacinon
A. reticulata
64
Bullatalicin
A. artemoya
R. mucosa
65
Bullatalicinon
R. mucosa
66
c-12,15-cis-bulatalicin
A. artemoya
67
c-12,15-cis-bulatanocin
A. artemoya

78
epomusenin B*
R. mucosa
79
Annomonicin
A. reticulata
80
Annonacin
A. montana
81
annonacin-10-on
A. montana

11
82
annoreticuin*
A. reticulata
83
annoreticuin-9-on*
A. reticulata
84
Corossolin
A. muricata
85
Corossolon
A. muricata
86
Isoannonacin
A. montana
87

muricin E*
A. muricata
98
muricin F*
A. muricata
99
muricin G*
A. muricata
100
Murisolinon
A. reticulata
101
rolliacocin*
R. mucosa
102
Solamin
A. reticulata
103
Squamon
A. reticulata
* Chất mới
1.2.3 Các hợp chất flavonoit
Các hợp chất flavonoit là chất phổ biến trong thực vật bậc cao. Wu và
cộng sự đã tìm thấy 4 chất flavonoit và tất cả chúng đều là dẫn xuất của
glycosit: quercetin-3-O-rhamnosit (108), kaempferol-3-O- rhamnosit (109),

12
isorhamnetin-3-O-rhamnosit (110), tanarixetin-3-O- rhamnosit (111) thu
đƣợc từ lá của A. purpurea.
O

Hình 1.3: Công thức cấu tạo các hợp chất flavonoit
1.2.4. Các hợp chất diterpenoit kauran
Bộ khung cơ bản của các hợp chất diterpenoit kauran gồm 20 cacbon.
Một số hợp chất đƣợc tách ra gồm 19 cacbon và đƣợc gọi tên nor-kauran
diterpenoit. Trong nghiên cứu của Wu và cộng sự đã tách đƣợc 37 hợp chất
kauran từ 4 loài, khác nhau bao gồm: A. cherimola, A. glabra, A. squamosa
và R. mucosa và 7 chất trong số chúng là chất mới phát hiện. Cấu trúc và sự
tìm thấy của các hợp chất đƣợc nêu ra ở bảng 1.1.
Bảng 1.2: Các hợp chất diterpenoit kauran
TT
Hợp chất
R
1

R
2

R
3

Loài
1
axit ent-kaur-16-
en-19-oic

C=C
COOH
A.squamosa
A. glabra
2

R
2

108 OH OH
109 H OH
110 OCH
3
OH
111 OH OCH
313
ent-kauran-19-oic
5
axit 16α,17-
dihydroxy-ent-
kauran-19-oic
CH
2
OH
OH
COOH
A.cherimola
A. glabra
A.squamosa
6
16α-hydro-ent-
kauran-17-ol-19-al
CH

CHO
A. glabra
10
annoglabasin C *
COOCH
3

OAc
COOH
A. glabra
11
annoglabasin D *
COOCH
3

OAc
CHO
A. glabra
12
annoglabasin F *
COOCH
3

OAc
OH
A. glabra
13
este 16α-hydro-ent-
kauran-17,19-
dimethyl

al-ent-kauran-17-
COOH
H
CHO
A. glabra

14
oic
18
annoglabasin E *
COOH
H
CH
2
OH
A. glabra
19
axit 16α-hydro-ent-
kauran-17,19-dioic
COOH
H
COOH
R. mucosa
20
axit 16α-hydro-19-
nor-ent-kauran-4α-
ol-17-oic
COOH
H
OH

24
axit 19-formyl-ent-
kauran-17-oic
H
COOH
CHO
A.squamosa
25
16β-hydro-ent-
kauran-17-ol-19-al
H
CH
2
OH
CHO
A.cherimola
26
axit 4α-hydroxy-
19-nor-ent-kauran-
17-oic
H
COOH
OH
A. squamosa
27
methyl-16β-
acetoxy-19-al-ent-
kauran-17-oat
OAc
COOCH

OH
CH
2
OH
CH
2
OH
A.squamosa
31
axit 16β,17-
dihydroxy-ent-
kauran-19-oic
OH
CH
2
OH
COOH
A.squamosa
32
methyl-16β,17-
dihydroxy-ent-
kauran-19-oat
OH
CH
2
OH
COOCH
3

A.squamosa

16β-hydroxy-17,19-
diacetoxy-ent-
kauran
OH
CH
2
OAc
CH
2
OAc
A.cherimola
37
19-nor-ent-kauran-
4α,16β,17-triol *
OH
CH
2
OH
OH
A.squamosa