BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH PHẠM THỊ NGUYỆT
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
CÁC AXIT AMIN TRONG MỘT SỐ LOÀI NẤM LỚN
Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGHỆ AN - 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH PHẠM THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
CÁC AXIT AMIN TRONG MỘT SỐ LOÀI NẤM LỚN
trong Khoa Hoá học - trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện cho tôi được học
tập và nghiên cứu trong một môi trường học tập khoa học.
Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn
bè đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Vinh, tháng 10 năm 2014
Học viên
Phạm Thị Nguyệt
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
1. Lí do chọn đề tài 1
2. Mục đích nghiên cứu 2
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2
Chương 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Nấm 3
1.1.1. Định nghĩa về nấm lớn 3
1.1.2. Phân loại nấm 3
1.1.3. Đặc điểm dinh dưỡng của nấm 3
1.1.4. Vai trò của nấm trong tự nhiên và trong đời sống con người 9
1.2. Axit amin 12
1.2.1. Định nghĩa và cấu trúc 12
1.2.2. Phân loại 14
1.2.3. Tính chất hóa lý của axit amin 16
1.2.4. Vai trò của các axit amin 17
1.2.5. Axit amin trong nấm 22
1.3. Các phương pháp tách và xác định đồng thời axit amin 24
1.3.1. Các phương pháp sắc ký cổ điển 24
1.3.2. Phương pháp sắc ký khí 26
1.3.3. Phương pháp điện di mao quản 27
BẢNG KÍ HIỆU CÁC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt
Tên đầy đủ
Tên tiếng Anh
AOAC
Hiệp hội các nhà hoá học
phân tích chính thống
Association of Official
Analytical Chemists
AQC
Aminoquinolil- N-
hydroxysuccinimidyl
cacbamat
Aminoquinolil- N-
hydroxysuccinimidyl
carbamate
DM
Chất khô
dry matter
EAA
Axit amin thiết yếu
Essential amino acid
FMOC
9-florenylmetyl cloroformat
9-florenylmethyl cloroformate
GC
Sắc ký khí
Gas chromatography
RP-HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
pha ngược
Reversed phase - High
performance liquid
chromatography
TAA
Tổng axit amin
Total amino acid
TEA
Trietylamin
Triethylamine
THF
Tetrahydrofuran
Tetrahydrofuran
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Cấu trúc của 20 axit amin tiêu chuẩn 13
Bảng 1.2: Trị số ước lượng về lượng đòi hỏi các axit amin cần thiết (mg/kg
cân nặng/ngày) 21
Bảng 1.3: Đối chiếu các loại axit amin thiết yếu 21
Bảng 1.4: Thành phần axit amin thiết yếu trong một số loài nấm hoang
(g/100g protein thô) 22
Bảng 1.5: Hàm lượng axit amin tự do trong loài nấm Calvatia gigantea ở phía
Nam Thỗ Nhĩ Kỳ (mg/100 g ± SD) 23
Bảng 1.6: Thành phần axit amin thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn Quốc
(g/100g) 24
Bảng 1.7: Thành phần axit amin không thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn
Quốc (g/100g) 24
Hình 2.12: Quy trình phân tích axit amin thủy phân 37
Hình 2.13: Quy trình phân tích axit amin tự do 38
Hình 3.1: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl 41
Hình 3.2: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm
01 tại nồng độ HCl 5M 42
Hình 3.3: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm
01 tại nồng độ HCl 5,5M 42
Hình 3.4: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm
01 tại nồng độ HCl 6M 43
Hình 3.5: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm
01 tại nồng độ HCl 6,5M 43
Hình 3.6: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi các axit amin vào thời
gian thủy phân 45
Hình 3.7: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy
phân 16h 46
Hình 3.8: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy
phân 18h 46
Hình 3.9: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy
phân 20h 47
Hình 3.10: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian
thủy phân 24h 47
Hình 3.11: Đường chuẩn định lượng Asp 49
Hình 3.12: Đường chuẩn định lượng His 49
Hình 3.13: Đường chuẩn định lượng Thr . 49
Hình 3.14: Đường chuẩn định lượng Tyr 50
Hình 3.15: Đường chuẩn định lượng Ile 50
Hình 3.16: Đường chuẩn định lượng Glu 50
Hình 3.34: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm 608 63
Hình 3.35: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm 619 64
Hình 3.36: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm 621 64
Hình 3.37: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm HKG401 65
Hình 3.38: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm HKG406 65
Hình 3.39: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm 03 67
Hình 3.40: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm 04 68
Hình 3.41: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm 05 68
Hình 3.42: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm lỗ 72
Hình 3.43: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm 01 72
Hình 3.44: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm 02 73
Hình 3.45: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm 619 73
Hình 3.46: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm 621 73
Hình 3.47: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm HKG 401 74
Hình 3.48: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm HKG 406 74
1
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học cao trên thế
giới với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao và 3000 loài động vật có xương
sống đã được mô tả, trong đó có những loài đặc hữu. Cấu trúc địa chất độc
đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa đã góp phần tạo nên sự
đa dạng của hệ nấm Việt Nam, đây là nguồn có giá trị tài nguyên rất to lớn.
Nấm có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống con người, chúng là
Hiện nay, với sự phát triển của kỹ thuật phân tích, phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích đơn giản, nhanh, có độ
tin cậy cao. Trong những năm gần đây, HPLC được ứng dụng rộng rãi trong
phân tích, đánh giá chất lượng thực phẩm như axit amin, vitamin, kháng sinh,
phụ gia thực phẩm Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi lựa chọn đề tài :
“Nghiên cứu xác định hàm lượng các axit amin trong một số loài nấm lớn
ở vùng Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC”.
2. Mục đích nghiên cứu
Xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời 17 axit amin
trong các loại nấm khác nhau, cung cấp số liệu về thành phần dinh dưỡng
(axit amin) trong một số loại nấm được nghiên cứu.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu xác định các axit amin trên 2 loại nấm gồm: nấm nuôi cấy
và nấm tự nhiên được thu thập từ rừng Quốc gia Pù Mát, Phong Nha Kẻ Bàng
thuộc vùng Bắc Trung Bộ.
3
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Nấm
1.1.1. Định nghĩa về nấm lớn
Nấm theo nghĩa rộng (thuật ngữ khoa học) mà tiếng Anh là Fungi, là
nhóm sinh vật nằm trong giới Myceteae (Miles and Chang, 1997). Giới nấm
bao gồm nấm lớn và tất cả các nấm khác (như nấm men, nấm mốc, là các
vi nấm), được tách riêng do có các đặc điểm không giống cả động vật lẫn
thực vật.
Nấm theo nghĩa hẹp là nấm lớn với quả thể phân biệt rõ mà nó có thể
1.1.3.2. Protein và axit amin
Nấm là một nguồn tuyệt vời của protein. Giá trị dinh dưỡng của nấm
chủ yếu liên quan đến hàm lượng protein của chúng. Protein nấm được coi là
có chất lượng dinh dưỡng cao hơn so với protein thực vật [27]. Hàm lượng
protein của nấm không chỉ phụ thuộc vào yếu tố môi trường và các giai đoạn
trưởng thành của quả thể, mà còn phụ thuộc vào các loài khác nhau [19].
Hàm lượng protein trong 4 loài nấm ăn phổ biến đã được công bố như:
agaricus bisporus (nấm mỡ), lentinula edodes (nấm hương), pleurotus spp
(nấm sò), và volvariella volvacea (nấm rơm) đây là các loài nấm trồng thương
mại ở các nước khác nhau, chiếm từ 1,75-3,63% trọng lượng tươi của nấm
[17]. Hàm lượng protein trong nấm tự nhiên cao hơn 2 lần so với măng tây và
cải bắp, gấp 4 lần so với cam và 12 lần so táo. Với trọng lượng khô thì nấm
thường chứa 19-35% protein so sánh với 7,3% trong gạo, 13,2% trong lúa mì,
39,1% trong đậu tương và 25,2% trong sữa. Hàm lượng protein thô của nấm
chỉ thấp hơn so với hầu hết thịt các loài động vật nhưng cao hơn hầu hết các
loài thực phẩm khác bao gồm sữa, thứ được sản xuất từ động vật [31]. 5
Năm 2011, Bauer-pettrovska [14] đã xác định được hàm lượng protein
thô trung bình là 32,6% dm (dry matter: chất khô) của 47 loài nấm hoang ở
Hy lạp. Hàm lượng cao nhất là 48,8% dm và 51,2% dm có trong loài Calocybe
gambosa và Macrolepiota mastoidea và thấp nhất chỉ 16,2% dm là trong loài
C. Cibarius.
Hàm lượng protein trong chất khô, hầu như không thay đổi trong suốt
quá trình sấy khô nấm ở 40°C hoặc làm lạnh đến -20°C; còn khi đun sôi nấm
tươi gây ra sự giảm đáng kể.
Theo FAO/WHO, nấm được coi là giàu axit glutamic, axit aspartic và
arginine, tuy nhiên, các protein của chúng là thiếu methionine và cysteine. Các
axit amin hạn chế là leucine và lysine có trong L. edodes và P. ostreatus (nấm
Cacbohydrat tiêu hóa được tìm thấy trong nấm là mannitol (0,3-5,5 % dm)
[59], glucozơ (0,5-3,6% dm) [33] và glycogen (1,0-1,6% dm). Cacbohydrat
không tiêu hóa chiếm một phần lớn trong tổng cacbohydrat của nấm và các
hợp chất chính là oligosaccarit và polysaccarit không tinh bột như chitin, β -
glucan và mannan [61].
Chất xơ thô là nhóm cacbohydrat khó tiêu hóa. Nó làm giảm mức
cholesterol và lượng đường trong máu thấp hơn. Lượng chất xơ hòa tan và
không hòa tan trong nấm Boleztus tương ứng khoảng 4-9% và 22-30% dm
[42]. Một số nấm được tìm thấy là ít chất xơ thô, ví dụ như loài Craterellus
aureus và Sarcodon aspratus là 5% dm, trong khi đối với nhiều loài khác, lên
đến 40% dm như loài Lactarius volemus. Trong nấm thì hàm lượng chất xơ
không hòa tan cao hơn so với chất xơ hòa tan. β-glucan chiếm từ 4-13% tổng
lượng chất xơ và sự dao động này phụ thuộc vào các loài nấm khác nhau.
1.1.3.5. Vitamin
Nấm chứa nhiều vitamin chính bao gồm thiamin (vitamin B
1
), riboflavin
(vitamin B
2
), niacin (vitamin B
3
), tocopherol and vitamin D. Một số tác giả đã
xem nấm như một nguồn cung cấp vitamin dựa trên hàm lượng cao của 7
riboflavin (vitamin B2), niacin và của vitamin C, vitamin B
1
, vitamin D, β-
caroten (tiền vitamin A), vitamin E và vitamin B
8
các hợp chất này thì chúng có thể được phân loại là chất dẫn xuất của octan và
octen, tecpen, dẫn xuất của benzandehit, hợp chất của lưu huỳnh và những
chất khác [29].
Hương vị đặc trưng của nấm hoang có thể được phân thành: thành
phần không bay hơi (vị) và các thành phần dễ bay hơi (mùi). Các hợp chất dễ
bay hơi khác nhau như tecpen, các dẫn xuất của octan, 1- octen và 2 -octen,
rượu và este của chúng với các axit béo dễ bay hơi, xeton là những hợp chất
thơm chính trong nấm, hình thành nên hương vị rất đặc trưng của nấm. Vai trò
chính được gán cho" nấm rượu " 1- octen -3 -ol. Vị độc đáo của nấm được gán
cho axit amin tự do, 5
’
-nucleotit và đường hòa tan. Hàm lượng các axit amin
và 5
’
-nucleotit trong nấm cục lần lượt là 1,5-7,1 và 0,6-1,2 mg/g. Cả hai loại
thành phần này đều thấp hơn so với sợi nấm sau khi lên men [36].
1.1.3.8. Thành phần chất chống oxi hóa
Ngoài thành phần dinh dưỡng của nấm, một số loài nấm ăn rất giàu các
hợp chất có hoạt tính sinh học, có khả năng chống oxi hóa cao. Hàm lượng của
các hợp chất hoạt tính sinh học có thể thay đổi đáng kể trong nấm ăn được, vì
nồng độ của các chất bị ảnh hưởng bởi sự khác biệt trong chất nền, điều kiện
trồng trọt và điều kiện đậu quả, giai đoạn phát triển, tuổi của nấm tươi, điều
kiện bảo quản, chế biến…
Các hợp chất phenolic có thể là phần đóng góp quan trọng nhất cho khả
năng chống oxy hóa của nấm ăn [30]. Barros và các cộng sự đã công bố nồng
độ flavonoit (hợp chất phenolic) trong khoảng từ 0,47 đến 16,56 mg/g trong
nấm tự nhiên [11].
xơ vữa động mạch và ung thư do các thành phần hóa học cụ thể của nấm và
các hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau. Sản phẩm chữa bệnh quan trọng
có thể được phân lập từ nấm ăn được và nấm không ăn được. Ngày nay
khoảng 7000 loài nấm là ăn được ở mức độ khác nhau. Ngoài ra, 2000 loài đã
được đề xuất có đặc tính chữa bệnh [43]. 10
Ví dụ, hiện nay sự quan tâm lớn đó là β-glucan trong nấm vì những ảnh
hưởng tích cực của nó đến sức khỏe [51]. β-glucan trong nấm được coi là hợp
chất chức năng bởi vì chúng xuất hiện để điều chỉnh miễn dịch dịch thể và tế
bào, và có tác dụng có lợi trong việc đấu tranh chống lại nhiễm trùng, bên
cạnh đó nó cũng làm giảm cholesterol trong máu. Gần đây, chất này đã được
chứng minh có đặc tính kháng độc tế bào, kháng đột biến, là ứng cử viên đầy
hứa hẹn trong dược phẩm [40]. Nhiều loại nấm ăn chất lượng retin cao là yếu
tố làm chậm sự phát triển tế bào ung thư, gần đây Nhật Bản còn phát hiện
nhiều hợp chất trích từ nấm như glucan (thành phần cấu tạo tế bào vách của
nấm), chất leutinan (từ nấm đông cô) có khả năng ngăn chặn sự phát triển của
khối u - chống ung thư.
Ở Việt Nam, các loài nấm có thể dùng làm dược liệu có khoảng hơn 200
loài trong đó có rất nhiều loài là dược liệu quý như: linh chi một năm, linh chi
sò, linh chi nhiều năm, nấm lỗ phấn nhiều năm, nấm vân chi, nấm hương, nấm
kim châm, mộc nhĩ,…Những nghiên cứu bước đầu về các chất có hoạt tính
sinh học của một số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng rất giàu các chất có
trọng lượng phân tử lớn như polysaccarit, lectin…và các chất có trọng lượng
phân tử nhỏ như flavonoid, steroid…có tác dụng chống viêm, tăng cường đáp
ứng miễn dịch, hỗ trợ điều trị các bệnh hiểm nghèo như ưng thư, suy giảm
miễn dịch, tiết niệu, tim mạch…[5].
Nấm là nguồn thực phẩm
Nấm là thực phẩm phổ biến từ thời cổ đại không chỉ vì hương vị , mà
được ứng dụng trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường.
Nấm là bộ phận quan trọng trong công nghệ lên men. Các loài nấm men
như saccaromyces được dùng để oxi hóa đường thành etanol và khí cacbonic.
Quá trình này gọi là sự lên men rượu. Và ứng dụng trong làm rượu vang, bia
và bánh mỳ, phomat và một số các sản phẩm đậu nành…
Các loài nấm hoại sinh đóng vai trò quan trọng trong chu trình tuần
hoàn vật chất và năng lượng trong thiên nhiên. Nấm hoại sinh sử dụng hệ men 12
của chúng để phân giải các chất hữu cơ, các cành lá khô của thực vật thành
chất mùn, chất khoáng. Nấm có thể phân giải các chất hữu cơ phức tạp thành
các chất đơn giản, đặc biệt là các chất khó phân giải như cellulose, lignin
thành chất vô cơ; và có thể đồng hoá các chất đơn giản thành các chất phức
tạp. Do đó, nó là yếu tố quan trọng làm tăng độ phì nhiêu của đất.
Các nấm cộng sinh hình thành rễ nấm (mycorrhiza) cộng sinh với thực
vật có thể ứng dụng trong lâm nghiệp, đặc biệt trong việc trồng rừng, như
loài P.tinctorius hình thành rễ nấm cộng sinh chặt chẽ với rễ cây thông, giúp
cây tăng cường sự hấp thụ vận chuyển các yếu tố dinh dưỡng như: N, P, K,
Ca nên nó được ứng dụng trong các dự án tái sinh hoặc trồng mới các rừng
thông nhựa, bạch đàn ở các vùng đất nghèo dinh dưỡng hay đất cát.
1.2. Axit amin
1.2.1. Định nghĩa và cấu trúc
Axit amin (amino axit) là loại hợp chất hữu cơ tạp chức mà phân tử
chứa đồng thời nhóm amin (NH
2
) và nhóm cacboxyl (COOH). Trong hóa sinh,
thuật ngữ này còn dùng để chỉ alpha axit amin: những axit amin mà trong đó
nhóm amin và nhóm cacboxyl gắn vào cùng một nguyên tử cacbon, nên gọi là
α-cacbon.
H
H
H
H
R
C
O
O
_ 13
khoảng 1,8 - 2,8 do đó nó có độ axit mạnh hơn các monocacboxylic thông
thường khác. Tính bazơ của NH
2
ở nguyên tử C
α
cũng thay đổi, pk
a
vào
khoảng 8,8 - 10,6 tùy thuộc vào từng axit amin.
Trong tự nhiên axit amin tồn tại chính ở dạng α-axit amin, phần lớn các
axit amin có bốn phần tử khác nhau có khả năng thay thế ở vị trí C-2 (C
α
).
Nguyên tử C
α
không có trung tâm đối xứng nên các axit amin có đồng phân
quang học là L - và D - axit amin, chỉ có glycin là không có đồng phân quang
L-Phenylalanin
L-Prolin
L-Serin
L-Thrionin
L-Tryptophan
L-Tyrosin
L-Valin 14
1.2.2. Phân loại
Có hơn 100 axit amin đã được tìm thấy trong tự nhiên. Trong đó có 20
loại axit amin được mã hóa bởi mã di truyền chuẩn và được gọi là
proteinogenic hay axit amin tiêu chuẩn. Việc kết hợp các axit amin tiêu chuẩn
này tạo ra protein thiết yếu cho việc cấu thành cơ thể người. Axit amin là đơn
vị cấu trúc cơ bản xây dựng nên các khối protein.
Có nhiều cách để phân loại axit amin: các axit amin có thể phân loại
theo hai quan điểm: Quan điểm hoá học và quan điểm sinh vật học.
1.2.2.1. Quan điểm hoá học
Có thể phân loại dựa vào cấu trúc của mạch bên (nhóm R):
- Nhóm kị nước (Hydrophobic), gồm: glycin, alanin, valin, leucin,
isoleucin tất cả đều chứa mạch bên là ankyl (trừ glycin mạch bên là nguyên tử
hidro). Như vậy, mạch bên của chúng đều không phân cực và do đó kị nước.
tyrosine là phân cực. Tryptophan là không phân cực mặc dù có các nguyên tử
nitơ trong vòng của nó. Điều này là do kích thước lớn của hai vòng kết hợp.
Phenylalanin cũng không phân cực.
- Nhóm imido là axit amin cuối cùng, prolin, điểm khác thường là mạch
bên uốn lại để tạo thành một vòng bằng cách liên kết với nhóm amin. Trên
thực tế, phân tử này là một axit imodo hơn là một axit amin.
1.2.2.2. Quan điểm sinh vật học
Dựa trên cơ sở sự tăng trưởng hay sự cân bằng nitơ (là tổng hợp protein
trong toàn bộ cơ thể) các axit amin có truyền thống được phân loại là chất dinh
dưỡng thiết yếu hoặc không thiết yếu đối với người và động vật.
- Axit amin thiết yếu (essential amino acid -EAA) hay còn gọi là axit
amin không thể thay thế được là những axit amin có bộ khung cacbon không
được tổng hợp bởi các tế bào của người và động vật, do đó, phải được cung
cấp từ chế độ ăn uống. Trong số 20 axit amin tiêu chuẩn, có chín axit amin
Copyright: Tài liệu đại học ©