BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
NGUYỄN THỊ NGỌC MAI
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CÁC VITAMIN
B
2
, C VÀ E TRONG NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC
TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA PHÂN TÍCH
NGHỆ AN - 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
NGUYỄN THỊ NGỌC MAI
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CÁC VITAMIN B
2
, C
VÀ E TRONG NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG
BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO HPLC
Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH
Mã số: 60.14.01.18
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA PHÂN TÍCH
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. TRẦN ĐÌNH THẮNG
NGHỆ AN - 2014
LỜI CẢM ƠN
Luận văn được thực hiện tại phòng thí nghiệm - Trung tâm thực
hành thí nghiệm - Trường Đại Học.
Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Phó Giáo sư - Tiến sĩ Trần
Đình Thắng, người đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, tạo mọi
điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
1.2.2. Vitamin B
2
8
1.2.2.1. Lịch sử 8
1.2.2.2. Cấu trúc của vitamin B
2
8
1.2.2.3. Tính chất của vitamin B
2
9
1.2.2.4. Chức năng của vitamin B
2
11
1.2.2.5. Nhu cầu về vitamin B
2
11
1.2.2.6. Nguồn thực phẩm cung cấp vitamin B
2
12
1.2.3. Vitamin C 13
1.2.3.1. Lịch sử 13
1.2.3.2. Cấu trúc vitamin C 14
1.2.3.3. Tính chất của vitamin C 15
1.2.3.4. Chức năng của vitamin C 16
1.2.3.5. Nhu cầu về vitamin C 17
1.2.3.6. Nguồn thực phẩm cung cấp Vitamin C 18
1.2.4. Vitamin E 20
1.2.4.1. Lịch sử 20
1.2.4.2. Cấu trúc của vitamin E 20
1.2.4.3. Tính chất của vitamin E 22
2.3.2.2. Sơ đồ xử lý mẫu vitamin B
2
41
2.3.2.3. Cách tiến hành 41
2.3.2.4. Điều kiện sắc ký 42
2.3.3. Vitamin C 42
2.3.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin C cho phép đo HPLC 42
2.3.3.2. Sơ đồ xử lý mẫu vitamin C 43
2.3.3.3. Cách tiến hành 43
2.3.3.4. Điều kiện sắc ký 44
2.3.4. Vitamin E 44
2.3.4.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn vitamin E cho phép đo HPLC 44
2.3.4.2. Sơ đồ xử lý mẫu vitamin E 45
2.3.4.3. Cách tiến hành 45
2.3.4.4. Điều kiện sắc ký 46
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47
3.1. nghiên cứu định lượng vitamin B
2
47
3.1.1. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của vitamin B
2
47
3.1.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương
pháp phân tích 51
3.1.2.1. Giới hạn phát hiện LOD 51
3.1.2.2. Giới hạn định lượng LOQ 52
3.1.3. Xác định hàm lượng vitamin B
2
trong nấm 52
3.1.4. Đánh giá phương pháp 53
3.3.5. Các sắc đồ của vitamin E trong phép đo HPLC 76
KẾT LUẬN 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO 81
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng anh
AA Axit L - ascorbic Acid ascorbic
AOAC Hiệp hội các nhà phân tích
hóa học chính thống
Association of Official Analytical
Chemists
DHAA Axit dehydro - L - ascorbic Acid dehydro ascorbic
IAA Axit isoascorbic Acid isoascorbic
FAD Riboflavin -5’-
adenosydiphotphat
Flavin adenine dinucleotide
FLD Detector huỳnh quang Fluorescence detector
FMN Riboflavin-5’-photphat Flavin mononucleotide
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High performance liquid
chromatography
LOD Giới hạn phát hiện Limit of detection
LOQ Giới hạn định lượng Limit of quantitation
MW Trọng lượng phân tử Molecular weight
NP-HPLC Sắc ký hấp phụ pha thường Normal phase – High performance
liquid chromatography
RDA Khuyến nghị chế độ ăn
uống
Recommended dietary allowance
RP-HPLC Sắc ký hấp phụ pha đảo Reversed phase – High performance
liquid chromatography
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.14. Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên các mẫu
nấm 74
Bảng 3.15. Kết quả độ thu hồi đối với mẫu nấm lỗ 76
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1: Cấu trúc của riboflavin, FMN và FAD 9
Hình 1.2: Sản phẩm thoái quang của riboflavin trong môi trường có tính
bazơ và axit 10
Hình 1.3: Chất đồng phân lập thể của 2-hexenon-1,4 lactone 14
Hình 1.4: Cấu trúc hóa lập thể của tocol và tocotrienol 21
Hình 1.5: Pic sắc ký và thời gian lưu 27
Hình 1.6: Hệ thống máy sắc ký HPLC agilent 1100 30
Hình 2.1: Mẫu Nấm 01 40
Hình 2.2: Mẫu Nấm lỗ 40
Hình 2.3: Mẫu nấm TH04 40
Hình 2.4: Mẫu HKG 406 40
Hình 2.5: Mẫu nấm HKG 401 40
Hình 3.1: Sắc đồ chuẩn vitamin B
2
có nồng độ 0,1ppm 47
Hình 3.2: Sắc đồ chuẩn vitamin B
2
có nồng độ 0,2ppm 47
Hình 3.3: Sắc đồ chuẩn vitamin B
2
có nồng độ 0,5ppm 48
Hình 3.4: Sắc đồ chuẩn vitamin B
2
có nồng độ 10ppm 48
Hình 3.5: Sắ5c đồ chuẩn vitamin B
12
13
MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm trong vùng trung tâm Đông Nam Á, hàng năm có lượng
mưa và nhiệt độ trung bình tương đối cao. Với khí hậu nhiệt độ gió mùa nóng,
ẩm đã cho rừng Việt nam một hệ thực vật đa dạng và phong phú. Bắc trung bộ là
khu vực có hệ thực vật, động vật đa dạng chứa đựng nguồn lợi rất lớn về đa dạng
sinh học, trong đó có nguồn lợi nấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt
cho công nghệ sinh học nấm, tạo chế phẩm sinh học trong phòng trừ sâu hại cây
trồng và tạo sản phẩm có hoạt tính sinh học cao trong y – dược.
Trong ba thập kỷ qua, việc nghiên cứu về nấm đã được chứng minh các
kết quả có lợi của nó và đã được theo sau bởi sự phát triển nhanh chóng của
các doanh nghiệp sản xuất kinh doanh với thương mại trồng nấm [24], [28].
Nhiều loài nấm được ứng dụng trong công nghệ dược phẩm, là nguồn nguyên
liệu để điều chế các hoạt chất điều trị bệnh lao, gan, tiết niệu, tim mạch, ung
thư, AIDS.
Nấm có ý nghĩa quan trọng trong đời sống con người, chúng là nguồn
thực phẩm giàu chất dinh dưỡng, là nguồn thức ăn quý giá được nhân dân ưa
chuộng, chứa nhiều protein, các chất khoáng, vitamin (A, B, C, D, E…) và
một lượng lớn axit amin thiết yếu.
Vitamin là một nhóm các hợp chất hóa học khác nhau nhưng có một
điểm chung duy nhất là một lượng nhỏ chúng cần thiết cho các hoạt động
bình thường và duy trình sự trao đổi chất của cơ thể [29]. Vitamin là những
chất mà cơ thể con người không thể tổng hợp được. Phần lớn phải đưa từ
ngoài vào bằng con đường ăn, uống. Nhu cầu vitamin hàng ngày của cơ thể
rất ít, nhưng nếu thiếu sẽ gây ra những rối loạn trầm trọng, gây ra một số bệnh
và nếu kéo dài có thể chết. Vì thế việc bảo vệ vitamin trong quá trình chế biến
và bảo quản thực phẩm là rất cần thiết. Hiện tượng mất vitamin có thể xuất
hiện do các phản ứng hóa học gây mất hoạt tính vitamin, do bị tách ra hay rò
14
phương pháp.
- Định lượng các vitamin B
2
, C và Ebằng phương pháp HPLC.
- Xác định hiệu suất thu hồi.
15
NỘI DUNG
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về nấm
1.1.1. Giới thiệu về nấm
Thật ngữ “Nấm” đã được sử dụng với nhiều cách khác nhau tại những
thời điểm khác nhau và ở các nước khác nhau. Thuật ngữ nấm được sử dụng
rộng rãi bao trùm tất cả các loại nấm lớn, hoặc tất cả các loại nấm với thân và
mũ, hoặc tất cả nấm thịt lớn. Một cách sử dụng hạn chế hơn chỉ bao gồm
những loại nấm lớn đó là có thể ăn được hoặc có giá trị chữa bệnh. Nấm được
định nghĩa theo nghĩa rộng như sau: “Nấm là nấm lớn với quả thể phân biệt rõ
mà có thể là mọc trên mặt đất hoặc dưới đất và đủ lớn để thấy được bằng mắt
thường và được thu hoạch bằng tay” (Chang và Miles, 1992). Theo định
nghĩa này, nấm không cần phải là lớp nấm đảm, hoặc trên không, hoặc có thịt,
hoặc ăn được. Nấm có thể là lớp nấm túi hay nấm nang, mọc từ dưới lên, có
một kết cấu không nhiều thịt và không nhất thiết ăn được. Định nghĩa này
không phải là hoàn hảo nhưng có thể chấp nhận được, nhưng có thể dùng để
đánh giá số lượng nấm trên trái đất [26].
1.1.2. Phân loại nấm
Nấm là một giới riêng biệt khoảng 1,5 triệu loài, trong đó đã mô tả
được 69.000 loài, sống khắp nơi trên trái đất từ hốc tường đến thực vật, động
vật và con người: bao gồm nấm men, nấm mốc và các loài nấm lớn. Nấm là
các sinh vật có nhân thực (được xếp vào nhóm eukaryote) có vách tế bào bao
bọc bên ngoài thường chứa chitin polysaccharit, chất béo và protein. Nấm
không có chất diệp lục và do đó không thể thực hiện quá trình quang hợp. Do
2
) 1,5mg 3,7-4,7mg
Niacin 18,2mg 42-108mg
Photpho 450mg 708-1348mg
Sắt 9mg 15-17mg
Canxi 450mg 33-199mg
Đồng 2mg 12-22mg
1.1.4. Tầm quan trọng của nấm
17
Nấm rất đóng vai trò quan trọng đối với cuộc sống của con người bao
gồm y học, thực phẩm, nông nghiệp [1].
Nấm là một loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao. Nấm ăn có hàm
lượng protein rất cao chỉ sau cá, thịt. Tổng lượng axit amin của nấm tới 15 -
40% là các axit amin không thể thay thế, 25 - 35% là các axit amin tự do.
Lượng chất béo trong nấm rất thấp, khoảng 15 – 20% [10]. Đặc biệt trong
nấm rất giàu các khoáng chất, vitamin (A, B, C, D, E…). Nấm ăn không có
các độc tố nên có thể coi nấm ăn như một loại “rau sạch” và “thịt sạch” giàu
chất dinh dưỡng rất tốt cho sức khỏe. Nấm ăn còn là nguồn nguyên liệu để
chế biến các món ăn chay, ăn kiêng [1].
Một ý nghĩa hết sức quan trọng của nấm là làm thuốc chữa bệnh. Trong
số 14.000 đến 15.000 loài nấm trên thế giới, có khoảng 700 loài nấm có tính
chất y dược, nhưng dự kiến có khoảng 1800 loài nấm dược liệu có tiềm năng
[27]. Hầu hết tất cả nấm có chứa polysaccarit trong màng tế bào của chúng,
một số loài nấm được phát hiện có chứa polysaccarit đặc biệt có hiệu quả
trong việc làm chậm sự tiến triển của bệnh ung thư, một số bệnh khác và làm
giảm tác dụng phụ của việc điều trị hóa trị và xạ trị [26]. Nấm có hiệu quả
trong việc chống lại bệnh ung thư, giảm cholesterol, căng thẳng, mất ngủ, hen
suyễn, dị ứng và bệnh tiểu đường (1983) [25].
Nấm đóng vai trò quan trọng đối với nghề trồng rừng. Nấm giúp cho
thực vật lấy được nước và muối khoáng còn thực vật cung cấp cho nấm thức
. Đây là cách phân
loại đơn giản phản ánh hoạt tính sinh học của các vitamin, như độ hòa tan ảnh
hưởng đến phương thức hấp thu đường ruột của chúng và hấp thu bởi các tế
bào. Các đặc tính về độ tan cũng liên quan đến việc phân bố các vitamin trong
nhóm thực phẩm khác nhau và ảnh hưởng trực tiếp đến sử dụng phương pháp
phân tích [30].
c. Hoạt tính sinh học của vitamin
Thuật ngữ “hoạt tính sinh học” áp dụng cho thực phẩm có các loại
vitamin trong chế độ dinh dưỡng ở người, dùng để chỉ tỷ lệ số lượng vitamin
trải qua sự hấp thụ của đường ruột và đi vào cơ thể. Bao gồm cả sự vận
chuyển vitamin hấp thu đến các mô và tế bào. Cuối cùng các vitamin có thể
được chuyển hóa thành một dạng có thể thực hiện một số chức năng sinh hóa
hoặc sinh lý, chuyển hóa sang một dạng không có chức năng cho sự bài tiết và
giự trữ. Thành phần chính của hoạt tính sinh học và các yếu tố về tỷ lệ giới
19
hạn là sự hấp thụ. Hoạt tính sinh học tương đối thường được thể hiện dưới
dạng tỷ lệ phần trăm của các phản ứng thu được với chất chuẩn có hoạt tính
sinh học cao [30].
Trong sự hấp thu đường ruột, hoạt tính sinh học của một vitamin phụ
thuộc vào dạng hóa học và trạng thái vật lý trong đó vitamin tồn tại ở trong
thực phẩm. Các tính chất này có thể bị ảnh hưởng bởi những tác động trong
chế biến thực phẩm và nấu ăn, đặc biệt là trường hợp tiền vitamin A của
carotenoid, niacin, vitamin B
6
và folate [30].
Thành phần trong chế độ ăn có thể làm chậm hoặc tăng cường sự hấp
thụ của vitamin, do đó các thành phần trong chế độ ăn uống là một yếu tố
quan trọng trong hoạt tính sinh học [30].
d. Các yếu tố ảnh hưởng đến vitamin
Các yếu tố chính làm giảm lượng vitamin là quá trình oxi hóa, nhiệt
(C
17
H
20
N
4
O
6
, MW=376,4g/mol). Tên riboflavin có nguồn gốc từ nửa phân tử
(ribol) là dạng khử riboza của đường pentoza và nửa vòng isoalloxazin
(thường được gọi là vòng flavin) mà có màu vàng để oxi hóa các phân tử. Các
dạng khử xảy ra trong quá trình trao đổi chất với dạng oxi hóa thường không
màu. Khi thêm các nhóm photphat hoặc nhóm adennosy -5’-diphotphat ở các
vị trí bên ribityl sinh ra riboflavin-5
’
-photphat (FMN) và riboflavin-5
’
-
adenosydiphotphat (FAD) tương ứng. Cấu trúc của các hợp chất này được mô
tả trong hình 1.1. Các nhóm này có thể được loại bỏ khi thủy phân axit, được
sử dụng trong quy trình phân tích định lượng để giải phóng các dạng tự do
của tổng riboflavin [32].
Trong các tế bào sinh học, FAD ở mức độ nhỏ hơn FMN, FMN xuất
hiện hầu hết như là một coenzym thay thế một lượng lớn của enzyme flavin
(flavoprotein). Trọng lượng phân tử của FMN và FAD tương ứng là 514,4
g/mol và 865,6g/mol [30].
21
Hình 1.1: Cấu trúc của riboflavin, FMN và FAD
1.2.2.3. Tính chất của vitamin B
sáng nhìn thấy, tỷ lệ phá hủy ngày càng tăng khi tăng nhiệt độ và độ pH.
Sattar và đồng nghiệp, kết luận rằng khoảng bước sóng từ 350-520nm nói
chung gây hại cho riboflavin ở trong dung dịch nước, với bước sóng từ 415 -
455nm gây phá hủy lớn. Sản phẩm đối quang chính của vitamin B
2
trong môi
trường trung tính và axit là lumichrome (7,8 –dimetylalloxazine), trong khi
trong môi trường kiềm sản phẩm chính là lumiflavin (7,8-
trimetyllisoalloxazine). Hình 1.2. Cả hai sản phẩm đối quang không thể hiện
được hoạt tính của vitamin B
2
[30].
Hình 1.2: Sản phẩm đối quang của riboflavin trong môi trường có tính bazơ
và axit
Nếu tránh ánh sáng, dung dịch nước của riboflavin có pH nằm trong
khoảng từ 2 đến 5 là chịu nóng đến 120
o
C, với pH ˃ 7 thì vòng isoalloxazine
là nhanh chóng bị phá hủy ở nhiệt độ cao. Riboflavin ổn định khi được tối ưu
23
hóa tại pH 3,5-4,0. Riboflavin là ổn định đối với oxi và nhiều tác nhân oxy
hóa trong trường hợp không có ánh sáng [30].
1.2.2.4. Chức năng của vitamin B
2
Các coenzym, FMN và FAD là những vitamin hoạt động sinh lý. Chức
năng hóa sinh, hấp thu, chuyển hóa và sinh lý của riboflavin đang được xem xét.
Sinh hóa, FMN và FAD đóng vai trò như yếu tố đồng thời… như những
nhóm liên kết giả liên kết hóa trị hoặc không có hóa trị liên kết với coenzym
trong một loạt các phản ứng oxy hóa khử sinh học, chẳng hạn như [32]:
- Chuyển đổi glucozo thành axit gluconic và hydrogen peroxit được
2
, gan và thận cũng là nguồn thực phẩm phong phú có chứa vitamin
B
2
. Cám, lúa mì, trứng, thịt, sữa và pho mát là những nguồn thực phẩm quan
trọng trong khẩu phần ăn [30].
Bảng 1.2: Hàm lượng vitamin B
2
trong thực phẩm khác nhau [30]
Thực phẩm mg vitamin B
2
/ 100g khẩu phần ăn
Sữa bò, nguyên chất, tiệt trùng 0,23
Pho mát 0,39
Trứng gà, nguyên, sống 0,47
Bột mì, mì 0,09
Bột mì, trắng 0,03
Gạo lứt, sống 0,07
Thịt bò, nạc, sống 0,21
Thịt cừu, nạc, sống 0,20
Thịt lợn, nạc, sống 0,24
Thịt gà, sống 0,18
Gan cừu, chiên 5,65
Cá tuyết phi lê, sống 0,05
Khoai tây, vụ chính, già, sống 0,02
Đậu xanh, sấy khô, sống 0,24
Đậu đỏ, sấy khô, sống 0,19
Đậu hà lan, sống 0,02
Cải xanh, sống 0,06
Táo ăn, sống 0,02
chuột lang được phát triển vào năm 1917 để kiểm tra tác dụng của thuốc chữa
scobut từ thực phẩm. Axit ascorbic đã được tách ra từ các nguồn thực phẩm
trong tự nhiên, được thể hiện qua các yếu tố và cấu trúc đặc trưng chống lại
bệnh scobut bởi nhóm Szent-Gyorgi, Haworth và King đầu những năm 1930.
Szent-Goyrgi và Haworth đã được trao giải Nobel cho nghiên cứu axit
ascorbic của họ vào năm 1937 [39].
1.2.3.2. Cấu trúc của vitamin C
Thuật ngữ vitamin C được sử dụng mô tả chung cho tất cả các hợp chất
có tính đặc trưng về hoạt độ sinh học của axit ascorbic. Thuật ngữ L-ascorbic
và axit ascorbic có thể được sử dụng thay thế cho nhau. Định danh theo hệ
thống hóa học của IUPAC là 2-oxo-L-threo-hexano-1,4-lactone-2,3-enediol
Copyright: Tài liệu đại học ©