BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
VÕ QUỐC OAI
1.1. NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
VITAMIN D TRONG NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60.44.01.18
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. Mai Thị Thanh Huyền
2
Vinh, 2014
Lêi c¶m ¬n
Luận văn được thực hiện tại phòng thí nghiệm chuyên đề
Hóa phân tích - Khoa Hóa học - trường Đại học Vinh.
Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới
Trường Đại học Vinh, phòng đào tạo sau đại học, Trung Tâm
Thực Hành thí nghiệm trường Đại học Vinh, trường THPT
Mai Thúc Loan và các đồng nghiệp, nhóm cộng tác nghiên
cứu - phân tích vitamin D trong nấm.
Đặc biệt tác giả gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới
TS. Mai Thị Thanh Huyền đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ
với những chỉ dẫn khoa học quý giá trong suốt quá trình triển
khai, nghiên cứu và hoàn thành đề tài.
Tác giả rất mong nhận được sự đóng góp, phê bình của
quý thầy cô, các nhà khoa học, đọc giả và các bạn đồng nghiệp.
3
MỤC LỤC
VÕ QUỐC OAI 1
Vinh, 2014 2
Hệ thống các kí hiệu viết tắt 4

MTBE : Methyl-tert-butyl ether.
PFP : Pentafluorophenyl-propyl
RIA : phân tích miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay)
SPE : chiết pha rắn (Solid Phase Extraction)
UPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao
UV : Tia tử ngoại
DAD : Đầu dò mảng diot
RMSE : Độ lệch khởi động (root mean square error).
5
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài.
Vitamin D hay còn gọi là vitamin mặt trời là một loại vitamin khá đặc biệt
so với những loại khác. Vitamin D có vai trò quan trọng với đời sống của con
người, như nó đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, hoàn thiện, duy trì sự
ổn định của xương, răng, nó tham gia vào điều hòa chức năng của một số gen,
ngoài ra còn tham gia một số chức năng như: bài tiết của insulin, hormon cận
giáp, hệ miễn dịch, phát triển hệ sinh sản và da ở nữ giới. Một số nghiên cứu
mới cho thấy thiếu vitamin D, thai phụ có thể sinh con nhẹ cân, cùng sự tăng
trưởng chậm của trẻ chào đời đủ tháng [14],[22]. Tình trạng thiếu vitamin D
trên thế giới cũng như các nước nhiệt đới rất nghiêm trọng [24]. Theo một số
nghiên cứu tình hình thiếu vitamin D trên thế giới là 40-50%, ở Thái lan và
Malayxia 50%, Nhật và Hàn Quốc 80-90%, nước bắc Âu và bắc Mỹ khoảng
50-70% và 63% ở phụ nữ châu Á. Ở Việt Nam, theo một số nghiên cứu mới
nhất về tình trạng thiếu dinh dưỡng của học sinh tiểu học thì hơn 50% học sinh
tiểu học thiếu hụt vitamin D.
Để nhận đủ vitamin D thì ngoài việc cho cơ thể tiếp xúc với ánh nắng có
lợi cho cơ thể thường xuyên thì cần thiết phải bổ sung thêm nguồn vitamin D
từ nguồn thực phẩm ăn uống hàng ngày. Nấm là là một trong những nguồn
thực phẩm giàu vitamin D
2

2
bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao HPLC, từ đó xác định hàm lượng của chúng trong một số mẫu
nấm.
3. Mục tiêu nghiên cứu
+ Thiết lập được phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác, độ hội tụ,
độ nhạy cao, xác định được LOD và LOQ của phương pháp.
+ Áp dụng phương pháp để khảo sát, xác định hàm lượng vitamin D
2
trong
một số loại nấm trước và sau khi chiếu xạ bằng tia UV.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Các mẫu nấm được thu thập ở các chợ trên địa bàn thành phố Vinh, Hà
Tĩnh và một số loại nấm tự nhiên ở vườn quốc gia Pù Mát.
7
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.2. Vitamin D.
1.2.1. Giới thiệu, cấu tạo, phân loại và tên gọi
Vitamin là nhóm chất cần thiết cho hoạt động sống của bất kỳ cơ thể nào
và chúng có khả năng ở nồng độ thấp hoàn thành chức năng xúc tác ở cơ thể
sinh vật. Vitamin D được xếp trong nhóm vitamin hòa tan trong dầu béo cùng
với vitamin A, vitamin E, vitamin K. Vitamin D được phát hiện năm 1922
được phân lập năm 1932 tìm ra cấu trúc năm 1936 đến năm 1959 được tổng
hợp nhân tạo [11].
Thuật ngữ vitamin D dùng để chỉ một nhóm các hợp chất sterol có cấu
trúc tương tự nhau, có hoạt tính phòng ngừa hoặc điều trị còi xương nhờ làm
tăng khả năng hấp thu canxi và photphat ở đường ruột. Các hợp chất đó bao
gồm: vitamin D
2
(ergocalciferol), vitamin D

xương và răng, đồng thời cũng không thể thiếu để tham gia vào quá trình đông
máu. Trẻ em khi thiếu canxi sẽ chậm lớn, lùn, còi xương, xương biến dạng,
răng không đều, răng dị hình, chất lượng răng kém và bị sâu [15], [21]. Người
lớn thiếu vitamin D có thể dẫn đến bệnh loãng xương [21].
9
Một lượng nhỏ vitamin D mỗi ngày làm giảm nguy cơ mắc bệnh cao
huyết áp, vitamin D giúp làm tăng khả năng miễn dịch, ngừa một số bệnh ung
thư phổ biến, làm chậm quá trình phát triển ung thư đặc biệt là ung thư gan,
ung thư đại trực tràng [10], [12], [19].
Thiếu vitamin D trong thai kì có thể sinh con nhẹ cân, đặc biệt nếu thiếu
vitamin D trong 3 tháng đầu thai kì, con sinh ra bị hạn chế tăng trưởng gấp đôi,
sự thiếu vitamin D trong thai kì gây ra những tổn thương não không thể phục
hồi [30]. Trẻ em nếu không được cung cấp đủ vitamin D sẽ ảnh hưởng đến sự
phát triển của xương, do chất xương và sụn không được vôi hóa đầy đủ, sụn
phát triển không bình thường, làm xương biến dạng [30]. Các triệu chứng cho
biết trẻ thiếu vitamin D: Thần kinh bị kích thích (quấy khóc, ngủ không yên
giấc, hay giật mình, nhất là trẻ dưới 3 tháng), hay đổ mồ hôi trộm cả lúc trời
lạnh, co giật khi sốt cao, có thể có cơn khó thở với tiếng thở rít. Nặng hơn nữa,
trẻ sẽ yếu cơ và có sự biến đổi ở xương đầu, lồng ngực, tay, chân, cơ - dây
chằng và cột sống . Nếu thiếu vitamin D trẻ em sẽ bị còi xương; trẻ bị còi
xương sẽ ảnh hưởng đến phát triển chiều cao và tầm vóc của trẻ sau này [10],
[12], [15], [21].
Vitamin D cũng có ảnh hưởng đến nồng độ serotonin trong não, gây ảnh
hưởng đến tâm trạng con người. Serotonin còn có tên gọi là hoóc môn hạnh
phúc, suy giảm serotonin khiến tâm trạng buồn chán hoặc dễ cáu giận, không
thể kiểm soát được cơn bốc đồng, do đó thiếu vitamin D kéo dài dễ dẫn tới
trầm cảm[40]. Do ít tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, chúng ta dễ bị thiếu hụt
vitamin quan trọng này, dù có ăn chế độ lành mạnh và tập thể dục đều đặn
[11] , [12].
10

da giúp cung cấp 80-85% nhu cầu vitamin D của cơ thể. Dưới tác dụng của tia
cực tím các tiền chất vitamin D có ở tuyến bã và lớp Malpighi của biểu bì sẽ
được chuyển thành vitamin D. Nếu được phơi nắng đầy đủ, sau 3 giờ, 1cm
2
da
có thể sản xuất ra 18UI vitamin D
3
[11], [16], [18], [23], [24].
Ví dụ khi người có làn da được tắm nắng vào mùa hè ( toàn thân, liều tối
thiểu UVB), mỗi cơ thể sản xuất ~ 20.000 IU vitamin D trong <30 phút [25].
Để đạt được điều này tương đương với con người sẽ phải uống 200 ly sữa (100
IU/8 oz thủy tinh) hoặc dùng 50 viên vitamin tổng hợp tiêu chuẩn (400
IU/viên) trong một lần.
Nguồn cung cấp tự nhiên vitamin D khác là qua thức ăn. vitamin D có
trong nguồn thực phẩm từ động vật (D
3
)và thực vật (D
2
), có nhiều trong các
thực phẩm như dầu gan cá thu, dầu dừa, lòng đỏ trứng, sữa động vật [24].
Dữ liệu về thành phần thực phẩm hiện nay cho thấy nấm là một nguồn
cung cấp vitamin D tốt ngoài các nguồn từ động vật như trứng, sữa, thịt, cá
Vitanmin D được bảo toàn tốt trong quá trình nấu ăn [29].
Các báo cáo về nấm của một số nước trên thế giới cho thấy hàm lượng
vitamin D trong nấm tự nhiên ở trong khoảng 2 – 40 µg/100g, có thể đáp ứng
đủ nhu cầu vitamin D trong một ngày của cơ thể người và thay thế nguồn
vitamin D từ các sản phẩm từ động vật, đặc biệt đối với người ăn chay [39].
Khi bổ sung vitamin D cho cơ thể cũng nên phối hợp bổ sung canxi cho
cơ thể để tăng hiệu quả sử dụng với cơ thể [10], [12], [31].
12

Chuột còi xương được cho ăn bằng thức ăn có chứa một lượng khác nhau
của vitamin D đã được thiết lập theo các định mức tiêu chuẩn. Sau bảy ngày,
xương của những con chuột được xử lý bằng dung dịch nitrat bạc. Lượng canxi
mới được chuyển vào xương được biểu hiện thành vết tối trên ảnh chụp. Thang
tiêu chuẩn được thiết lập bằng cách xây dựng mối liên hệ giữa các vùng tối trên
xương với lượng vitamin D trong chế độ ăn uống (cho gà con mới sinh thức ăn
bổ sung có chứa hàm lượng khác nhau của vitamin D). Hàm lượng vitamin D
trong mẫu sau đó được xác định bằng cách so sánh với khu vực mờ tối của chất
chuẩn, từ đó xác định tỷ lệ tro xương sau ba tuần với mỗi chế độ ăn uống.
Các thử nghiệm sinh học hấp thu canxi ở ruột khác bao gồm trên cơ thể và
trong ống nghiệm cũng đã được nghiên cứu bằng cách điều tra khả năng của
các hợp chất thử nghiệm để kích thích sự hấp thu canxi ở ruột non. Trong các
thử nghiệm,
45
Ca
2 +
được sử dụng để gián tiếp định lượng hàm lượng vitamin D.
14
Các sinh trắc nghiệm có thể phát hiện vitamin D ở nồng độ rất thấp. Ví
dụ, kiểm tra trên dòng chuột có thể phát hiện hàm lượng thấp tới 12 ng vitamin
D. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp là không phân biệt giữa các dạng
khác nhau của vitamin D, đòi hỏi thời gian chuẩn bị lâu dài, độ tin cậy thấp so
với các phương pháp khác.
1.3.2. Phương pháp quang phổ.
Phổ hồng ngoại đã được sử dụng để phân tích định lượng của vitamin D.
Trong các pha rắn, vitamin D
2
có thể được phân biệt với vitamin D
3
dựa vào

hóa học (ECLIA), phương pháp RIA. Quy trình thực hiện như sau: Bước thứ
nhất, 25(OH)D được tách ra từ dạng liên kết với protein và gắn vào kháng thể
pha rắn đặc biệt, sau đó thêm vitamin D-isoluminol đánh dấu, thành phần
không liên kết được lấy ra bằng cách rửa sau đó thêm thuốc thử để xảy ra phản
ứng quang hóa. Tín hiệu ánh sáng được phát hiện có sự tỉ lệ nghịch với nồng
độ 25(OH)D.
Phòng thí nghiệm Abbott cung cấp một cách hoàn thiện phương pháp trên
nền tảng phân tích miễn dịch tự động xác định hàm lượng 25(OH)D – phương
pháp miễn dịch quang hoá học vi phân tử (CMIA). Phương pháp này được
FDA chấp thuận năm 2011.
Công ty Immuno Diagnostics cung cấp một phương pháp tự động phân
tích miễn dịch CMIA, IDS-ISYS, để định lượng hàm lượng tổng 25(OH)D và
dạng hydroxyl chuyển hóa khác của vitamin D trong huyết thanh hoặc huyết
tương người. Báo cáo cho thấy có mối quan hệ đặc biệt giữa 25(OH)D
3
và D
2
và độ nhạy của phương pháp là 5,5 ng/ml.
16
Phương pháp quang hóa (ECL) được cấp bằng sáng chế bởi F. Hoffman-
La Roche AG (Basel, Switzerland) được chào hàng thương mại phân tích
vitamin D. Test có sẵn để sử dụng cho tất cả các nền tảng phân tích mô đun
Roche cobas, nó đã được hiệu đính bởi FDA trong tháng 7/2012.
Phương pháp miễn dịch enzyme cũng được sử dụng để phân tích vitamin
D. Vitamin D cho liên kết với protein đồng nhất, từ đó đo lường hàm lượng
thực tổng cộng 25(OH)D. Các tổ hợp liên kết protein - vitamin D có thể nhận
diện vitamin D
2
và D
3

UV ở 265 nm. Giới hạn phát hiện là 3 ng/ml trong khi khoảng tuyến tính tiêu
chuẩn là 25-100 ng/ml. Thời gian lưu cho 25(OH)D là 4,1 phút. Với phương
pháp ECLIA sử dụng máy phân tích xét nghiệm miễn dịch Roche (Roche
Modular E170), bộ kit thương mại dựa trên phương pháp ECLIA từ Roche .
Giới hạn phát hiện dưới của thử nghiệm là 4,0 ng/ml, giới hạn phát hiện trên là
100 ng/mL và độ chính xác của thử nghiệm là CV = 9,9% . Hàm lượng trung
bình 25(OH)D với HPLC so với RIA là 50,1 nmol/L ( khoảng tuyến tính là
17,7-199,4 nmol/L) và 51,1nmol/L (12,5-187,2nmol/L), trong khi nồng độ
25(OH)D trung bình với RIA so với ECLIA là 32,4 nmol/L (9,98-199,7
18
nmol/L) và 29,9 nmol/L (4,9-214,6 nmol/L). Dữ liệu so sánh cho HPLC so với
RIA cho thấy RIA = -1,13 +1,01 (HPLC) (RMSE = 11,2 nmol/L) và cho RIA
so với ECLIA tiết lộ, ECLIA = 3,21 +0,9 (RIA) (RMSE = 9.6 nmol/L). Kết quả
cho thấy có mối tương quan có thể chấp nhận được giữa HPLC và RIA cũng
như RIA và ECLIA trong định lượng 25(OH)D [45].
1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được sử dụng rộng rãi
để xác định các vitamin tan trong chất béo từ giữa những năm 1970 và đã được
thông qua như là phương pháp chính thức nhờ khả năng phát hiện, tính chọn
lọc cao [16].Thiết bị sử dụng để phân tích vitamin D trong thực phẩm là máy
sắc ký lỏng cao áp sử dung hệ thống tách sắc ký ghép nối các đầu dò UV, đầu
dò mảng đi ốt (DAD) và đầu dò khối phổ (MS).
Hiệp hội hóa học phân tích tiêu chuẩn (AOAC) đã xác nhận các phương
pháp hóa học sau để phân tích vitamin D trong thực phẩm.
Phương pháp AOAC 980.26: vitamin D trong các chế phẩm vitamin tổng
hợp.
Phương pháp AOAC 981.17: vitamin D trong sữa tăng cường và sữa bột.
Phương pháp AOAC 982.29: vitamin D trong thực phẩm, các loại bột hỗn
hợp và thức ăn chăn nuôi.
Phương pháp AOAC 992.26: vitamin D

mà không bao gồm dạng chuyển hóa 25(OH)D. Một phương pháp HPLC
để xác định 25(OH)D trong thịt được mô tả bởi Koshy and VanDerSlik (1977),
tuy nhiên, không đồng thời xác định D
3
[33]. Một phương pháp HPLC hai
chiều đã được sử dụng để xác định đồng thời vitamin D
3
và 25(OH)D
3
[27].
Tuy nhiên phương pháp cho thấy giới hạn phát hiện khá cao, khoảng 0,2-1,0
mg/100g.
20
Tác giả Anders Staffas và cộng sự đã nghiên cứu xác định vitamin D
3
trong sữa bột, sữa công thức, dầu ăn, margarine và dầu cá bằng phương pháp
HPLC [13]. Phương pháp phân tích dựa trên phương pháp đề xuất của AOAC
2002.05. Mẫu phân tích được thêm chất nội chuẩn là vitamin D
2
sau đó xà
phòng hóa bằng KOH, etanol có bổ sung thêm chất chống oxi hóa butylated
hydroxytoluene (BHT) chiết mẫu thu được bằng cyclohexan và n-heptan (1:1)
và làm sạch bằng cột silica. Dịch chiết được đem đo mẫu ở máy HPLC đầu dò
UV ở bước sóng 265 nm, cột cho phân tích định lượng LC-C18, 250x 4,6 mm,
d
p
= 5μm (Vydac 201 TP 54, hoặc tương đương) với cột bảo vệ C18, 4.0x 4,0
mm, d
p
= 5 μm (LiChroCART 4-4, hoặc tương đương). Pha động 1: 0.5%

cũng như là đối với 25(OH)D
3.
Nghiên cứu này là một
phương pháp phân tích có thể được sử dụng cho việc đánh giá các loại vitamin
D khác nhau, đóng góp thông tin mới vào bảng thành phần thực phẩm.
Markus Herrmann và cộng sự đã phát triển một phương pháp phân tích
sắc ký lỏng khối phổ song song (LC-MS) [37]. Thiết bị gồm hệ thống khối phổ
API 5000 kết hợp với một nguồn bức xạ ion hóa, tách sắc ký sử dụng cột sắc
ký pha đảo Supelco C8 (Supelcosil LC-8, 3.3cm x 3mm, kích thước hạt 3 μ m)
cột bảo vệ C8 (4 ×2,0 mm) để định lượng 25(OH)D
2
và 25(OH) D
3
trong huyết
thanh [37]. Phương pháp mới này được đánh giá kết quả cùng với hai phương
pháp sử dụng rộng rãi để xét nghiệm miễn dịch RIAvà ECLIA. Kết quả cho
thấy phương pháp LC-MS định lượng chính xác 25(OH)D phù hợp với phép
phân tích bằng RIA còn đối với phương pháp ECLIA thì cho thấy có sự sai
lệch.
22
Một phương pháp định lượng đơn giản vitamin D được Lone Hymoller và
cộng sự công bố năm 2011 [35]. Mẫu huyết tương hoặc huyết sau khi xà phòng
hóa và chiết xuất được tách bằng cột sắc ký lỏng pha đảo C30 (250mm × 4.6
mm ID) với cỡ hạt 5,0 μm và cột bảo vệ C30 (10 mm × 4.0 mm ID) với cỡ hạt
5,0 μm. Nhiệt độ cho cả hai cột là 50
0
C, thể tích tiêm mẫu là 50 μL.Chương
trình gradient rửa giải được thực hiện tại tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút với
MeOH (85%) và EtOH trong 55 phút. Trong 12 phút đầu tiên 5% EtOH được
bơm qua cột và sau đó là tỉ lệ EtOH được tăng lên đến 40% trong ba phút.

độ phòng và chuyển vào phễu tách. Hỗn hợp này lần đầu tiên được chiết xuất
với 15ml nước de-ion, sau đó là 15 ml etanol và sau đó chiết ba lần với n-
pentan có thể tích lần lượt là 50, 50 và 20 ml. Toàn bộ phần hữu cơ được rửa
ba lần với 50 ml dung dịch KOH 3% trong etanol 5% và sau đó rửa lần cuối
với nước de-ion cho đến khi trung hòa. Các phần dịch chiết hữu cơ được
chuyển vào bình đáy tròn, cô quay ở 40°C, và ngay lập tức tái hòa tan trong 5
ml etanol. Sau đó mẫu được đi qua một bộ lọc 0,45 μm. 20 μl của mẫu lọc
được tiêm vào hệ thống HPLC đầu dò UV và tách rửa nhờ cột C18 pha đảo với
pha động là ACN:MeOH (5:25) và tốc độ dòng chảy 2,3 ml/phút. Quá trình
chuyển đổi của ergosterol thành vitamin D
2
dưới UVA, UVB và UVC đã có
sự khác biệt đáng kể. Hàm lượng vitamin D
2
cao nhất (184 ± 5.71 μg/g DM)
được quan sát thấy trong nấm Sò chiếu tia UVB ở nhiệt độ 35
0
C và độ ẩm
khoảng 80%. Mặt khác, theo cùng điều kiện chiếu xạ, nồng độ vitamin D
2
thấp
nhất (22,9 ± 2,68 μg/g DM) đã được quan sát thấy trong nấm Mỡ. Ngoài ra
cường độ của bức xạ tia cực tím và liều chiếu xạ được áp dụng, cũng góp phần
vào sự chuyển đổi của ergosterol trong nấm thành vitamin D
2
. Ngay cả trong
điều kiện bình thường, 5 g nấm đông cô tươi được chiếu trong 15 phút với tia
24
UVA, hoặc UVB là thừa đủ để có được các liều cung cấp được đề nghị của
vitamin D cho người lớn (10 μg/ngày) [46].

trong sắc ký đồ HPLC-UV của nấm ăn [32]. Các
sterol được xác định bằng sắc ký khí, phát hiện bằng phương pháp ion hóa
ngọn lửa sau khi xà phòng hóa để thực hiện chiết lipid tổng, dùng sắc ký khí
khối phổ (GC-MS) để kiểm tra định tính lại thành phần. vitamin D
4
đã được
định lượng bằng HPLC với đầu dò UV sử dụng vitamin D
3
làm chất nội chuẩn.
Nấm portabella, nấm nút màu trắng, nấm crimini, nấm kim châm (Enoki), nấm
Đông cô, nấm maitake, nấm hàu, nấm morel, nấm mào gà (Chanterelle), được
chiếu xạ UV và phân tích. Phân tích 4 thành phần vitamin D của mỗi mẫu trong
tổng số 71 mẫu từ các nhà cung cấp bán lẻ và nhà sản xuất của Mỹ cho thấy
vitamin D
4
có mặt (>0.1 μg/100 g) trong tổng số 18 mẫu tổng hợp và trong ít
nhất một mẫu của từng loại nấm trừ nấm nút màu trắng. Mức cao nhất trong
các mẫu sau khi tiếp xúc với tia UV là nấm portabella, nấm maitake (0,2-7,0
và 22,5-35,4 mg/100 g). Trong một mẫu nấm sò hàm lượng vitamin D4 đạt
hơn gấp đôi so với D
2
(6,29 so với 2,59 mg/100 g). vitamin D
4
vượt quá 2
mg/100 g trong nấm morel và nấm mào gà, mẫu có chứa D
4
nhưng không phát
hiện được trong hai mẫu nấm morel. Tiền vitamin D
4
là 22,23-