Viện Dinh Dỡng
Trung tâm kiểm nghiệm vsATTP
***************** Báo cáo kết quả nghiên cứu
Chuẩn hóa phơng pháp xác định hàm
lợng vitamin D (D
2
và D
3
) trong thực
phẩm bằng phơng pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC)

Chủ nhiệm đề tài : Ks. Đoàn Thị Hờng


hiệu năng cao (HPLC)

Chủ nhiệm đề tài: Ks. Đoàn Thị Hờng
Các cán bộ tham gia: C n. Nguyễn Thu Hằng
Cơ quan chủ trì: Trung tâm kiểm nghiệm VSATTP
Cơ quan chủ quản: Viện dinh dỡng
Kinh phí: 20 triệu đồng (Nguồn NNS)

Hà nôi, 2007

Mục lục

TT Nội dung Trang
1
Danh mục các chữ viết tắt
2
Danh mục các bảng
3

Phần 6: Quy trình phân tích xác định hàm lợng vitamin D
trong thực phẩm bằng phơng pháp HPLC
41
10
Phần 7: Tài liệu tham khảo
45
11
Phần phụ lục: Các sắc đồ của dung dịch chuẩn vitamin D
2

và D
3
xây dựng khoảng tuyến tính các chữ viết tắt

TT
Các chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt
1 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
2 DAD Detector mảng diôt
3 UV-VIS Quang phổ tử ngoại - khả kiến
4 RDA Nhu cầu ăn khuyến cáo
5 TCVN Tiêu chuẩn Việt nam
6 AOAC Hiệp hội phân tích hoá học

MeOH =75:25, tốc độ dòng 1ml/phút.
Bảng 3
Nhận xét các sắc đồ của hai chất chuẩn đối với cột Inertsil
ODS 3
detector DAD bớc sóng 265nm, Pha động ACN : H2O =75:25,
tốc độ dòng 1ml/phút
Bảng 4
Nhận xét kết quả chạy sắc ký hai chuẩn trên cột Inertsil ODS 3
pha động ACN : MeOH = 50: 50, detector DAD bớc sóng
265nm, tốc độ dòng 1ml/phút.
Bảng 5
Thời gian lu của hai chất chuẩn tơng ứng với pha động khác
nhau tốc độ 1ml/ phút, cột Inertsil ODS 3, detector DAD 265nm
Bảng 6
Thời gian lu của hai chất ứng với tốc độ dòng khác nhau trên hệ
pha động MeOH: THF: H2O = 93:2:5, detector DAD 265nm,
cột Inertsil ODS 3
Bảng 7
Tổng kết điều kiện chạy HPLC phân tích vitamin D
Bảng 8
Tơng quan giữa diện tích pic và nồng độ chuẩn của vitamin D
2

Bảng 9
Tơng quan giữa diện tích và nồng độ chuẩn vitamin D
3

Bảng 10
Xác định hàm lợng vitamin D
2

vật liệu chuẩn
Bảng 20
Tổng hợp các thông số thẩm định

Danh mục các hình
TT
Nội dung các hình

Phần tổng quan
Hình 1 Công thức hoá học, công thức cấu tạo của vitamin D
2
và D
3

Hình 2 Sơ đồ chuyển hoá của vitamin D trong cơ thể

Phần mục tiêu, đối tợng và phơng pháp
Hình 3 Mô tả quá trình chạy sắc ký
Hình 4 Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC
Hình 5 Đồ thị phụ thuộc diện tích hoặc chiều cao pic với nồng độ

Phần kết quả nghiên cứu

* Khảo sát điều kiện chạy
Hình 6 Sắc đồ chuẩn vitamin D
2
nồng độ 0,04ppm, cột Waters, detector

3
vµ D
2
, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 14 S¾c ®å chuÈn vitamin D
2
, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc
sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50: 50, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 15 S¾c ®å chuÈn vitamin D
3
, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc
sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50: 50, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 16 S¾c ®å hçn hîp vitamin D
3
vµ D
2
, cét Inertsil ODS 3, detector DAD
b−íc sãng 265nm, pha ®éng
ACN: MeOH = 50:50, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 17 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D
3
vµ D
2
, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10, tèc ®é
1ml/ phót
H×nh 18 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D
3
vµ D

S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D
3
vµ D
2
, cét Inertsil ODS 3, detector DAD
b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H
2
O = 93:2:5 tèc ®é dßng 1,5
ml/ phót.
Hình 23 Sắc đồ vitamin D
2
, cột Inertsil ODS 3, detector DAD bớc sóng
265nm, pha động
MeOH: THF: H
2
O = 92:3:5, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút
Hình 24 Sắc đồ vitamin D
3
, cột Inertsil ODS 3, detector DAD bớc sóng
265nm, pha động
MeOH: THF: H
2
O = 92:3:5, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút

* Xác định khoảng tuyến tính
Hình 25 Đờng chuẩn vitamin D
2

Hình 26 Đờng chuẩn vitamin D
3

nồng độ 0,165ppm
Hình 36 Sắc đồ chuẩn vitamin D
2
nồng độ 0,33ppm
Hình 37 Sắc đồ chuẩn vitamin D
3
nồng độ 0,0068ppm
Hình 38 Sắc đồ chuẩn vitamin D
3
nồng độ 0,068ppm
Hình 39 Sắc đồ chuẩn vitamin D
3
nồng độ 0,137ppm
Hình 40 Sắc đồ chuẩn vitamin D
3
nồng độ 0,274ppm
Hình 41 Sắc đồ chuẩn vitamin D
3
nồng độ 0,392ppm
Hình 42 Sắc đồ chuẩn vitamin D
3
nồng độ 0,5ppm

Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 1/46
Phần 1: Mở đầu

Để tồn tại, phát triển và cải thiện nòi giống, cơ thể chúng ta luôn cần
đợc cung cấp đủ các chất dinh dỡng, nguồn cung cấp các chất này có
nhiều trong thực phẩm ăn vào hàng ngày. Các chất dinh dỡng chính là các

tham gia trực tiếp của vitamin [14]. Nguồn cung cấp vitamin chủ yếu là từ
thức ăn. Khi thiếu vitamin cơ thể sẽ mắc phải một số bệnh lý, nh thiếu
vitamin A dễ dẫn tới bệnh mù loà, thiếu vitamin B1 dễ bị bệnh tê phù, thiếu
vitamin PP bị bệnh pellagra, thiếu vitamin D bị bệnh về xơng [17]. Hiện
nay một thực tế khắc nghiệt đã xảy ra ở các nớc đang phát triển là phải
đơng đầu với gánh nặng kép giã bệnh nhiễm trùng, tử vong trẻ em và
thiếu dinh dỡng với các bệnh mãn tính không lây liên quan đến dinh
dỡng [16]. Thực tế đã cho thấy thiếu vi chất dinh dỡng đã góp phần
không ít trong gánh nặng kép này. Vì vậy vai trò thực phẩm đợc đánh giá
vô cùng quan trọng, việc nghiên cứu ứng dụng thực phẩm chức năng đã
đang trở thành trào lu mang tính toàn cầu. Nói đến thực phẩm chức năng
chúng ta không thể nói đến thực phẩm bổ sung vitamin D, một loại vitamin
khá quan trọng để phòng chống bệnh còi xơng ở trẻ em, loãng xơng ở
ngời lớn, hạ calci máu và một số bệnh ngoài da
Hiện nay trên thị trờng có rất nhiều loại sữa, bột dinh dỡng, bánh
quy có bổ sung viatmin D. Với lý do trên, đề tài này chúng tôi hy vọng
chuẩn hoá phơng pháp xác định hàm lợng vitamin D bằng phơng pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong một số loại thực phẩm nh sữa
chua, sữa bột, sữa nớc, bánh quy, bột dinh dỡng để đa ra quy trình phân
tích phù hợp, nhằm đánh giá đúng chất lợng, giá trị dinh dỡng thực của
các sản phẩm thực phẩm.
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 3/46
Phần 2: Tổng quan

1. Nguồn gốc và tính chất của vitamin D
VitaminD là chất tinh thể hình kim không màu, không mùi, không
tan trong nớc, hoà tan trong dầu mỡ, tan trong dung môi hữu cơ nh
ethanol, chlorofoc, methanol. Tên gọi khác của vitamin D là calciferol.
Vitamin D là một nhóm gồm từ D


Vitamin D có chủ yếu trong thức ăn nguồn gốc động vật nh trứng,
cá, đặc biệt dịch chiết từ gan cá, bơ, sữa, thịt
Trong cơ thể ngời vitamin D
3
(Cholecalciferol) đợc tổng hợp từ 7
dehydrocholesterol ở dới da nhờ ánh sáng tử ngoại.
Vitamin D
2
(Ergocalciferol) đợc tổng hợp từ ergosterol có trong nấm và
men bia.
Nói chung, hoạt tính sinh học của hai loại vitamin D
2
và vitamin D
3

không có sự khác nhau nhiều. Trong cơ thể vitamin D chuyển hoá ở gan và
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 4/46
thận tạo ra chất chuyển hoá có hoạt tính là 1,25- dihydroxycholecalciferol
nhờ enzim hydroxylase [14].

Hình 2
: Sơ đồ chuyển hoá của vitamin D trong cơ thể ngời

Trong da
Trong gan
Trong thận
Dạng hoạt động
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007

Mỹ cho thấy vitamin D có thể giúp giảm nguy cơ mắc bệnh đa xơ cứng.
Các nhà nghiên cứu đã so sánh lợng vitamin D ở 257 mẫu huyết tơng
trong số hơn 7 triệu mẫu của nhân viên quân đội Mỹ, họ phát hiện rằng
ngời da trắng nhóm có hàm lợng vitamin D cao nhất có nguy cơ mắc
bệnh đa xơ cứng thấp nhất. Bệnh đa xơ cứng là bệnh mãn tính của hệ thần
kinh, bắt đầu với các triệu chứng nh mất trí nhớ, suy nhợc, mệt mỏi, đau
đớn hoặc liệt, chóng mặt và sau đó ảnh hởng tới tim mạch.
3. Tình hình nghiên cứu trong nớc và trên thế giới
Cùng với sự phát triển của nền khoa học kỹ thuật tiên tiến, với sự
bùng nổ của ngành công nghệ thông tin, hiện nay hàng loạt các hệ thống
máy phân tích hoá học đã đợc cải tiến nâng cấp, nhằm xác định nhiều loại
chất hoá học và đồng thời nâng cao độ nhạy của phép phân tích cũng nh
độ lặp lại của kết quả kiểm nghiệm. Trên thế giới nhiều nhà phân tích hoá
học đã có nhiều công trình nghiên cứu xác định hàm lợng vitamin D trong
thực phẩm nh thịt, cá, sữa, trong máu Đó là nghiên cứu hàm lợng
vitamin hoà tan trong chất béo của mẫu sữa chua bằng phơng pháp HPLC
với detector PDA của M.M Delgado Zamarreno, A. Sanchez Perez của
trờng đại học Salamanca Tây ban nha đã đa ra các yếu tố ảnh hởng đến
quá trình phân tích vitamin A, E, D nh điều kiện thuỷ phân, tách các chất
trong khi xử lý mẫu, kết quả của nghiên cứu này đa ra độ thu hồi vitamin
D
3
là 91 5% với hàm lợng vitamin D
3
trong mẫu là 0,09 mcg/100g
5% [11]. Theo nghiên cứu công bố trên Food Chemistry Vol.57, No.1. 95-
99, 1996 ở Anh các nhà nghiên cứu đa ra cách xử lý mẫu, điều phân tích
xác định hàm lợng vitamin D trong thực phẩm, kết quả nghiên cứu này
cho thấy hệ số biến thiên sau khi làm lặp lại ba lần đối với vitamin D
3

trong gan bò 1mcg/100g, trong trứng gà 2mcg/100g, trong nấm rơm là
2mcg/100g [8].
Hiện nay ở Việt nam chúng tôi nhận thấy việc nghiên cứu vitamin D
trong thực phẩm cha đợc làm nhiều, trong bảng thành phần thức ăn Việt
nam cha đề cập đến hàm lợng vitamin D. Trong danh mục tiêu chuẩn
Việt nam (TCVN) chúng tôi cũng cha thấy một quy trình chuẩn nào để
xác định hàm lợng vitamin D bằng HPLC, vì vậy sau khi tham khảo các
tài liệu cùng với điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm chúng tôi đã tiến
hành nghiên cứu chuẩn hoá phơng pháp xác định hàm lợng vitamin D
trong một số loại thực phẩm bằng HPLC. Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 8/46
Phần 3
Mục tiêu, đối tợng và phơng pháp nghiên cứu.

1. Mục tiêu
Nh đã đề cập trong phần tổng quan mục tiêu đề tài chúng tôi chọn
là chuẩn hoá phơng pháp xác định hàm lợng vitamin D (D
2
và D
3
) trong
thực phẩm bằng phơng pháp HPLC
2. Đối tợng
Trong khuôn khổ tổng kinh phí của đề tài là 20 triệu đồng, chúng tôi
chỉ có khả năng tiến hành trên đối tợng thực phẩm là mẫu sữa bột, sữa
chua, sữa đặc, bánh quy và siro
3. Nội dung và phơng pháp

ghi nhận bởi bộ phận phát hiện dới dạng các pic trên sắc đồ. Hình 3
: Mô tả quá trình chạy sắc ký
4.2 Hệ thống HPLC:
Hệ thống HPLC bao gồm các bộ phận chính đợc mô tả dới đây.
Rửa giải qua cột
Quá trình sắc ký
Sắc đồ
Pha động
Pha tĩnh
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 10/46 Hình 4: Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC
Trong đó:
1: Bình chứa pha động.
2: Bơm cao áp
3: Van bơm mẫu.
4: Cột sắc ký
5: Bộ phận phát hiện Detector
6: Bình chứa dung môi thải
7: Hệ thống máy tính ghi dữ liệu phân tích.
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng detector mảng diod (DAD) và
chạy sắc ký pha ngợc (pha động phân cực, pha tĩnh ít phân cực) để xác
định hàm lợng vitamin D.

1

xx
=

Trong đó: C
x
nồng độ mẫu thử.
C
s
nồng độ dung dịch chất chuẩn
S
x
diện tích hoặc chiều cao pic mẫu thử
S
s
diện tích hoặc chiều cao pic dung dịch mẫu chuẩn

Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 12/46
* Chuẩn hoá nhiều điểm:
Chuẩn bị dãy dung dịch các chất chuẩn với nồng độ tăng dần tiến
hành chạy sắc ký. Vẽ đồ thị liên quan giữa diện tích hoặc chiều cao pic với
nồng độ mỗi chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đờng chuẩn để tính
nồng độ các chất cần xác định. Thực hiện việc tính toán này theo hai cách
- áp diện tích hoặc chiều cao pic vào đờng chuẩn để suy ra nồng độ của
chất trong mẫu.
trờng ethanol ở nhiệt độ phòng qua đêm hoặc xà phòng nóng ở nhiệt độ
75
o
C trong 1 giờ. Sau đó các chất không xà phòng hoá (trong đó có vitamin
D) đợc chiết bằng ete dầu hoả. Vitamin D đợc xác định bằng cách làm
sạch dịch chiết rồi bơm vào cột sắc ký và phát hiện bằng detector DAD ở
bớc sóng 265nm.
6.2 Hoá chất sử dụng
- Dung môi methanol của Merck loại dùng cho HPLC.
- Dung môi tetra hydrofuran THF của Merck.
- Dung môi ethanol loại PA của Trung quốc.
- Dung môi ete dầu hoả loại PA của Trung quốc (30-60).
- Dung dịch muối natri clorid 5% loại PA của Trung quốc.
- Chuẩn cholecalciferol của Merck.
- Chuẩn ergocalciferol của Merck.
- Dung môi ethanol tuyệt đối loại PA của Merck.
- Chất chống ô xi hoá Tert butyl hydroquinol (TBHQ) PA của Trung quốc
Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007
Trang 14/46
6.3 Thiết bị và dụng cụ
- Hệ thống HPLC của Thermo Finnigan với detector DAD
- Cột Inertsil ODS -3, 5àm, 250 x4,0 mm của Japan
- Cột tách chiết ODS 2 của Waters Spherisorb 5àm; 4,0 x150mm
- Cân phân tích XT 220 của Thuỵ sĩ độ chính xác 10
- 4
g
- Máy quang phổ UV-VIS của Nhật

môi ethanol của Merck.
- Dung dịch chuẩn trung gian vitamin D
3
nồng độ 1ppm: Lấy 1ml dung
dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100 ml pha loãng bằng ethanol đến
vạch.
- Xác định lại nồng độ các dung dịch chuẩn trung gian trên.
Sử dụng máy quang phổ UV-VIS đo độ hấp thụ (Abs) của mỗi dung dịch
chuẩn trung gian vitamin D
2
, D
3
ở bớc sóng 265 nm. Tính nồng độ thực
của dung dịch chuẩn (C) với hệ số = 18466 với vitamin D
3
và = 18843
với vitamin D
2

- Pha loãng các dung dịch chuẩn trung gian thành các dung dịch chuẩn làm
việc với nồng độ khác nhau để xây dựng đờng chuẩn.
6.4.2 Chuẩn bị mẫu phân tích
- Mẫu đợc đồng nhất kỹ trớc khi xử lý: Đối với mẫu rắn phải xay hoặc
nghiền kỹ và trộn đều. Mẫu dạng bột, lỏng, sệt phải đợc trộn khuấy kỹ.
- Cân khoảng 0,5- 50 g mẫu độ chính xác 0,1g cho vào lọ nhựa.
- Mẫu đợc xà phòng hoá bằng cách cho thêm 40 ml ethanol, 25 ml KOH
80 % , khoảng 0,1 g TBHQ, xà phòng hoá ở 75
0
C trong 1 giờ hoặc ở nhiệt
độ phòng qua đêm.

m
/m
Trong đó:
V: Thể tích dịch chiết cuối cùng để chạy sắc ký HPLC (ml)
C
m:
Nồng độ dung dịch chiết mẫu tính theo đờng chuẩn (àg/ml).
m: Khối lợng của mẫu phân tích (g)
X: Hàm lợng Vitamin D trong mẫu thử (àg/g).