BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
TRẨN THỊ THU HIỂN
NGHIÊN cúu ĐỊNH UrỢNG NEVIR(iPIN TRONG
CHẾ PHẨM RỒN PHÂN LIỀa BẻNG PHtfơNG PHÁP
sếc KÝ LỔNG HIỆU NĂNG CflO (HPLC)
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHÓA 2001-2006)
Người hướng dẫn. TS ĐOÀN CAO SƠN
TS NGUYỄN HẢI NAM
Noi thực hiện'. Phòng Hóa lý II- Viện Kiểm nghiệm
Thời gian thực hiện: 9/2005 đến 5/2006
HÀ NỘI, 5-2006
LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Hóa lý II - Viện
Kiểm nghiệm Bộ Y tế và Bộ môn Hóa dược - Trường Đại học Dược Hà Nội.
Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp tôi đã nhận được sự giúp
đỡ tận tình của các thầy hướng dẫn, các giảng viên của Bộ môn Hóa dược và các
cán bộ của phòng Hóa lý II - Viện Kiểm nghiêm.
Tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới:
- Tiến sỹ Đoàn Cao Sơn - Trưỏng phòng Hóa lý II - Viện Kiểm
nghiệm - Bộ Y tê
- Tiến sỹ Nguyễn Hải Nam - Bộ môn Hóa dược - Trường Đại học
Dược Hà Nội
là những người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, chỉ bảo cho tôi những ý
kiến quỷ báu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, các cô, các kỹ thuật
viên Bộ môn Hóa dược và các cán bộ phòng Hóa lý II - Viên Kiểm nghiêm đã
tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin cảm ơn sự quan tâm của Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo và các
thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian ngồi trên ghế nhà
trường.

1.2.7. ứng dụng của HPLC 17
PHẦN 2- ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Đối tượng nghiên cứu 20
2.2. Phương tiện, dụng cụ, hóa chất 20
2.2.1. Hóa ch ất 20
2.2.2. Thiết bị, dụng c ụ 21
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 22
2.3.1. Nội dung nghiên cứu 22
2.3.2. Phương pháp nghiên cứ u 22
2.3.3. Các đặc trưng thống kê để xử lý kết quả phân tích

22
2.3.4. Cách đánh giá kết q u ả 23
PHẦN 3- THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24
3.1. Nghiên cứu xây dựng điều kiện sắc ký để định lượng nevirapin và
đánh giá phương pháp 24
3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiên sắc k ý
24
3.1.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống 29
3.1.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 30
3.1.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp 31
3.1.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp 34
3.1.6. Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 38
3.2. ứng dụng định lượng nevirapin trong một sô chế phẩm 38
3.2.1. Chế phẩm đơn thành phần 39
3.2.2. Chế phẩm đa thành phần 39
3.3. Bàn luận về kết quả 40
PHẦN 4- KẾT LUẬN 42
PHỤ LỤC

miễn dịch mắc phải gây ra bởi HỈV (Human Ịmmuno-deficiency Virus). Cấu
trúc của HIV bao gồm lớp vỏ và lófp nhân, trong đó lớp nhân có chứa enzym
RT (Reverse Transcriptase) là enzym có khả năng sao chép ngược. Trong các
thuốc kháng HIV, nhóm thuốc quan trọng nhất cũng chính là nhóm thuốc ức
chế enzym RT, qua đó ức chế quá trình sao chép RNA. Các thuốc như
lamivudin, stavudin, zidovudin là các dẫn chất nucleosid có tác dụng ngăn
chặn sự tăng trưởng của chuỗi DNA và ức chế enzym RT. Nevirapin là dẫn
chất không thuộc nhóm nucleosid, tác dụng bằng cách ức chế trực tiếp RT, có
vai trò quan trọng đối với việc điều trị HIV/AIDS.
Hiện nay việc đảm bảo chất lượng của các thuốc chống HIV, đặc biệt
là khi các thuốc này được sản xuất tại các nước có thu nhập thấp như Việt
Nam là vấn đề rất cần được quan tâm. Trong Dược điển hiện hành của một số
nước [
4
,
7
,
8
,
9
,
10
] chưa có chuyên luận về kiểm tra chất lượng các chế phẩm
có chứa nevirapin. Một số Dược điển [11, 20] đã có chuyên luận này nhưng
việc áp dụng vào điều kiện kiểm nghiệm ở Việt Nam còn gặp phải những khó
khăn nhất định.
Trong lĩnh vực kiểm nghiêm thuốc, với sự phát triển vượt bậc của khoa
học kỹ thuật, đã có nhiều thành tựu mới được đưa vào ứng dụng và đã mang
lại cho chúng ta những phương pháp kiểm nghiệm nhanh, đạt độ chính xác
cao. Một trong những phương pháp đó là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Nevirapin là chất ức chế enzym sao chép ngược RT không thuộc nhóm
nucleosid. Nevirapin tác dụng bằng cách ức chế trực tiếp RT, khác với các
dẫn chất nucleosid như lamivudin, stavudin đều có tác dụng kháng retrovirus
nhưng thông qua việc ngăn chặn sự tăng trưởng của chuỗi DNA và ức chế
enzym RT.
Đặc tính dược động học
Sau khi uống, thuốc được hấp thu nhanh, sinh khả dụng theo đường
uống khoảng 93%, phân bố khắp cơ thể, liên kết với protein huyết tương thấp
(khoảng 60%).
Nồng độ đỉnh huyết tương ổn định (17±7fiM/l) của nevirapin đạt được
sau khoảng 4 giờ.
Nevirapin chịu ảnh hưởng của hệ enzym chuyển hóa Cytochrom P450.
1.1.4. Tác dụng không mong muốn [12]
Tác dụng phụ có ý nghĩa lâm sàng liên quan đến việc dùng nevirapin
thường là phát ban và tăng các thông số chức năng gan, cũng có thể xảy ra
phản ứng quá mẫn.
Độc tính chủ yếu của nevirapin trên lâm sàng là phát ban, có đến 35%
bệnh nhân điều trị với nevirapin bị phát ban so với 19% ở nhóm chứng điều trị
với zidovidin + didanosin hoặc dùng riêng zidovudin. Phát ban ở mức độ nhẹ
đến trung bình, dạng hồng ban dát sần, có thể có ngứa hoặc không, xuất hiện
ở thân, mặt và tứ chi. Phát ban nặng hoặc đe dọa tính mạng chiếm tỷ lệ 6,6%
bệnh nhân điều trị bằng nevirapin so với 1,3% bệnh nhân ở nhóm chứng.
Về những bất thường trong xét nghiệm cận lâm sàng, sự gia tăng men
gan không có triệu chứng thường xảy ra. Đã có các trường hợp viêm gan lâm
sàng ở bệnh nhân sử dụng nevirapin nên cần theo dõi GPT và GOT, đặc biệt
là trong 6 tháng đầu điều trị.
1.1.5. Một sô chê phẩm
- Chế phẩm đơn thành phán:
VIRAMUNE viên nén 200mg
VIRAMUNE hỗn dịch uống 50mg/ml

- Thể tích tiêm
220nm
1 ,Oml/phút
25fil
- Nhiệt độ cột duy trì ở 35°c.
* Phương pháp 2 [17]:
- Cột Cjg (Spherisorb, 300 X 4,6m m; 3|Lim)
- Pha động: dung dịch đệm phosphat (lOmM, pH 5,0): acetonitril
(82:18) có chứa lOmM trimethylamin
- Detector u v : 240nm
- Tốc độ dòng: l,Oml/phút
- Thời gian lưu: 2,0 phút.
* Phương pháp 3 [15]:
- Cột phân tích RP LC-8 (Supelco, 150 X 4,6mm; 5ịiiĩi) và một
tiền cột LC-8, nhiệt độ cột duy trì ở 30°c
- Pha động: dung dịch đệm phosphat (0,025M, pH 6,0) (với chất
tạo cặp ion là acid 1-butan sulfonic (0,025M)): methanol: acetonitril (63:
21,5: 15,5)
- Detector u v : 280nm
- Tốc độ dòng: l,Oml/phút
- Chất chuẩn nội; BIRH-414 (11- Ethyl-5,ll-dihydro-4-methyl-
6//-dipyrido[3,2-ò;2’,3’-e][l,4]diazepin-6-on)
- Thời gian lưu của nevirapin: 5,5 phút, của BIRH-414: 7,5 phút.
1.2. TỔNG QUAN VỂ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO (HPLC) [2, 3, 4, 6, 9, 11, 14, 16, 19]
1.2.1. Khái niệm về sác ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao
a. Khái niêm về sác ky
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách và phân tích
các cấu tử của những hỗn hợp phức tạp dựa vào việc sử dụng các quá trình sắc
ký khác nhau trong các điều kiện động. Sự tách các thành phần trong mẫu dựa

- Tương tác giữa pha tĩnh và pha động ( F 3 )
Theo sơ đồ sau:
Trong đó tương tác Fj và F2 đóng vai trò quyết định còn F3 là yếu tố
ảnh hưởng không lớn [6 .
1.2.3. Cơ sở lý thuyết sác ký
Quá trình phân tách trong phương pháp HPLC là do quá trình vận
chuyển và phân bố chất tan giữa hai pha là khác nhau. Khi pha động di
chuyển với một tốc độ nhất định sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ trong
cột ra khỏi cột. Tùy theo bản chất pha động, pha tĩnh, chất tan mà quá trình
rửa giải tách được các chất ra khỏi cột. Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ được phát
hiện và ghi lại dưới dạng pic. Tín hiệu của cả quá trình sắc ký cho chúng ta
sắc ký đồ. Một sắc ký đồ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào mẫu có một hay
nhiều thành phần.
1.2.4. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC
a. Hê thống bơm
Bơm được xem là một trong những thành phần quan trọng nhất của hệ
thống sắc ký. Bơm có tác dụng đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ
hằng định.
Có hai loại bơm:
- Một là bơm đẳng dòng (Isocratic pump)
- Hai là bơm chương trình dung môi và tốc độ dòng (Gradient pump).
b. Bình chứa dung mối và hê thống xử lý dung mối
Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ.
Cần lọc loại các hạt trong dung môi (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45|Lim) và
đuổi khí hòa tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí). Trong
phưofng pháp thông thường chỉ cần một bình dung môi. Trong phương pháp
gradien có thể cần 2, 3, 4 bình chứa dung môi.
c. Hê tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ
thống tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu

to là thời gian chết (thời gian không lưu giữ)
- Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu
có thể thay thế bằng thể tích lưu. Vj^ là thể tích dung môi đi qua cột cần để di
chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ
Vr = ÍR X
(F^. là thể tích pha động trong một đơn vị thời gian)
- tjị và Vr là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chất tan vì vậy hai
đại lượng này phụ thuộc vào: tính chất pha tĩnh, bản chất pha động, tốc độ
dòng, tính chất chất tan, nhiệt độ,
b. Hê số phân bố K
Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của các chất tan giữa pha
động và pha tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ
số phân bố tính theo công thức:
K = k.C,/C^
Cg và là nồng độ chất tan ở pha tĩnh và pha động tương ứng, k là hệ
số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng
chất tan do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột. K chỉ phụ thuộc vào: bản
chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ.
Nếu K lớn thì lớn (pic ra muộn)
Nếu K nhỏ thì tj^nho (pic ra sớm).
10
c. Thừa số dung lương K’
K’ là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong hai pha
cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và
lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng:
y .
Trong đó là thời gian lưu, là thời gian chết.
- K ’ phụ thuộc: bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm
cột, thể tích của pha động và pha tĩnh.
K ’ càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp.

AF =
0.05
2d
Wq05 là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic.
d là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường
cong phía trước ở 1/20 chiều cao pic.
- Yêu cầu AF = 0,9 - 2,0.
Vai trò: AF càng gần 1 thì pic càng có dạng phân phối chuẩn Gauss
nên kết quả tính diện tích pic càng chính xác.
- Các yếu tố ảnh hưởng:
+ pH: quyết định dạng tồn tại của chất tan nên từ đó có ảnh
hưởng đến AF.
+ Cột: cột tốt thì AF sẽ tốt.
+ Thể tích tiêm.
- Cách cải thiện AF:
+ Chọn cột thích hợp
+ Điều chỉnh pH để chất tan tồn tại ở một dạng thích hợp
+ Thể tích tiêm thích hợp.
g. Số đĩa lý thuyết N
^ = " = 5 . 5 4 | -
- SỐ đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột.
- Từ công thức ta thấy N phụ thuộc vào và w (độ rộng pic).
càng lớn thì N có thể sẽ tăng, tuy nhiên thời gian phân tích kéo dài.
12
w (độ rộng pic ở đáy) hay (độ rộng pic đo ở 1/2 chiều cao) càng
nhỏ thì N càng lófn nhưng w và Wy2 sẽ nhỏ hơn nếu nhỏ.
Khi tjị cố định thì bản chất cột, pha động, pH là các yếu tố quyết định
trong đó cột đóng một vai trò hết sức quan trọng.
- Để đánh giá hiệu lực cột thường tính số đĩa lý thuyết trên một đơn vị
chiều dài cột:

chất phân tích có thể phân cực hoặc ít phân cực.
Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC;
- Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký.
- Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc
ký nhất định
- Tính chất bề mặt ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó)
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt
- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.
Vì silica gel là loại pha tĩnh hay dùng và ưu việt nên ở đây giới thiệu về
một số loại silica gel;
- Silica trung tính, silica cyanid hoá, amin hoá trên bề mặt có các nhóm
OH phân cực (ưa nước), nhóm CN hoặc nhóm NHj- Loại này hay được sử
dụng làm pha tĩnh cho các sắc ký hấp phụ pha thuận để phân tích các chất ít
hay không phân cực.
- Silica đã alkyl hóa, được điều chế bằng cách alkyl hóa các nhóm OH
trên bề mặt silica bằng các gốc alkyl - R của mạch carbon (C2, C8, C18) hay
các gốc carbon vòng. Do các nhóm OH thân nước trên bề mặt được thay bằng
các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực. Silica đã alkyl hóa được sử
dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực
hay sắc ký tạo cặp ion.
- Silica sulfon hóa hay nitro hóa để làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi
cation. Silica amin hóa dùng làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi anion.
14
Chất cần phân tích có khối lượng
phân tử < 2000
Tan trong dung môi hữu cơ
Tan trong dung mối
Miông phân cực đến
phồn cực yêíi (hexan
đến CHGỈ3>

khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Pha động là yếu tố thứ hai
quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp, thời gian lưu tjỊ và hiệu quả
tách. Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ hay hỗn hợp
của 2, 3 dung môi theo tỷ lệ nhất định, cũng có thể là dung dịch các muối có
chứa chất đệm, chất tạo phức. Mỗi loại sắc ký sẽ có hệ dung môi rửa giải để
có hiệu quả phân tách tốt nhất.
* Pha động có thể ảnh hưởng tới:
- Độ chọn lọc của pha động
- Thời gian lưu giữ của chất tan
- Hiệu lực tách của cột
- Độ phân giải của chất tan
- Độ rộng của pic sắc ký.
Vì những lý do trên nên khi các điều kiện khác đã cố định thì việc chọn
pha động thích hợp là rất quan trọng.
* Những yếu tố chính cần chú ý trong lựa chọn pha động:
- Bản chất của dung môi được lựa chọn
- Thành phần của các chất trong pha động
- Tốc độ dòng pha động
- pH pha động (đặc biệt chú ỷ ở sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion).
* Yêu cầu của một pha động;
- Phải trơ đối với pha tĩnh
- Phải hòa tan được chất mẫu
- Phải bền vững theo thời gian
- Các thành phần phải có độ tinh khiết cao
- Nhanh đạt được cân bằng trong quá trình sắc kỷ
- Phù hợp với loại detector được sử dụng
- Phải có tính kinh tế và đảm bảo môi trường.
16
Trong sắc ký pha thuận thì pha động thường là các dung môi hữu cơ ít
phân cực (kỵ nước) như; n-hexan, n-heptan, benzen, chloroform, Các pha

trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất.
Trong sắc ký, chất muốn phân tích được tách riêng ra khỏi hỗn hợp và
được định lượng dựa vào chiều cao hay diện tích của đáp ứng pic so với chất
chuẩn. Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong kỹ thuật HPLC là:
- Phương pháp chuẩn ngoại: Cả hai mẫu thử và chuẩn đều được tiến
hành sắc ký trong cùng một điều kiện. Sau đó diện tích pic thu được từ mẫu
thử được so sánh với diện tích pic thu được từ mẫu chuẩn. Kết quả có thể tính
theo cách chuẩn hóa một điểm hay từ đường chuẩn tuyến tính.
- Phương pháp chuẩn nội; Là phương pháp cho thêm những lượng
giống nhau của chất chuẩn thứ hai đáp ứng gần giống chất phân tích vào cả
mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai gọi là chất
chuẩn nội. Yêu cầu pic của chất chuẩn nội phải tách hoàn toàn ra khỏi pic của
chất cần phân tích. Kết quả được tính dựa vào tỷ số diện tích hoặc chiều cao
pic đáp ứng của chất phân tích và chất chuẩn nội.
- Phương pháp thêm chuẩn: Phương pháp này dùng trong HPLC khi có
ảnh hưởng của chất phụ hay quá trình xử lý mẫu phức tạp. Mẫu thử được thêm
một lượng chính xác chất chuẩn. Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính
dựa trên sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của
diện tích. Với phương pháp thêm nhiều lần ta có phương pháp thêm đường
chuẩn.
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic;
Nguyên tắc; Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều
cấu tử được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện
tích của tất cả các pic thành phần.
Yêu cầu:
+ Tất cả các thành phần đều được rửa giải và phát hiện
+ Tất cả các thành phần có đáp ứng như nhau với detector.
18
Khi đó hàm lượng chất thử được tính như sau:
o .y -^,.100 _ 5,.100

- Chế phẩm đa thành phần (mẫu Mj)
LAMZITRIO - viên bao film
Công ty STADA Việt Nam
Công thức: Lamivudin 150mg
Nevirapin 200mg
Zidovudin 300mg
Tá dược vđ 1 viên
SỐ đăng ký : V N B -286 7 -0 5
Số kiểm soát : 200505
Hạn dùng : 05/2008.
2.2. PHƯƠNG TIỆN, DỤNG cụ , HÓA CHÂT
2.2.1. Hóa chất
- Các chất chuẩn của Phòng Hóa lý II - Viện Kiểm nghiệm:
+ Chuẩn nevirapin;
Công ty STADA Việt Nam
SỐ lô: 0030108
Hàm lượng trên chế phẩm khô; 99,99%
Hàm ẩm: 0,06%
20