BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH
CHÂU TRẦN TÂN QUỐC NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG
VITAMIN C TRONG RAU QUẢ THÔNG DỤNG
HUYỆN CHÂU PHÚ – AN GIANG BẰNG PHƢƠNG
PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ( HPLC) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC


CHUYÊN NGHÀNH : HÓA PHÂN TÍCH
Mã số : 60440118 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học :
PGS.TS.NGUYỄN KHẮC NGHĨA Nghệ An -2014
LỜI CẢM ƠN
Luận văn này đƣợc hoàn thành tại phòng thí nghiệm Hóa Phân Tích – Khoa
Hóa, Trƣờng Đại học Vinh và Trung Tâm Kỹ Thuật Thí Nghiệm và Ứng Dụng
Khoa Học Công Nghệ Tỉnh Đồng Tháp
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến : Thầy
PGS.TS.Nguyễn Khắc Nghĩa đã giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều
kiện thuận lợi nhất cho việc nghiên cứu và hoàn thành luận văn .
Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Đào Tạo Sau Đại Học, Khoa Hóa, cùng
các thầy giáo, cô giáo, cán bộ phòng Thí Nghiệm đã tạo điều kiện thuận lợi nhất
để tôi hoàn thành luận văn.
Xin cảm ơn tất cả những ngƣời thân trong gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã
động viên giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này.
Vinh, 
Ngƣời thực hiện
Châu Trần Tân Quốc
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1 : TỔNG QUAN 4

1.3.4.1 Giới thiệu chung về cà chua 24
1.3.4.2 Giá trị dinh dƣỡng quả cà chua 24
1.4 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC [5,10] 24
1.4.1 Giới thiệu về phƣơng pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao (HPLC) 24
1.4.1.1 Cơ sở lý thuyết 24
1.4.1.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột 25
1.4.1.3 Phân loại sắc ký và ứng dụng 26
1.4.1.4 Các đại lƣợng đặc trƣng của sắc ký đồ 27
1.4.1.4.1 Thời gian lƣu : Retention time (Rt) 27
1.4.1.4.2 Hệ s dung lƣợng k’ 28
1.4.1.4.3 Độ chọn lọc

28
1.4.1.4.4 S đĩa lý thuyết N 29
1.4.1.4.5 Độ phân giải R (Resolution) 29
1.4.1.4.6 Hệ s phân b 30
1.4.2 Hệ thng HPLC 30
1.4.2.1 Bình chứa pha động 31
1.4.2.2 Bộ khử khí (degasse) 31
1.4.2.3 Bơm ( pump) 31
1.4.2.4 Bộ phận tiêm mẫu (injection) 32
1.4.2.5 Bộ phận ghi tín hiệu 32
1.4.2.6 In kết quả 33
1.4.2.7 Chọn điều kiện sắc ký 33
1.4.2.7.1 Lựa chọn pha tĩnh 33
1.4.2.7.2 Lựa chọn pha động 34
1.4.3 Tiến hành đo sắc ký 35
1.4.3.1 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc 35
1.4.3.2 Chuẩn bị dung môi pha động : 36
1.4.3.3 Chuẩn bị dung môi pha động : 36

3.2.1 Độ lặp lại theo chuẩn : 57
3.2.2 Độ lặp lại theo mẫu cà chua chín : 57
3.2.3 Độ lặp lại theo mẫu cà chua xanh : 58
3.2.3 Độ lặp lại theo mẫu cam : 59
3.2.4 Độ lặp lại theo mẫu quýt : 59
3.2.5 Độ lặp lại theo mẫu cải xanh : 60
3.2.6 Độ lặp lại theo mẫu cải thìa : 60
3.3 Độ tái lặp : 61
3.3.1 Độ tái lặp theo chuẩn : 61
3.3.2 Độ tái lặp theo mẫu cà chua chín : 62
3.3.3 Độ tái lặp theo mẫu cà chua xanh : 63
3.3.4 Độ tái lặp theo mẫu cam : 63
3.3.5 Độ tái lặp theo mẫu quýt : 64
3.3.6 Độ tái lặp theo mẫu cải xanh : 65
3.3.7 Độ tái lặp theo mẫu cải thìa : 66
3.4 Xác định độ thu hồi : 67
3.4.1 Độ thu hồi theo mẫu cà chua chín : 67
3.4.2 Độ thu hồi theo mẫu cà chua xanh : 68
3.4.3 Độ thu hồi theo mẫu cam 68
3.4.4 Độ thu hồi theo mẫu quýt : 69
3.4.5 Độ thu hồi theo mẫu cải xanh 70
3.4.6 Độ thu hồi theo mẫu cải thìa 70
3.5 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp
phân tích 71
3.5.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 71
3.5.2 Giới hạn định lƣợng LOQ 72
3.6 Các sắc đồ của phép đo HPLC 74
KẾT LUẬN 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78
Tài Liệu Tiếng Việt 78

 65
 66
 66
 66
 67
 67
 67
 68
 68
  68
 69
 69
 69
 70
 70
 thìa (08/07/2014) 70
 71
  71
 72
 73

DANH MỤC HNH ẢNH

Hinh 1. 1Vitamin C 13
Hin 20
 21
 22
 23
Hinh 1. 6:  40
Hinh 1. 7:  43

(High Performance Liquid Chromatography)
MeOH
Methanol
RSD
Độ lệch chuẩn tƣơng đi
(Relative standard deviation)
STT
S thứ tự
SD
Độ lệch chuẩn
UV
Tử ngoại
DAD
Diode Aray Detectors
KH
2
PO
4

Kaliđihidrophotphat
DMPM
Dung môi phá mẫu
HL
Hàm lƣợng
V
Hệ s biến thiên

1

MỞ ĐẦU

ta phải dùng tới phƣơng pháp hóa học tổng hợp. Viên vitamin C tổng hợp nếu để
lâu sẽ dễ bị phân hủy và tạo thành axit oxalic, là chất dễ gây sỏi đƣờng tiết niệu.
Vì vậy ngƣời ta khuyên nếu dùng vitamin C dạng viên, chỉ nên mua đủ ung,
không dự trữ lâu. Những viên vitamin C đã quá hạn dùng cần hủy bỏ, không nên
tiếc rẻ và sử dụng.
Những dẫn liệu trên cho thấy vitamin C có trong rau quả mới chính là loại
“thuc” tt nhất, nên dùng nhất. Nói chung, những ngƣời khỏe mạnh, ăn ung
tt thì không lo thiếu vitamin C. Sự thiếu hụt vitamin C chỉ xảy ra ở những
ngƣời ăn kiêng, ít hoặc không ăn rau quả tƣơi trong một thời gian dài, hoặc
ngƣời m yếu ăn ung kém.
Tuy nhiên đây là hợp chất hữu cơ thuộc đi tƣợng khó phân tích, hơn nữa
trong mẫu phân tích tồn tại nhiều chất hữu cơ và vô cơ ở các dạng khác nhau,
gây cản trở cho quá trình định lƣợng. Do đó cần phải lựa chọn phƣơng pháp
phân tích hữu hiệu nhất.
Có thể phân tích vitamin C bằng các phƣơng pháp : sắc ký giấy, cực phổ,
trắc quang, hóa học, sắc ký lỏng hiệu năng cao Trong đó phƣơng pháp HPLC
tỏ ra có nhiều ƣu việt hơn cả .
Xuất phát từ tình hình thực tế trên tôi đã lựa chon đề tài : “Nghiên cứu, xác
định hàm lƣợng vitamin C trong một s rau quả thông dụng huyện Châu Phú -
An Giang bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” làm luận văn
tt nghiệp .
3

Để thực hiện đề tài này , chúng tôi tập trung giải quyết các nội dung sau :
- Ti ƣu hóa các điều kiện phân tích trên thiết bị HPLC để tách đƣợc
hoàn toàn các chất .
- Khảo sát đƣờng chuẩn, tìm khoảng tuyến tính cho mỗi chất . Tìm giá
trị giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) trên thiết bị.
- Khảo sát qui trình tách, chiết ti ƣu cho một s mẫu rau quả tƣơi .
- Khảo sát khoảng tuyến tính và tìm giá trị giới hạn phát hiện (LOD) và

xác nhận, ở những thủy thủ đi biển lâu ngày luôn xuất hiện nhiều dấu hiệu bệnh
do chế độ ăn thiếu rau quả tƣơi, đó là bệnh scorbut. Năm 1747, trong chuyến đi
5

trên tàu Salisbury, ông đã tiến hành thử nghiệm và thu đƣợc kết quả: những thủy
thủ ăn đầy đủ rau quả tƣơi không mắc bệnh, trong khi những ngƣời khác đều có
dấu hiệu của bệnh scorbut. Năm 1753, James Lind đã viết một cun sách thông
báo hiện tƣợng này nhƣng mãi tới năm 1795 nghĩa là 42 năm sau khi ông qua
đời, các nhà khoa học mới chú ý đến nó và hải quân mới có những quy định về
chế độ ăn rau quả tƣơi trên tàu biển.
Năm 1907, hai nhà khoa học Axel Holst và Theodor Frolich dự tính dùng
chế độ ăn giảm thiểu để gây suy dinh dƣỡng ở chuột lang; và ngẫu nhiên họ lại
gây đƣợc bệnh scorbut trong thử nghiệm. Nhờ đó, giới y học mới hiểu thêm
đƣợc quá trình hình thành dạng bệnh này. Năm 1912, sau một thời gian dài
nghiên cứu các bệnh nhƣ beri-beri, scorbut và nhiều bệnh suy dinh dƣỡng khác,
Casimir Funk mới phát hiện ra vitamin. Cũng chính ông là ngƣời sau này đã
khẳng định vai trò của vitamin C trong việc phòng chng bệnh scorbut. Mãi đến
năm 1920, Jack Drummond mới xác định “yếu t phụ cần thiết cho sự sng”
không phải là amine nhƣ Funk tƣởng và đề nghị bỏ chữ “e” để tránh gây sự ngộ
nhận về tính chất hóa học. Từ đó, thuật ngữ “vitamin” đƣợc chính thức sử dụng
trong y văn.
Năm 1928, trong khi nghiên cứu hiện tƣợng oxy hóa tế bào, Szent Giorgyi,
nhà sinh hóa Mỹ, đã phân lập đƣợc từ tuyến thƣợng thận một chất và đặt tên là
hexuronic acid, thực ra là vitamin C hòa tan trong nƣớc.Nhờ phát hiện này, ông
đƣợc tặng giải Nobel Y học. Năm 1932, W.A. Waugh và Charles King phân lập
đƣợc vitamin C từ chanh và xác nhận có tính chất ging hệt hexuronic axit. Năm
1933, vitamin C đƣợc gọi với tên ascorbic axit và tới năm sau thì đƣợc tổng hợp
nhờ công trình nghiên cứu của nhà hóa học ngƣời Anh Walter Haworth. Nhƣ
vậy, vitamin C đã đƣợc biết đến sớm nhất.
6

loạn bệnh lý (bệnh thiếu vitamin và bệnh thừa vitamin).
Thực vật và vi sinh vật có khả năng tổng hợp hầu hết các loại vitamin và
tiền vitamin (provitamin)
Ngƣời và động vật không có khả năng tổng hợp mà chỉ sử dụng đƣợc
vitamin lấy từ thức ăn. Một s loại vitamin ( B6, B12, axit pantotenic, axit
folid ) đƣợc hệ vi khuẩn ở ruột tổng hợp hoặc tạo ra trọng cơ thể (ví dụ axit
nicotinic đƣợc tổng hợp từ tryptophan), tuy vậy các phản ứng này không đủ cung
cấp cho nhu cầu của cơ thể.
1.1.3.2 Phân loại
Dựa vào cơ sở sinh lý và hoá học, vitamin đƣợc phân chia thành 2 nhóm
lớn là : vitamin hòa tan trong nƣớc và vitamin hòa tan trong chất béo (dầu).
- Vitamin hòa tan trong nƣớc :
 Vitamin B1 (Titamin)
 Vitamin B2 (Riboflavin)
 Vitamin B6 (Piridoxin)
 Vitamin B3 (Axit pantoneic)
 Vitamin B12 (Xiancobalamin)
 Vitamin B13 (Axit orotic)
 Vitamin PP (Axit nicotinic)
 Vitamin P (Bioflavonoit)
 Vitamin C (Axit ascorbic)
- Vitamin hòa tan trong chất béo (dầu) :
 Vitamin A và caroten
8

 Vitamin D (Canxiferol)
 Vitamin E (Tocoferol)
 Vitamin K (Koagulation)
 Vitamin Q
1.1.4 Vai trò của vitamin [6]

chanh, bƣởi…có vai trò quan trọng trong quá trình tạo collagen, làm
tăng sức đề kháng của cơ thể, kích thích thƣợng thận bài tiết các
corticosteroid, làm tăng sự trƣởng thành của hồng cầu. Thiếu
vitamin C có thể làm vết thƣơng chậm lành, khiếm khuyết cấu tạo
răng, vỡ mao mạch gây xuất huyết dƣới da, chảy máu chân răng.
Tác dụng của vitamin C là hỗ trợ điều trị các chứng dày sừng nang
lông, xạm da, viêm niêm mạc miệng, loét da lâu lành.
 Vitamin PP : có nhiều trong thức ăn nhƣ men ba, thịt, sữa, cám, cà
rt, cà chua, đậu hũ, gan, trứng, rau xanh và các loại ngũ cc đặc
biệt là trong hạt ngô. Thiếu vitamin PP gây bệnh pellagra, tiêu chảy,
viêm niêm mạc miệng, viêm môi, thiểu năng tâm thần.
Nhóm tan trong dầu :
 Vitamin A : rất cần thiết cho thị giác, cho sự tăng trƣởng, sự phát
triển và duy trì của biểu mô. Vitamin A có nhiều trong gan, thận
động vật, các chế phẩm từ sữa, trứng và dầu gan cá. Các carotenoid
(tiền vitamin A) có nhiều trong cà rt, trái cây có màu vàng, rau có
10

màu xanh đậm. Thiếu vitamin A gây hiện tƣợng tăng sừng da, khô
mắt, quáng gà lúc xẩm ti.
 Vitamin D: có chức năng sinh học là duy trì nồng độ canxi và pht
pho bình thƣờng trong huyết tƣơng bằng cách tăng hiệu quả hấp thụ
các chất khoáng từ khẩu phần ăn ở ruột non và tăng huy động canxi,
pht pho từ xƣơng và máu . Vitamin D có nhiều trong gan cá, bơ,
sữa, trứng…thiếu vitamin D sẽ gây còi xƣơng ở trẻ em, yếu cơ. Tác
dụng của vitamin D là hỗ trợ điều trị các trƣờng hợp vảy nến, xơ
cứng bì, luput ban đỏ…
 Vitamin E : có nhiều trong dầu thực vật, mầm ngũ cc,
trứng…vitamin E ngăn cản oxy hóa các thành phần thiết yếu trong
tế bào, ngăn cản sự tạo thành các sản phẩm oxy hóa độc hại.

nhờ nhiều khám phá mới về vai trò quan trọng của vitamin và khoáng chất, trong
đó có vitamin C.
Vitamin C đƣợc định nghĩa là “yếu t chng scorbus”, đƣợc Albert Szent-
Gyorgyi phân lập năm 1928. Gần 70 năm sau, các nhà nghiên cứu đã khám phá
ra nhiều lợi ích của vitamin C cho sức khỏe. Ngày nay mặc dù bệnh Scurvy hiếm
gặp trong xã hội chúng ta, thiếu hụt vitamin C ở mức độ cận lâm sàng và mức độ
giới hạn dƣới cũng khá phổ biến, đặc biệt là ở ngƣời già.
1.2.2 Danh pháp Vitamin C
- Tên theo IUPAC: 2-oxo-L-threo-hexono-1,4- lactone-2,3 –enediol
hay (R)-3,4-dihydroxy-5-((S)- l,2-dihydroxyethyl)furan-2(5H)-one
12

- Tên thông thƣờng: acid ascorbic, vitamin C
- Tên gọi khác : L-ascorbate.
- Công thức phân tử: C
6
H
8
O
6

- Khi lƣợng phân tử: l 76,13 g/mol
- Yếu t nhận dạng :
 CAS number : 50 - 81- 7.
 ATC code : AllG
 PubChem : 644104
1.2.3 Phân loại vitamin C
- Axit ascorbic (dạng khử)
- Axit dehydroascorbic (dạng oxy hoá)
- Dạng liên kết ascorbigen