LỜI CẢM ƠN
Những dòng đầu tiên của bản luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn
sâu sắc đối với PGS. TS Thái Nguyễn Hùng Thu người đã giao đề tài, tận tình
hướng dẫn em rất nhiều trong những năm học tại trường.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Đoàn Cao Sơn - Viện trưởng Viện kiểm
nghiệm thuốc Trung ương, chị Lục Thị Vân phó phòng Hóa Lý II cùng toàn
thể các anh chị tại phòng Hóa Lý II đã đồng hướng dẫn và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho em trong suốt quá trình nghiên cứu tại phòng.
Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô trong bộ môn hóa phân tích
đã nhiệt tình giảng dạy và hướng dẫn em trong suốt thời gian học tập tại
trường.
Cuối cùng, em xin chân thành gửi cảm ơn tới gia đình và các bạn đã luôn
đông viên giúp đỡ em hoàn thành bản luận văn này.
Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2011
Sinh viên
Vũ Thị Phượng
MỤC LỤC
!"##$%!&'()
*#$!+, (/)0()
123#456# (7)0(1)
/8#9989:;-6'-9<=>?'@5='#-'=>5/
A8>>BCD
%@E!F#'&!:GD
1G!?H! ?HIJ!%K!!='D
/8#LG9K#M,CG!B!HN
/
2OPQRPSTUV/
found
Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo một hệ thống HPLC hoàn chỉnh Error: Reference
source not found
Hình 3.1. Sắc ký đồ với pha động đệm phosphats pH 3: acetonitril
(45:55) Error: Reference source not found
Hình 3.2. Sắc ký đồ với pha động có chứa natri laurylsulfat Error:
Reference source not found
Hình 3.3. Phổ hấp thụ UV – VIS của Tolperison Error: Reference source
not found
Hình 3.4. Sắc ký đồ của dung dịch mẫu tá dược Error: Reference source
not found
Hình 3.5. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn Error: Reference source not found
Hình 3.6. Sắc ký đồ của mẫu thử tự tạo Error: Reference source not found
Hình 3.7. Đánh giá sự tương đồng giữa phổ chuẩn và thử Error:
Reference source not found
Hình 3.8. Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính Error: Reference source not
found
Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu thử Mydocam 50mg Error: Reference source
not found
Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu thử Myderison 50mg Error: Reference source
not found
!"##$%!&'()
*#$!+, (/)0()
123#456# (7)0(1)
16#:Gf#
18#5•gh##\
2OPQUV/
WXRYZ[/
+,#$!/
>\!L;/
1]RPSTUV^
1G>5%>E#"%^
1€ˆ@5e#!=‹?F#I.^
1~C:;#!=‹?F#I.:|uˆ@5e^
11V5•9989:|uˆ@5e:‰:;-6'-9<=>?'@5='#-'=>5!='
g>Ev^
1989>E#"%^
1>E#"%:;4w^
1>E#"%:;-6wD
1_
AY`R`a_
1A`T2AbcAd_
1e,#f9,:Ggh#G!?F#I.()0(1)0(/)0(^)0(D)0(7)_
1e,#fLi#?+(D)j
11e,#f!H#:G5k(^)0(D)N
1l2[PSmcAd2no(D)0(_)
1Ap'?8!4:3#>B%
1Ap'?8!I'p!%@\4^
11Ap'?8!:G-39-&>D
1/Ap'?8!:G:q_
1^>i>&98!>Brsgh>i>&:;-6rs7
11V2[PQUtj
Kuv!wp,>Cx%!y!=E:z%#+hC-6:&!I'pj7{hC-6>!=E|05'
:+:&!}E%#%~gzhC-6#M,g>Evrj^{•N^{s!<'}E%#%~21
11ZRa1
/AYa11
Đề tài này được phối hợp thực hiện tại Phòng kiểm nghiệm và bào chế -
Viện Kiệm thuốc Trung ương.
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ TOLPERISON HYDROCHLORID
1.1.1 Công thức cấu tạo [12]
O
CH
3
N
CH
3
H
•
HCl
Công thức: C
16
H
23
NO.HCl
Trọng lượng phân tử: M = 281,81
Tên khoa học:
(2RS)-2-Methyl- 1- (4-methylphenyl)- 3- piperidin-1-yl propan-1-one
monohydrochlorid
1.1.2 Tính chất hóa lý [4], [12]
Tolperison hydroclrorid tồn tại dạng bột kết tinh màu trắng, nhẹ, với mùi
đặc trưng, là chất hút ẩm.
Rất dễ hòa tan trong acid acetic (100), dễ tan trong nước và trong ethanol
(95), ít tan trong aceton và thực tế không hòa tan trong benzen hoặc ether.
pH dung dịch Tolperison.HCl (1/20) là 4,5 – 5,5
và cổ, bệnh khớp của các khớp lớn). Phục hồi chức năng sau các phẫu thuật
chấn thương chỉnh hình.
Điều trị các bệnh nghẽn mạch (vữa xơ động mạch, bệnh mạch máu do
tiểu đường, viêm mạch tạo huyết khối nghẽn, bệnh Raynaud, xơ cứng bì lan
2
tỏa) cũng như hội chứng xuất hiện trên cơ sở suy giảm sự phân bố thần kinh –
mạch (xanh tím tái đầu chi, chứng khó đi do loạn thần kinh - mạch từng cơn)
Bệnh Little và các bệnh kèm theo loạn trương lực cơ là những chỉ định
nhi khoa đặc biệt của thuốc này.
1.1.3.4 Chống chỉ định
Nhạy cảm với bất cứ thành phần nào của thuốc, người bị nhược cơ năng.
Vì thiếu các kết quả nghiên cứu thích hợp nên chống chỉ định dùng thuốc tiêm
Tolperison hydroclorid cho trẻ em.
Chống chỉ định tương đối: Mang thai, đặc biệt trong 3 tháng đầu của thai
kỳ. Không nên dùng Tolperison hydrochlorid trong thời kì cho con bú.
1.1.3.5 Thận trọng khi dùng
Với các liều thấp hàng ngày nên dùng Tolperison hydrochlorid viên nén
bao phin 50mg để điều trị cho trẻ em, phụ nữ có thai và cho con bú. Vì chưa
có các dữ kiện lâm sàng thích hợp, không nên dùng Tolperison hydrochlorid
cho người mang thai (đặc biệt trong 3 tháng đầu), trừ khi tác dụng có lợi cho
mẹ vượt hẳn bất kỳ độc tính với phôi có thể có. Tương tự, việc Tolperison có
bài tiết qua sữa mẹ hay không cũng chưa được xác định nên không dùng
Tolperison hydrochlorid trong thời kỳ cho con bú.
1.1.3.6 Tương tác thuốc
Chưa biết rõ tương tác thuốc làm hạn chế sử dụng Tolperison
hydrochlorid. Mặc dù Tolperison là một hợp chất tác dụng trung ương, nhưng
không gây buồn ngủ nên có thể dùng kết hợp với thuốc ngủ, thuốc an thần
kinh. Tolperison làm tăng mạnh tác dụng của acid nifluminic, vì vậy, khi
dùng đồng thời nên giảm liều acid nifluminic.
1.1.3.7 Tác dụng phụ
chuẩn độ trong môi trường khan: hòa tan 0,5g Tolperison hydroclorid trong
70ml hỗn hợp anhydrid acetic – acid acetic (7:3), đem chuẩn độ bằng acid
percloric 0,1mol/l với chỉ thị tím tinh thể.
Phương pháp này không đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, dung môi hóa
chất đắt tiền, thực hiện dễ dàng và cũng khá nhanh, có thể thực hiện ở tất cả
các phòng thí nghiệm.
Tuy nhiên, phương pháp này có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố làm
thay đổi kết quả do ảnh hưởng của tạp chất liên quan và thành phần tá dược.
Vì vậy, phương pháp này chỉ sử dụng để định lượng các nguyên liệu.
1.1.4.2 Phương pháp quang phổ UV-VIS [8], [10], [11].
Phương pháp này dựa trên định luật Lambert – Beer, độ hấp thụ của
dung dịch một chất tỉ lệ thuận với nồng độ và bề dày của dung dịch đem đo.
Phổ hấp thụ UV – VIS của 5mg Tolperison hydrochlorid trong 500ml ethanol
95
0
có độ hấp thụ riêng tại 257nm trong khoảng 555 – 585. Do đó ta có thể
dựa vào phổ hấp thụ UV- VIS của Tolperisone hydrochlorid trong ethanol có
cực đại hấp thụ tại bước sóng 257nm để định lượng.
Phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS cũng có ưu điểm thực hiện
nhanh, dễ dàng, không đòi hỏi trang thiết bị hóa chất đắt tiền, có thể thực hiện
tại tất cả các phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, phương pháp này độ chính xác
không cao do ảnh hưởng của tạp chất liên quan và các thành phần tá dược. Vì
vậy, phương pháp này ít được áp dụng cho định lượng chế phẩm mà chủ yếu
chỉ sử dụng để định lượng các hoạt chất trong phép thử độ hòa tan của viên
nén và viên nang.
Dựa trên những ưu điểm của phương pháp HPLC và những phân tích ở
trên nên tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng Tolperison
hydrochlorid bằng phương pháp HPLC.
5
1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
thuyết được đưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký. Dưới đây là một thông
số thường dùng trong thực tế.
1.2.3.4 Hệ số phân bố
Hệ số phân bố là tỷ số giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh và nồng độ
của nó trong pha động.
Trong đó: K: Hệ số phân bố
C
s
: Nồng độ chất tan trong pha tĩnh
C
M
: Nồng độ chất tan trong pha động
1.2.3.2 Thời gian lưu
Thời gian lưu (t
R
) của một chất tan là thời gian từ lúc tiêm mẫu thử đến
khi xuất hiện giá trị cực đại của chất tan trên sắc kí đồ.
Thời gian chết (t
o
) là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống
sắc ký.
Thời gian lưu thực (t’
R
) = t
R
– t
o.
Thời gian lưu thực phụ thuộc vào bản
chất pha tĩnh, bản chất, thành phần, tốc độ, pH pha động, cấu tạo và bản chất
phân tử chất tan,
M
: Lượng chất trong pha tĩnh và trong pha động
Cần chọn cột, pha động, phân tử chất tan, pH sao cho k’ nằm trong
khoảng từ 1- 5 là tốt nhất. Nếu k’ > 5 thì thời gian phân tích sẽ kéo dài hơn,
đỉnh pic bị dãn rộng và độ nhạy tín hiệu thấp. Nếu k’ bé thì chất phân tách bị
rửa giải ở thời điểm gần với thời điểm bơm mẫu nên khả năng tách không tốt.
1.2.3.5 Hệ số chọn lọc
Hệ số chọn lọc (α) là một biểu hiện về mức độ tách giữa hai đỉnh.
)'k'(k
tt
tt
'k
'k
α
12
0R,1
0R,2
1
2
>
−
−
==
8
Để tách riêng 2 chất thường chọn α từ 1,05 đến 2,0. Lưu ý, nếu chỉ dựa
và hiệu lực tách đơn thuần chúng ta không biết được hiệu lực tách của quá
trình sắc ký.
1.2.3.6 Hiệu lực cột và số đĩa lý thuyết
Hiệu lực cột là thông số về hiệu suất phân tích của cột, được biểu hiện thông
qua số đĩa lý thuyết (N). Trong đó số đĩa lý thuyết được tính theo công thức :
1/2
: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
Khi số đĩa lý thuyết N càng lớn hiệu lực cột càng cao (đỉnh nhọn, hẹp).
N
max
= 4000. L/d
p
Trong đó:
L : Chiều dài cột
d
p
: Đường kính tiểu phân tính bằng micromet.
Số đĩa lý thuyết phụ thuộc đường kính và độ hấp thụ của pha tĩnh, tốc độ
và độ nhớt của pha động, hệ số khuếch tán của các chất trong cột.
1.2.3.7 Độ phân giải ( R )
Hệ số phân giải thể hiện hai yếu tố:
- Độ nhọn của đỉnh
- Khoảng cách giữa các đỉnh
( ) ( )
1/2,21/2,1
R,1R,2
b,2b,1
R,1R,2
tt 1,177tt 2
R
wwww
+
−
=
+
k'
x
1
x
4
N
R
+
−
=
α
α
Bộ
phận
phát
hiện
Hệ thống
gradient
Buồng
điều
nhiệt
Bình
chứa
dung
môi
Lọc
&
khử
khí
Hệ
Mục đích để bơm pha động vào cột nhằm thực hiện quá trình chia tách
sắc ký. Bơm phải tạo được áp suất cao khoảng 3000 – 6000 psi hoặc 250 –
500 at. Lưu lượng bơm từ 0,1 – 10ml/phút, và có thể thay đổi tốc độ dòng một
cách dễ dàng. Phải tạo ra dòng chảy liên tục, sự chảy dung môi không tạo ra
các xung (hoặc có bộ phận đệm xung). Đồng thời bơm phải không bị ăn mòn
bởi các thành phần pha động, tháo nắp dễ dàng.
11
1.2.4.3 Hệ tiêm mẫu
Có nhiều cách đưa mẫu vào cột như tiêm mẫu trực tiếp bằng ống tiêm
hoặc phương pháp chảy gián đoạn, cả hai phương pháp đều đơn giản ít tốn
kém, tiện lợi nhưng có khuyết điểm là độ lặp lại không cao. Ngày nay người ta
thường sử dụng van tiêm (valve – loop injector) có vòng chứa mẫu, có dung
tích xác định và chính xác, có thể thay đổi dòng với các dung tích khác nhau.
Các máy HPLC hiện nay đều sử dụng van tiêm tự động hoặc bán tự động.
1.2.4.4 Cột sắc ký
Cột sắc ký hay cột chứa pha tĩnh thường làm bằng thép không rỉ, chiều
dài cột khoảng 10 – 30 cm, đường kính trong từ 1 – 10mm, hạt nhồi cột cỡ 5 -
10μm (ngoài ra còn có một số trường hợp dặc biệt về kích thước hạt và kích
cỡ hạt…). Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc Silicagel
đã được silan hóa hoặc được bao một chất lỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra
người ta còn dùng các hạt khác như nhôm oxid, polyme xốp, chất trao đổi ion.
Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc
thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt thêm bộ phận điều nhiệt (Oven
column).
1.2.4.5 Pha động
Ái lực của một chất với pha tĩnh được điều khiển bằng độ phân cực của
pha động. Pha động có thể là dung môi đơn hoặc hỗn hợp và có thể thay đổi
độ phân cực bằng cách thay đổi tỷ lệ thành phần dung môi trong hỗn hợp.
Dựa vào pha động và pha tĩnh người ta phân loại ra thành:
- Pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động ít phân cực.
ẩm 0,10%. (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương)
- Dung môi tinh khiết dùng cho sắc ký: acetonitril, nước, dung dịch đệm
phosphat pH = 3 (pha theo DĐVN IV).
- Natri laurylsunphat tinh khiết.
- Các tá dược thường dùng cho viên nén như: lactose, titan dioxyd,
magnesi stearat, avicel, bột Talc, tinh bột ngô (đạt tiêu chuẩn DĐVN IV)
- HPMC (tiêu chuẩn USP 30)
- PEG 600 (tiêu chuẩn BP 2009).
2.2.2 Thiết bị
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao SHIMARDZU LC – 20A serises
- Cột sắc ký
- Máy đo pH 632 pH – Metter Mettrohm
- Máy lắc siêu âm Branson 5210
- Thiết bị lọc hút chân không Millipore M15 – 047 – 05
14
- Cân kỹ thuật Mettler PE 1600
- Cân phân tích Mettler Toledo 245
- Các dụng cụ: pipet, bình định mức, bình nón, phễu lọc… đạt yêu cầu
dùng cho kiểm nghiệm thuốc.
2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Nội dung nghiên cứu
2.3.1.1 Xây dựng chương trình sắc ký
- Chọn cột sắc ký.
- Lưa chọn pha động.
- Lựa chọn bước sóng thích hợp.
2.3.1.2 Thẩm định chương trình sắc ký đã xây dựng
- Tính đặc hiệu.
- Độ lặp lại của hệ thống và phương pháp.
- Độ đúng.
- Độ tuyến tính.
1
X
Độ lệch chuẩn :
( )
1n
xx
S
n
1i
2
i
−
−
=
∑
=
Sai số chuẩn :
n
S
S
X
=
Sai số thông kê :
nS/
XX
t
0
−
=
Sai số tương đối :
Copyright: Tài liệu đại học ©