MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 4
1.1. GIỚI THIỆU VỀ NẤM LỚN 4
1.1.1. Giới thiệu về nấm 4
1.1.2. Phân loại và tác dụng trị liệu của nấm Linh Chi 6
1.1.3. Nấm lớn 8
1.1.4. Nấm Linh chi 9
1.1.5. Các mẫu nấm được nghiên cứu trong đề tài 10
1.2. GIỚI THIỆU VỀ VITAMIN B1, B6 11
1.2.1. Vitamin B1 11
1.2.2. Vitamin B6 13
1.2.3. Vai trò và nhu cầu của vitamin B1, B6 đối với cơ thể 14
1.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6 16
1.3.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp 16
1.3.2. Phân loại sắc ký và ứng dụng 17
1.3.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ 19
1.3.4. Hệ thống HPLC 22
1.3.5. Chọn điều kiện sắc ký 25
1.3.6. Tiến hành đo sắc ký 28
1.3.7. Định lượng bằng phương pháp HPLC 29
CHƯƠNG 2. KĨ THUẬT THỰC NGHIỆM 37
2.1. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ 37
2.2. CHUẨN BỊ HÓA CHẤT 37
2.2.1. Yêu cầu chung 37
2.2.2. Chuẩn bị hóa chất cho phép xác định vitamin B1 37
2.2.3. Chuẩn bị hóa chất cho phép xác định vitamin B6 38
2.3. LẤY MẪU, BẢO QUẢN VÀ CHUẨN BỊ MẪU PHÂN TÍCH 39
2.3.1. Lấy mẫu và baỏ quản mẫu 39
2.3.2. Chuẩn bị mẫu phân tích 39

VIATAMIN B1, VITAMIN B6 TRONG MỘT SỐ MẪU NẤM 61
3.8.1. Xác định hàm lượng Viatamin B1 61
3.8.2. Xác định hàm lượng Viatamin B6 63
KẾT LUẬN 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
PHỤ LỤC 68
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
HPLC
High performance liquid chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
RSD
Relative standard deviation
Độ lệch chuẩn tương đối
SD
Standard deviation
Độ lệch chuẩn
LOD
Limit of detection
Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of quantification
Giới hạn định lượng
ppm

Hnh 3.2. Đồ thị khảo sát khoảng nồng độ tuyến tnh của vitamin B6 48
Hnh 3.3. Đồ thị đường chuẩn của vitamin B1 50
Hnh 3.4. Đồ thị đường chuẩn của vitamin B6 52 1
MỞ ĐẦU

Vitamin là một nhóm các hợp chất hữu cơ có phân tử bé, có cấu tạo hóa
học rất khác nhau do đó các tnh chất hóa học cũng như l học cũng khác
nhau, nhưng chúng đều giống nhau ở chỗ là rất cần thiết cho hoạt động sống
của bất kỳ cơ thể nào. Hiện nay người ta đã nghiên cứu và phân lập được trên
30 loại vitamin khác nhau, đồng thời đã nghiên cứu các thành phần, cấu tạo
và tác dụng sinh lý của chúng.
Vitamin được cung cấp vào cơ thể con người để đáp ứng nhu cầu dinh
dưỡng giúp cơ thể khỏe mạnh. Trong nhiều thế kỉ, do thiếu một số vitamin
gây nên các bệnh mù lòa (thiếu vitamin A), bệnh beri-beri (thiếu vitamin B1),
bệnh scobut (thiếu vitamin C), thiếu axit folic trong thời k thai nghén gây
khuyết tật ống thần kinh ở thai nhi. Người thiếu vitamin khi hàm lượng
vitamin trong cơ thể ở mức thấp (bệnh giảm vitamin). Trạng thái giảm
vitamin rất phổ biến ở ngay trong những người mới thoạt nhn là hoàn toàn
khoẻ mạnh. Có thể gây ra những rối loạn của hệ thần kinh. Họ dễ bị kch
thch, dễ bị mất bnh tĩnh do những nguyên nhân rất nhỏ nhặt, họ rất dễ mẫn
cảm với âm thanh của radio, đối với tiếng ồn ào của trẻ con, bị bệnh mất ngủ,
giảm khả năng lao động.
Việc cung cấp không đầy đủ vitamin cho cơ thể sẽ có ảnh hưởng xấu
không những với hệ thần kinh mà còn với một loạt cơ quan khác ở trong cơ
thể. V thế điều rất quan trọng là khẩu phần ăn của người khoẻ mạnh, và đặc
biệt là người ốm cần phải có giá trị hoàn chỉnh không những về phương diện
calo, về phương diện chất đạm mà còn về phương diện vitamin nữa. Nhiều

nấm Linh chi.
Xuất phát từ chức năng của vitamin nói chung và vitamin B1, B6 nói
riêng trong cơ thể, đồng thời góp phần vào công tác đảm bảo chất lượng nấm
dùng để làm dược liệu, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định hàm
lượng vitamin B1, B6 trong một số loại nấm Lớn lấy từ vườn quốc gia Pù
Mát - Nghệ An bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao" làm luận văn
tốt nghiệp của mnh.
1. Nhiệm vụ nghiên cứu trong luận văn:
- Xác định các điều kiện tối ưu để đo sắc đồ HPLC của B1, B6.
- Xác định hàm lượng vitamin B1, B6 theo phương pháp ngoại chuẩn. 3
- Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của
phương pháp phân tch.
- Khảo sát độ lặp.
- Xác định hiệu suất thu hồi.
- Phân tch, xử lý số liệu
- Tnh toán kết quả thực nghiệm
2. Đối tượng nghiên cứu: một số loại nấm Lớn lấy từ vườn quốc gia Pù
Mát - Nghệ An
3. Phương pháp nghiên cứu: Các kết quả nghiên cứu đã được tiến hành
bằng thực nghiệm. Phương pháp thực nghiệm được sử dụng là phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao HLC (High Performance Liquid Chromatography).
4. Những đóng góp của đề tài: đã góp phần xác định thành phần dinh
dưỡng của một số loại nấm lớn. 4
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

- Giới phụ estomycetoida
- Giới phụ nấm thật - Eumycetoida
1.1.3. Nấm lớn
Tới thời điểm hiện nay, có khoảng 2500 loài nấm đã được ghi nhận cho
lãnh thổ Việt Nam, trong số đó khoảng 1400 loài thuộc 120 chi là những loài
nấm lớn (Macro fungi). Các loài nấm Đảm (Basidiomycota) chiếm ưu thế rõ
rệt với hơn 90% tổng số loài; sau đó là nấm Nang (Ascomycota) chiếm
khoảng 8%; nấm Nhầy (Myxomycota) chiếm 1,5% và nấm Nội cộng sinh
(Glomeromycota) chiếm khoảng 0,5%. Trong ngành nấm Đảm th tuyệt đại
đa số nấm lớn thuộc ngành phụ Agaricomycotina Doweld (2001); chỉ có một
số rất t loài thuộc 2 ngành phụ Pucciniomycotina R. Baeuer, Beregow…(với
12 loài thuộc chi Septobasidium thuộc bộ Septobasidioles) và
Ustilagomycotina Doweld (2001) với các lớp thuộc Ustilagomycetes (với 2
đại diện thuộc lớp nấm Than là Ustilago maydis trên ngô và Ustilago
esculenta trên củ niễng đều ăn được) và Exobasidiomycetes (với một vài loài
thuộc chi nấm Đảm ngoài Exobasidium gây bệnh phồng lá). Trong ngành phụ
Agaricomycotina, đại đa số nấm lớn thuộc về lớp Agaricomycetes. Hai lớp
còn lại chỉ có số lượng loài rất khiêm tốn là Tremellomycetes (17 loài thuộc
bộ Tremellales) và lớp Dacrymycetes ( với 5 loài thuộc bộ Dacrymycetales).
Trong lớp Agaricomycetes, các bộ có số lượng loài nhiều nhất là
Aphyllophorales sensu lato (hơn 300 loài), Agaricales sensu lato (gần 300
loài), Boletales (gần 60 loài), Russulales (gần 40 loài). Các bộ có t loài nhất
là Hymenogastrales (1 loài), Ceratiomycetales (1 loài).
1.1.4. Nấm linh chi
Nấm linh chi, tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm lim
(Ganodermataceae). Nấm linh chi còn có những tên khác như Tiên
thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung. 6

Giá trị dược lý của Linh chi càng được khẳng định khi Hội nghị nấm
học thế giới thành lập Viện nghiên cứu Linh chi Quốc tế tại New Yord. Qua
phân tích về các mặt dược tnh, dược lý và sử dụng nấm Linh chi, người ta
thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh như: bệnh tim mạch, hô hấp,
tăng khả năng miễn dịch, trị bệnh gan, có hiệu quả trong chống ung thư, khả
năng kháng HIV…, ngoài ra các hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi có khả
năng khử một số gốc tự do sinh ra trong quá trnh lão hóa cơ thể hay do nhiễm
xạ. Chúng làm phục hồi các tổ chức bị tổn thương và không gây hiệu ứng phụ
nào cho cơ thể.
Nấm Linh Chi cơ bản có các loại như sau:
 Hoàng Chi (còn gọi là Kim Chi). Nấm có màu vàng, vị ngọt, không
độc, tnh bnh, an thần, ch t kh.
 Bạch Chi (còn gọi là Ngọc Chi). Đây là loại nấm Linh Chi màu
trắng, có vị cay, tnh bnh, không độc, ch phổi, thông mũi, an thần, trị ho
nghịch hơi.
 Thanh chi (còn gọi là Long Chi). Nấm này có màu xanh, tnh bnh, vị
chua.Tác dụng làm sáng mắt, ăn thần, tăng tr nhớ, bổ gan kh. 8
 Hắc chi (còn gọi là Huyền Chi). Nấm có màu đen, vị mặn, tnh bnh,
không độc. Tác dụng trị chứng b tiểu, ch thận kh.
 Tử chi (còn gọi là Mộc Chi). Nấm này có màu tm, vị ngọt, tnh bnh,
không độc. Trị các chứng đau nhức xương khớp và gân cốt.
 Linh Chi đỏ (còn gọi là Xch Chi, Đơn Chi, Hồng Chi). Nấm có màu
đỏ tươi khi còn non, trưởng thành có lớp bào tử màu nâu trên bề mặt. Nấm có
vị đắng, không độc, tnh bnh, tăng tr nhớ, dưỡng tim, bổ gan, chữa bệnh tiểu
đường, huyết áp và tim mạch.
Mặc dù có tới 6 loại nấm Linh Chi khác nhau, nhưng tất cả được phân
loại theo màu sắc, y học coi nấm Linh Chi đỏ là loại có dược tnh đa dạng và

hoạt chất và xác định tác dụng dược lý của nấm linh chi như: Germanium,
acid ganoderic, acid ganodermic, acid oleic, ganodosteron, ganoderans,
adenosin, beta-D-glucan, (đặc biệt trong nấm Linh chi, có hàm lượng
germanium cao hơn trong nhân sâm đến 5 - 8 lần). Các nhà khoa học Việt
Nam tm thấy trong nấm Linh chi có chứa 21 nguyên tố vi lượng cần thiết cho
sự vận hành và chuyển hóa của cơ thể như: đồng, sắt, kalium, magnesium,
natrium, calcium.
Sau đây là những thành phần hóa học chính của nấm Linh chi:
- Hợp chất đa đường (45% số lượng): arabinogalactane, beta-D-
glucane; ganoderane A, B, C.
- Triterpene: axit ganoderic A, B, C, D, F, H, K, M, R, S, và Y.
- Ganodermadiol phân sinh của loại axit lanostaoic.
- Esteroides: Ganodosterone.
- Axit béo chưa bão hòa
- Chất đạm protide: Ling Zhi-8, glycoproteine (lactine).
- Khoáng chất: Ca, Ge, Co, Mg, Fe, Mn, Zn, Be, Cu, Ag, Al, Na…
- Những chất khác: manitole, adenine, trechalose, uracine, lysine…
Qua phân tch về các mặt dược tnh, dược lý và sử dụng nấm Linh chi,
người ta thấy Linh chi có tác dụng rất tốt với các bệnh như: bệnh tim mạch,
hô hấp, tăng khả năng miễn dịch, trị bệnh gan, có hiệu quả trong chống ung
thư, khả năng kháng HIV…, ngoài ra các hoạt chất sinh học trong nấm Linh
chi có khả năng khử một số gốc tự do sinh ra trong quá trnh lão hóa cơ thể 10
hay do nhiễm xạ. Chúng làm phục hồi các tổ chức bị tổn thương và không gây
hiệu ứng phụ nào cho cơ thể.
1.1.5. Các mẫu nấm được nghiên cứu trong đề tài

MN 206: Ganoderma triangulatum MN 205: Phellinus melanodermus

12
H
17
N
4
OS
+
Cl
-
.HCl
• Khối lượng phân tử: 337.27
• pKa
1
=4.8, pKa
2
=9.0
• Công thức cấu tạo: 12

Ngoài ra thiamin còn tồn tại dưới dạng photphat este gồm
thiaminmonophotphat (TMP), thiamin triphotphat (TTP), thiamin
pyrophotphat (TPP) là dạng mà vị trí OH sẽ được đnh vào hoặc 1, 2 hoặc 3
gốc photphat (R).
1.2.1.1. Tính chất vật lý
Vitamin B1 là những tinh thể trắng hình kim hay ở dạng vẩy, có mùi

N
H
3
C
NH
2

CH
2

N
CH
3

CH
2
CH
2
OH

Thiamin
H
3
C
N
CH
3

CH
2

2
= 4.8
• Công thức cấu tạo: Vitamin B6 tồn tại trong cơ thể ở 3 dạng khác
nhau: Piridoxol, Pyridoxal, Pyridoxamin. Ba dạng này có thể chuyển hoá
lẫn nhau. 1.2.2.1. Tính chất vật lý
Vitamin B6 là tinh thể không màu, vị hơi đắng, hòa tan tốt trong nước
và trong rượu, chịu nhiệt, nhạy cảm với ánh sáng, pyridoxin bazơ có nhiệt độ
nóng chảy ở 160
0
C, pyridoxin hydrochloric nóng chảy ở 204 -206
0
C, bền
vững khi đun nóng. Bền khi đun sôi trong axit hay kiềm, không bền trong môi
trường có tính oxy hóa.
Vitamin B6 nhạy cảm với ánh sáng, chúng phân hủy nhanh khi chiếu
sáng ở môi trường kiềm hay trung tính, còn trong môi trường axit thì
pyridoxin, pyridoxan và pyridoxamin bền hơn. Tính chất vật lý của vitamin
B6 được tóm tắt ở bảng dưới. 14
Bảng 1.1: Tính chất của 3 dạng vitamin B6
Tên hoạt chất
Pyridoxin.HCl
Pyridoxan.HCl
Pyridoxamin.HCl
KLPT

160
226 - 227
λmax (nm)
292; 290; 253
390; 318
328; 253
1.2.2.2. Tính chất hóa học của vitamin B6
Tất cả 3 chất trên đều có tnh bazơ do nhân pyridin gây ra tác dụng với
các axit tạo thành muối. Chế phẩm dược dùng là pyridoxin hydroclohidrat dễ tan
trong nước, tạo muối, kết tủa với axit silicovonframic, axitphotphovonframic, dễ
hòa tan trong các dung dịch kiềm.
Vitamin B6 dễ bị oxy hóa, tác nhân xúc tác quá trình này là ánh sáng
tia tử ngoại, vitamin B6 tác dụng với Fe (III) cho muối phức màu đỏ. Vitamin
B6 ở dạng dẫn xuất photphat như pyridoxan photphat tham gia nhóm ngoại
(coenzyme) của nhiều men như: transaminase, decacboxylase, dehydro
desylfuarase… tham gia trong các quá trnh chuyển hóa axit amin, lipid,
glucid, chuyển protein sang glucid.
Vitamin B6 giữ vai trò đặc biệt trong chuyển hóa acid amin:
COOH CH
3
COOH CH
3
CHNH
2
CO CO CHNH
2
CH
2
COOH CH
2

trạng thái sinh lý của cơ thể, chế độ thức ăn, làm việc… Trung bnh cơ thể
người cần từ 200mcg -1,3 mg vitamin B1/ngày.
 Vitamin B6
- Vitamin B
6
là một loại vitamin hòa tan trong nước và là một phần của
nhóm vitamin B. Vitamin B
6
hoạt động như một coenzym giúp chuyển hóa
tryptophan thành niacin.
- Nó còn đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa chất đạm, chất
béo, carbohydrate. Vitamin B
6
tham gia vào quá trnh tổng hợp hemoglobin
và sự bài tiết của tuyến thượng thận.
- Vitamin này còn cần thiết cho phản ứng lên men tạo glucose từ
glycogen, góp phần duy tr lượng đường huyết trong máu ổn định; giúp
bảo vệ tim mạch, tăng cường hệ miễn dịch và duy tr chức năng não
khỏe mạnh. 16
- Thiếu hụt vitamin B6 có thể dẫn đến thiếu máu nguyên bào sắt, viêm
dây thần kinh ngoại vi, viêm da, tăng bã nhờn, khô nứt môi. Vitamin B6 dùng
điều trị nhiễm độc isoniazid hoặc cycloserin.
- Lượng vitamin khuyến cáo dùng mỗi ngày khác nhau tùy theo giới
tnh và độ tuổi và sẽ ngày càng tăng khi già đi. Trung bnh cơ thể người cần từ
100mcg -2,0 mg vitamin B6/ngày.
1.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN B1, B6
Hiện nay có nhiều phương pháp để nghiên cứu xác định hàm lượng

dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một
chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ.
Quá trnh sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân
loại theo kch cỡ (Rây phân tử).
Trong luận văn này chúng tôi sử dụng Hệ thống sắc ký Alliance với
bơm 2690, detector huỳnh quang 2475 (Hãng Waters, Mỹ)
1.3.2. Phân loại sắc ký và ứng dụng
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trnh sắc
ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ th ta có sắc ký hấp phụ pha
thuận hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion th ta có Sắc ký trao đổi
ion. Nếu pha tĩnh là chất lỏng th ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết. Nếu
pha tĩnh là Gel th ta có sắc ký Gel hay Rây phân tử. Cùng với pha tĩnh để rửa
giải chất phân tch ra khỏi cột chúng ta cần có một pha động. Như vậy, nếu
chúng ta nạp mẫu phân tch gồm hỗn hợp chất phân tch A, B, C Vào cột
phân tch, kết quả các chất A, B, C sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua
cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác
F1, F2 và F3.
Chất phân tích A + B + C 18

F1 F2

Pha tĩnh Pha động

F3

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi
cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại.

sắc ký đồ. Từ các thông số của các pic, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết
được đưa ra để đánh giá một quá trnh sắc ký. Dưới đây là một số đại lượng
thường dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lợi cho quá
trnh phân tch sắc ký.
1.3.3.1. Thời gian lưu: Retention time (t
R
)
Thời gian lưu của một chất là thời gian tnh từ khi bơm mẫu vào cột
cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại. Thời gian lưu của mỗi chất
là hằng định và các chất khác nhau có thời gian lưu khác nhau trên cùng một
điều kiện sắc ký đã chọn. V vậy, thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định
tnh các chất.Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
- Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
Một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động.
Trong một phép phân tch nếu t
R
nhỏ quá th sự tách kém, còn nếu t
R
quá lớn th
peak bị dãn và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tch rất dài đồng thời
kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chnh xác của
phép phân tch kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên.
1.3.3.2. Hệ số dung lượng K
’
- Hệ

số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó
trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong

nhỏ th t
R
cũng nhỏ và sự tách kém. K
’
lớn th pic bị loãng, độ
nhạy kém. Trong thực tế K
’
từ 1 đến 5 là tối ưu.
1.3.3.3. Độ chọn lọc


Độ chọn lọc

cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc k. Khi hai chất
A, B có K
’
A
và K
’
B
khác nhau th mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị
ở độ chọn lọc


α = K’
A
/K’
B
(K
’
















b
RRR
w
t
w
tt


Trong đó: t
R
là thời gian lưu của chất phân tch
W
0,5
là độ rộng tại điểm ½ của peak
1.3.3.5. Độ phân giải R (Resolution)