BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
LÊ THỊ DUNG
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH GLUCOSAMIN
TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI DETECTOR
TÁN XẠ BAY HƠI (HPLC-ELSD) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGHỆ AN - 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH LÊ THỊ DUNG
Gia đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành đề tài này.
ThS. Vũ Thị Kim Oanh, ThS.Vũ Thị Trang cùng toàn thể các anh
chị trong labo Hóa độc đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên tôi trong
suốt quá trình làm thực nghiệm.
Các thầy, cô giảng dạy tại khoa Hóa học, đặc biệt là các thầy cô trong
bộ môn Hóa Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho
tôi học tập và nghiên cứu trong môi trường khoa học, hiện đại.
Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã quan
tâm động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Vinh, tháng 10 năm 2014
Học viên
Lê Thị Dung
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng 3
1.1.1. Định nghĩa thực phẩm chức năng 3
1.1.2. Tên gọi 5
1.1.3. Phân biệt thực phẩm chức năng 5
1.2. Giới thiệu về glucosamin 8
1.2.1. Cấu tạo, tính chất các dạng tồn tại của glucosamin 8
1.2.2. Quy trình điều chế Glucosamin hydroclorua 10
1.2.3. Tác dụng dược lý của glucosamin 11
1.2.4. Tình hình sử dụng glucosamin trong nước và trên thế giới 12
1.3. Các phương pháp tạo dẫn xuất của glucosamin 15
1.4. Các phương pháp xác định glucosamin 17
1.5. Phương pháp HPLC-ELSD 28
1.5.1. Nguyên tắc hoạt động 28
Bảng 1.3. Cấu tạo và tính chất các dạng tồn tại của glucosamin 8
Bảng 1.4. Các phương pháp xác định glucosamin 18
Bảng 3.1. Rửa giải chất phân tích theo chế độ đẳng dòng 47
Bảng 3.2. Khảo sát chương trình gradient 49
Bảng 3.3. Khảo sát nhiệt độ ống bay hơi 52
Bảng 3.4. Khảo sát tốc độ dòng khí mang 54
Bảng 3.5. Các điều kiện tối ưu xác định glucosamin bằng phương
pháp HPLC-ELSD 56
Bảng 3.6. Đánh giá độ lặp lại của thiết bị 57
Bảng 3.7. Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký vào nồng độ glucosamin 58
Bảng 3.8. Độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu TPCN dạng viên
nang cứng 60
Bảng 3.9. Độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu TPCN dạng viên
nang dầu 60
Bảng 3.10. Độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu TPCN dạng viên
nang mềm 61
Bảng 3.11. Kết quả xác định chuẩn Fisher của 2 phương pháp HPLC
ELSD và AOAC 2005.01 61
Bảng 3.12. So sánh hai phương pháp HPLC-ELSD và phương pháp
tiêu chuẩn OAC 2005.01 62
Bảng 3.13. Kết quả phân tích glucosamin trong các mẫu thực phẩm
chức năng 63
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các dạng cấu trúc hóa học của glucosamin 9
Hình 1.2. Bệnh thoái hóa khớp ở người 11
Hình 1.3. Một số thực phẩm chức năng có chứa glucosamin 15
Hình 1.4. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 29
Hình 1.5. Cấu tạo của detector ELSD 31
Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu không chứa chất béo 39
Hình 3.7. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm với thành phần pha
động H
2
O:ACN theo chương trình gradient 3 50
Hình 3.8. Sắc đồ chuẩn glucosamin 13000ppm với thành phần pha
động H
2
O:ACN theo chương trình gradient 4 51
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nhiệt độ
ống hóa hơi 53
Hình 3.10. Sắc đồ xác định glucosamin bằng HPLC-ELSD, nhiệt độ
ống bay hơi 55
o
C 53
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào tốc độ
dòng khí mang N
2
55
Hình 3.12. Sắc đồ xác định glucosamin bằng HPLC-ELSD, tốc độ
dòng khí mang 30psi 55
Hình 3.13. Sắc đồ glucosamin đánh giá độ lặp lại của thiết bị 57
Hình 3.14. Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký vào nồng độ
glucosamin từ 5,2mg/ml đến 26,0 mg/ml 58
Hình 3.15. Sắc đồ của glucosamin tại giới hạn phát hiện 59 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT
Kí hiệu
Tiếng Anh
High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
NP-
HPLC
Normal phase high performance
liquid chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
pha thuận
RP-
HPLC
Reversed phase high
performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
pha đảo
ICH
International Conference on
Harmonization
Hội đồng hòa hợp quốc tế
IFIC
International Food Information
Council
Hiệp Hội thông tin
thực phẩm quốc tế
ILSI
International Life Science
Institute
Viện khoa học và đời sống
và thực phẩm Hoa Kỳ
UV
Ultraviolet
Tia cực tím 1
MỞ ĐẦU
Ngày nay, khi cuộc sống của con người ngày càng được nâng cao thì
mối quan tâm đến sức khỏe cũng càng được chú trọng nhiều hơn. Tuy nhiên,
do phải bắt nhịp với thời đại công nghiệp hóa khiến con người bận rộn hơn,
thời gian luôn eo hẹp, đôi khi không đủ để chăm sóc chu đáo cho bản thân. Vì
vậy, con người bắt đầu tìm đến những sản phẩm, dịch vụ chăm sóc sức khỏe
tốt nhất, nhanh nhất và tiện dụng nhất. Chính vì thế, thực phẩm chức năng là
một trong những lựa chọn đầu tiên mà con người hướng tới. Nhưng thực tế
hiện nay, việc hiểu biết và sử dụng đúng thực phẩm chức năng còn rất hạn
chế. Đặc biệt là các sản phẩm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị các bệnh
về xương khớp.
Theo định nghĩa của Bộ Y tế, thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng
để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể con người, có tác dụng dinh
dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt
nguy cơ bệnh tật. Một số nhà kinh doanh và sản xuất đã lợi dụng lòng tin của
người tiêu dùng nên đã thổi phồng quá mức tác dụng của thực phẩm chức
năng khiến không ít người coi thực phẩm chức năng như là “thần dược” chữa
bách bệnh.
Glucosamin là một amino-mono-saccharid có nguồn gốc nội sinh, giúp
tổng hợp glycosaminoglycan cấu tạo nên mô sụn trong cơ thể. Có 3 dạng
glucosamin dùng trong điều trị là glucosamin sulfat, glucosamin hydroclorua
về thực phẩm chức năng (TPCN), mặc dù đã có nhiều Hội nghị quốc tế và
khu vực về thực phẩm chức năng. Mặc dù thuật ngữ “Thực phẩm chức
năng”, chưa có một định nghĩa thống nhất quốc tế, nhưng được sử dụng rất
rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới. Gần đây các định nghĩa về thực phẩm
chức năng được đưa ra nhiều hơn và có xu hướng gần thống nhất với nhau.
Khái niệm Thực phẩm chức năng (Functional foods) được người Nhật
sử dụng đầu tiên trong những năm 1980 để chỉ những thực phẩm chế biến có
chứa những thành phần tuy không có giá trị dinh dưỡng nhưng giúp nâng cao
sức khỏe cho người sử dụng. [18, 31]
Các nước châu Âu, Mỹ, Nhật đưa ra định nghĩa thực phẩm chức năng
là một loại thực phẩm ngoài 2 chức năng truyền thống là: cung cấp các chất
dinh dưỡng và thoả mãn nhu cầu cảm quan, còn có chức năng thứ 3 được
chứng minh bằng các công trình nghiên cứu khoa học như tác dụng giảm
cholesterol, giảm huyết áp, chống táo bón, cải thiện hệ vi khuẩn đường ruột…
Hiệp Hội thực phẩm sức khoẻ và dinh dưỡng thuộc Bộ Y tế Nhật Bản
định nghĩa: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm bổ sung một số thành phần
có lợi hoặc loại bỏ một số thành phần bất lợi. Việc bổ sung hay loại bỏ phải
được chứng minh và cân nhắc một cách khoa học và được Bộ Y tế cho phép
xác định hiệu quả của thực phẩm đối với sức khoẻ”.
Viện Y học thuộc viện Hàn lâm Khoa học Quốc gia Mĩ, định nghĩa
“Thực phẩm chức năng là thực phẩm mang đến nhiều lợi ích cho sức khoẻ, là
bất cứ thực phẩm nào được thay đổi thành phần qua chế biến hoặc có các
4
thành phần của thực phẩm có lợi cho sức khoẻ ngoài thành phần dinh dưỡng
truyền thống của nó”.
Theo Viện khoa học và đời sống quốc tế (ILSI) thì thực phẩm chức
năng là thực phẩm có lợi hay có hại, cho một hay nhiều hoạt động của cơ thể,
như cải thiện tình trạng sức khỏe và làm giảm nguy cơ măc bệnh hơn là so với
giá trị dinh dưỡng mà nó mang lại.
có các tên gọi khác nhau:
+ Việt Nam và nhiều nước khác (như Nhật Bản, Hàn Quốc ):
(1) Thực phẩm chức năng-Functional foods
(2) Thực phẩm bổ sung (vitamin vа khoáng chất) - Food Supplement.
(3) Sản phẩm bảo vệ sức khoẻ - Health Produce
(4) Thực phẩm đặc biệt - Food for Special use.
(5) Sản phẩm dinh dưỡng y học - Medical Supplement.
+ Mỹ: Dietary Supplement (thực phẩm bổ sung) và Medical
Supplement (thực phẩm y học hay thực phẩm điều trị).
+ EU: Thực phẩm bổ sung (giống như thuật ngữ Dietary Supplement
của Mỹ) hoặc thực phẩm thuốc (Nutraceuticals).
+ Trung Quốc: Sản phẩm bảo vệ sức khoẻ hay được dịch nguyên bản là
Thực phẩm vệ sinh. Chức năng của các sản phẩm nаy rất rộng, bao gồm cả
Dietary Supplement (Thực phẩm bổ sung) và Medical Supplement (Thực
phẩm y học hay Thực phẩm điều trị)
1.1.3. Phân biệt thực phẩm chức năng
1.1.3.1. Phân biệt thực phẩm chức năng và thực phẩm truyền thống
6
Bảng 1.1. Phân biệt thực phẩm chức năng
và thực phẩm truyền thống [18, 32]
TT
Tiêu chí phân biệt
Thực phẩm truyền thống
Thực phẩm chức năng
1
Chức năng
- Cung cấp các chất dinh
dưỡng
- Thỏa mãn về nhu cầu
5
Đối tượng sử
dụng
Mọi đối tượng
- Mọi đối tượng
- Có định hướng cho các
đối tượng: Người già, trẻ
em, phụ nữ mãn kinh…
6
Nguồn gốc
nguyên liệu
Nguyên liệu thô từ thực
vật, động vật (rau, củ, quả,
thịt, cá, trứng…) có nguồn
gốc tự nhiên.
- Hoạt chất, chất chiết từ
thực vật, động vật và vi
sinh vật (nguồn gốc tự
nhiên)
7
Thời gian và
phương thức dùng
- Thường xuyên, suốt đời
- Khó sử dụng cho người
ốm, già, bệnh lý đặc biệt.
- Thường xuyên, suốt đời
- Có sản phẩm cho các
đối tượng đặc biệt
7
- Hỗ trợ điều trị
- Là thuốc
- Điều trị
3
Sản xuất theo
- Luật thực phẩm
- Tiêu chuẩn thực phẩm
- Luật Dược
- Tiêu chuẩn thuốc
4
Hàm lượng hoạt
chất
Không quá cao so với nhu cầu
sinh lý hàng ngày của cơ thể
- Cao
5
Điều kiện sử dụng
Người tiêu dùng có thể tự mua
ở cửa hàng và tự dùng theo
hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Phải có chỉ định, kê đơn
của bác sĩ.
6
Đối tượng dùng
- Người chưa có bệnh
- Người bệnh
- Người bệnh
7
Điều kiện phân
phối
Bảng 1.3. Cấu tạo và tính chất các dạng tồn tại của glucosamin [22, 34]
TT
Dạng tồn tại
Công thức phân tử, khối
lượng phân tử (g/mol)
và công thức cấu tạo
Tính chất hóa lý
1
Glucosamin tự do
Tên khoa học:
(3R,4R,5S,6R)-3-amino-6-
(hydroxymethyl) oxane-2,4,5-
triol
Tên gọi khác: 2-amino-2-
deoxy-D-glucose; 2-amino-2-
deoxy-β-D-glucopyranose;
chitosamine
C
6
H
13
O
5
N;179,17
Là chất rắn dạng tinh
thể, không màu,
không mùi
Khối lượng riêng:
1.563 g/mL
H
13
O
5
N.HCl;215,63 Chất rắn dạng tinh thể
màu trắng, không màu
Nhiệt độ nóng chảy:
190-194
o
C hoặc
300
o
C
Tan được trong nước
0,1g/ml
9
3
Glucosamin sulfat
Tên khoa học:2-amino-2-
deoxy-D- glucose sulfat; D-
glucosamin sulfat C
6
H
C. Tan
được trong nước
0,1mg/l Hình 1.1. Các dạng cấu trúc hóa học của glucosamin
Một số phản ứng của glucosamin:
Phản ứng tráng bạc:
10
Phản ứng với Cu(OH)
2
:
Sản phẩm có mà xanh nhạt
Phản ứng với C
6
H
5
CH=O, xác nhận sự có mặt của NH
2
, tạo ra sản phẩm dưới
dạng keo sánh màu nâu.
1.2.2. Quy trình điều chế Glucosamin hydroclorua
Quy trình 1:
Để khử khoáng, vỏ tôm được ngâm trong HCl 10%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở
nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ, sau đó vớt ra rửa sạch đến pH=7. Khử
Glucosamin, một đường amino, là tiền chất trong quá trình tổng hợp
sinh hoá để tạo ra proteoglycan và collagen, đây là những chất cơ bản kích
thích quá trình tạo sụn ở khớp Glucosamin đồng thời ức chế enzym phá hủy
sụn khớp như collagenase, phospholipase A2 và giảm các gốc tự do
superoxide phá hủy các tế bào sụn. Nhờ tác dụng của glucosamin trên sự
chuyển hoá sụn, nó có thể giúp cho cơ thể hồi phục lại sụn bị tổn thương hay
bị ăn mòn. Ngoài ra glucosamin còn kích thích sinh mô liên kết của xương,
giảm triệu chứng mất calci ở xương, làm tăng sản sinh chất nhầy ở dịch khớp.
Do glucosamin làm tăng sản xuất chất nhầy dịch nhớt nên tăng độ nhớt,
khả năng bôi trơn của dịch khớp, vì thế không những làm giảm triệu chứng
của thoái hóa khớp (đau, khó vận động) mà còn ngăn chặn quá trình thoái hóa
khớp, ngăn chặn bệnh phát triển. Khi thiếu glucosamin thì sụn đặc biệt là sụn
khớp háng, đầu gối bị hỏng, cứng, tạo gai xương gây biến dạng khớp làm hạn
chế vận động, dẫn đến bênh viêm khớp xương phát triển (hình 1.2). [2, 22]
Hình 1.2. Bệnh thoái hóa khớp ở người
12
Tác dụng dược động học của glucosamin
Glucosamin sulfat được hấp thụ hoàn toàn sau khi uống (qua nghiên
cứu cho thấy thuốc được hấp thu 90-98%), khi bị hấp thu vào dạ dày, muối
glucosamin sulfat bị ion hóa hoàn toàn do nồng độ tương đối lớn axit
clohydric (pH = 1-3) sẵn có trong dạ dày. Glucosamin nhanh chóng khuếch
tán vào mô và kết hợp với protein huyết thanh và những cấu trúc sinh học của
cơ thể. Nồng độ cực đại của glucosamin trong huyết tương có thể đạt đến sau
uống 1,5gam, thuốc tiêm 400mg/3ml và viên thuốc sủi. Thuốc thường được
dùng trong điều trị thoái hóa khớp gối, háng, tay, cột sống, vai, trong viêm
quanh khớp, loãng xương, gãy xương, teo khớp, viêm khớp cấp và mạn tính.
Uống thuốc 15 phút trước bữa ăn, thuốc không gây rối loạn dạ dày, ruột.
Vì có bản chất tự nhiên nên glucosamin ít gây dị ứng và độc hại, không
gây rối loạn tiêu hoá và có thể điều trị lâu dài. Liều khuyến cáo là 1250 mg
đến 1500 mg glucosamin/ngày, chia làm 3 lần. Ngoài ra, nếu kết hợp với
chondroitin thì liều được khuyên dùng là 1200mg chia 3 lần/ngày. Thời gian
dùng tùy theo chủ thể, ít nhất dùng liên tục trong 2 đến 3 tháng để đảm bảo
hiệu quả điều trị. Thuốc không được dùng (chống chỉ định) trong trường hợp
dị ứng với glucosamin sulfat. Thận trọng dùng cho phụ nữ có thai và người
đái tháo đường vì thử nghiệm trên động vật có biểu hiện làm gia tăng đề
kháng insulin. [9]
Glucosamin tác động vào cơ chế sinh bệnh của thoái hóa khớp, điều trị các
bệnh thoái hóa xương khớp cả cấp và mãn tính, cải thiện chức năng khớp và ngăn
chặn bệnh tiến triển, cấu trúc sụn khớp. Từ tuổi 45 - 50 trở lên bệnh có chiều
hướng tăng (27% ở tuổi 60-70, 45% ở tuổi 80). Đối tượng nguy cơ dễ mắc bệnh
khớp nhất là người già, người béo phì, người bị chấn thương khớp, có dị tật bẩm
sinh, bệnh về chuyển hóa, di truyền hoặc bị xáo trộn về kích tố.
Những năm gần đây, glucosamin được dùng rộng rãi trong điều trị
viêm khớp, thoái hóa khớp. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của tiến sĩ Ronal
14
Tallarida thuộc trường Đại Học Y khoa Temple, Philadelphia (Mỹ) cho thấy
nếu sử dụng glucosamin đơn độc sẽ ko có hiệu quả chống đau. Nhưng nếu kết
hợp với một loại thuốc nhóm kháng viêm không steroid (NSAID) thì tác dụng
chống đau, chống viêm tăng lên rất nhiều.
Thực tế lâm sàng cho thấy nó mang lại nhiều ưu điểm trong điều trị hơn
hẳn các thuốc NSAID. Nhược điểm của NSAID là có nhiều tác dụng phụ, còn
khi sử dụng glucosamin thì lại rất ít tác dụng phụ. Một vài dị ứng không đáng
trong quá trình xử lý mẫu rất khó để tách và làm sạch nó từ các nền mẫu phức
tạp đặc biệt là các dung dịch sinh học. Mặt khác, glucosamin không có các
nhóm mang màu mạnh, hấp thụ yếu trong vùng tử ngoại. Vì vậy, để tăng
cường khả năng hấp thụ (phân tích bằng phương pháp HPLC-UV, PDA), hấp
phụ trên pha đảo và tăng độ nhạy của phương pháp phân tích, người ta tiến
hành dẫn xuất hóa glucosamin (qua nhóm amino) với các thuốc thử: 9-
fluorenylmethyl chloroformat (FMOC-Cl), 1-napthyl isothiocyanate (NITC),
phenylisothiocyanat (PITC), 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamat
(AQC), axit 8-aminopyrenesulfonic (APTS), o-phthalaldehyd /acid 3-
mercaptopropionic (OPA/3-MPA) và N-(9-fluorenyl-methoxycarbonyloxy)
succinimid (FMOC-Su). [21, 26]
Copyright: Tài liệu đại học ©