ĐẶT VẤN ĐỀ
Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) là một
thuốc diệt cỏ hiện đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam. Tuy
nhiên, paraquat (PQ) lại là một chất hóa học vô cùng độc với
người. Tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong
những năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không
ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùng nghiêm trọng. Tỉ
lệ tử vong do ngộ độc PQ rất cao, thường khoảng 70-80%.
Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm
định lượng PQ trong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan
trọng, giúp xác định mức độ nặng của ngộ độc, tiên lượng bệnh
nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị,
đặc biệt là lọc máu hấp phụ. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài “Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu
huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao” với hai mục tiêu:
1.

Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat
trong huyết tương người và phân tích bằng HPLC để
định lượng paraquat.

2.

Xác định giá trị sử dụng của phương pháp và áp dụng
định lượng paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngộ

Vũ Anh Phương

1
nhiên

Trường ĐHKH Tự


Chen Lu và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao để xác định PQ trong huyết thanh người. Pha
động acetonitrile-đệm (10:90), dung dịch đệm chứa natri
heptanesulfonate 0,02 M và acid phosphoric 0,26 M, điều chỉnh
pH đến 2,0 bằng triethylamine. Tốc độ dòng 1,2 ml/phút, bước
sóng phát hiện 256 nm, nhiệt độ cột 40oC. Đường chuẩn tuyến
tính với nồng độ PQ huyết thanh từ 0,1 - 40 mg/l (r = 0,9999).
Giới hạn phát hiện là 0,1 mg/l (S/N = 3).
Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích
Paraquat
Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của
phương pháp định lượng đó là phương pháp xử lý mẫu.
Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để
xử lý mẫu sinh học trong phân tích PQ. Một số tác giả dùng
đệm phosphate để thêm vào mẫu thử trước khi cho qua cột chiết
pha rắn.
Kyoko KATO, P. Paixão đều dùng acid perchloric để loại
protein. Tuy nhiên, một số công trình khác sử dụng acid
trichloracetic để kết tủa protein trong mẫu huyết tương rất đơn
giản và cho hiệu quả cao vì vậy có thể áp dụng rộng rãi ở các
đơn vị xét nghiệm.

Vũ Anh Phương

3
nhiên


Chất chuẩn Paraquat dichloride.x-hydrate của hãng Sigma
- Aldrich độ tinh khiết 99,5%.

Vũ Anh Phương

4
nhiên

Trường ĐHKH Tự


2.2.2. Thiết bị,
-

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, detector mảng
Diode (DAD), thư viện phổ độc chất sử dụng detector mảng
Diode.Cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm)
và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm).
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat.
2.3.1.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn
2.3.1.2. Phương pháp tách PQ từ huyết tương
Để đánh giá khả năng tách PQ ra khỏi nền mẫu huyết
tương, các mẫu chuẩn chiết PQ trong nền mẫu được chuẩn bị
bằng cách cho TCA, lắc xoáy, ly tâm, lọc rồi chạy sắc ký. Dựa
trên tR, AS, RSD đánh giá tính phù hợp của điều kiện đo.
* Cột sắc ký: sử dụng cột pha đảo Agilent C8 (150 mm x
4,6 mm; 5 µm) và cột bảo vệ C8 (20 mm x 4,0 mm, 5 μm).
* Bước sóng (λ): trong khoảng 210 - 400 nm theo máy sắc
ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200, detector DAD.

tối ưu.
2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ trong huyết tương

- Tính chọn lọc
- Khoảng nồng độ tuyến tính
Vũ Anh Phương

6
nhiên

Trường ĐHKH Tự


- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
- Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại)
- Độ ổn định
2.3.3. Phân tích PQ trong mẫu huyết tương bệnh nhân - áp
dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu
quả lọc máu hấp phụ

- Đối tượng nghiên cứu: 31 bệnh nhân ngộ độc PQ điều trị tại
Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai từ tháng 3 đến
tháng 5 năm 2015.
-

Thu thập các số liệu bệnh nhân khi nhập viện từ bệnh án

-

Lấy mẫu định lượng PQ huyết tương khi vào viện, trước và

nhiên

Trường ĐHKH Tự


Kết quả khảo sát cho thấy sử dụng hệ pha động ACN
- đệm (5:95, v/v) pha tĩnh cột C8 là phù hợp nhất, có khả
năng tách tốt và chọn lọc đối với PQ trong huyết tương, cho
pic cân đối và có thời gian lưu hợp lý.
3.1.4. Khảo sát thành phần pha động
-

Pha động: ACN – Đệm (5:95, v/v). Đệm gồm 1,10 g natri
heptanesulfonate; 2,00 g KCl; 2,00 ml polyethylenglycol
400; 0,05% triethylamine; 200 ml MeOH; thêm nước xấp
xỉ 1000 ml. Điều chỉnh pH đến 2,5 bằng dung dịch H3PO4
đặc. Định mức vừa đủ 1000 ml bằng nước deion.

-

Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.

3.1.5. Đường chuẩn, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
Kết quả trên cho thấy, sự phụ thuộc diện tích pic vào
nồng độ PQ có sự tuyến tính trong khoảng từ 0,05 µg/ml đến
10 µg/ml. Trong khoảng nồng độ này, phương trình đường
chuẩn có dạng y = 0,84 + 205,06x với hệ số số tương quan R 2 =
0,9999.
b
205,06

Hình 2: Độ chọn lọc PQ của phương pháp

Vũ Anh Phương

10
nhiên

Trường ĐHKH Tự


Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng tại vị trí tương
ứng với thời gian lưu của PQ không xuất hiện pic lạ. Sắc ký đồ
huyết tương có PQ cân đối, sắc nét, tách riêng biệt. Kết quả trên
xác nhận phương pháp vừa xây dựng có tính chọn lọc tốt đối
với PQ.
3.3.2. Đánh giá độ đúng của phương pháp
3.3.2.1. Đánh giá độ thu hồi của phương pháp
Kết quả độ thu hồi của PQ khá cao, đạt 100,56%. Vì vậy có
thể kết luận rằng phương pháp xử lý mẫu này là đáng tin cậy.
3.3.2.2. Đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích
Đối với phương pháp phân tích PQ cho kết quả ttính < tbảng
chứng tỏ sự sai khác giữa giá trị phân tích lại và giá trị thêm
chuẩn không có ý nghĩa thống kê
3.3.2. Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại
3.3.2.1. Đánh giá độ lặp lại của thiết bị
Kết quả cho thấy các giá trị RSD < 3% chứng tỏ điều kiện
và hệ thống sắc ký HPLC đã lựa chọn là ổn định, phù hợp để
định lượng PQ.

Vũ Anh Phương

Vũ Anh Phương

12
nhiên

Trường ĐHKH Tự


Hình 3: Kết quả định lượng nồng độ PQ khi vào viện ở bệnh nhân
sống và tử vong.
Căn cứ vào công thức tính chỉ số độ nặng của ngộ độc PQ
(hay thang điểm SIPP): SIPP=[PQ huyết tương (µg/ml)]×[thời
gian từ uống đến bắt đầu điều trị (h)], điểm SIPP của nhóm BN
nghiên cứu trung bình là 51,5 (thấp nhất: 1,1, cao nhất 354,6).
Chúng tôi khảo sát chi tiết hơn giá trị của thang điểm SIPP
được trình bày dưới dang đường cong ROC. Diện tích dưới
đường cong (AUC) của SIPP là 0,886. Như vậy, điểm SIPP có

Vũ Anh Phương

13
nhiên

Trường ĐHKH Tự


giá trị tốt dùng để tiên lượng tử vong. Giá trị thang điểm SIPP =
25 có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhất (tương ứng 0,82 và
0,88), điểm SIPP trên 40 có độ nhạy 0,73 và độ đặc hiệu đạt
100% có nghĩa BN có điểm SIPP trên 40 đều tử vong.

KCl;

polyethylenglycol; triethylamine; MeOH)
-

Điều kiện xử lý mẫu PQ ra khỏi nền mẫu huyết
tương khi có TCA ly tâm và lọc lấy dung dịch xác
định trên hệ thống HPLC.

2. Phương pháp phân tích PQ trên nền mẫu huyết tương
thu được phương trình đường chuẩn trong khoảng nồng
độ từ 0,040 - 10 µg/ml y = (0.84±0.32) + (205.06 ±
0.08) x có LOD = 0,013 µg/ml; LOQ = 0,040 µg/ml và
hệ số tương quan R2 = 0.9999. Độ lặp lại của thiết bị và
phương pháp phân tích (RSD đều nhỏ hơn 3%) và độ tái
lặp lại (RSDR nhỏ hơn 1%); độ ổn định trong thời gian

Vũ Anh Phương

15
nhiên

Trường ĐHKH Tự


phân tích và độ ổn định trong thời gian bảo quản (RSD
đều nhỏ hơn 2%); tính tuyến tính (giá trị R2 = 0,9999);
độ thu hồi (hiệu suất thu hồi của PQ trung bình
100,56%).
3. Phương phá p định lượng PQ xây dựng được đã được