BỘY TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
ỉỊc ĩỊí ỳ ĩj? ĩjí
NGUYỄN THỊ HƯỚNG
ĐỊNH LƯỢNG ĐỔNG THỜI PARACETAMOL
VÀ QUININ SULFAT TRONG VIÊN NÉN
ANTIGRIP F BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1998-2003)
Người hướng dẫn:
Nơi thực hiện:
Thời gian thực hiện:
TS. THÁI PHAN QUỲNH NHƯ
TS. THÁI DUY THÌN
PHÒNG HOÁ LÝ I - VIỆN KIEM n g h iệ m
BỘ MÔN HOÁ DƯỢC - ĐẠI HỌC DƯỢC HN
2/2003 ĐẾN 5/2003
Hà Nội 5-2003
LỜI CẢM ƠN
Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Hoá Lý 1-Viện
Kiểm nghiệm và Bộ môn Hoá Dược-Trường Đại học Dược Hà Nội.
Trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự
hướng dẫn tận tình của các thầy cô hướng dẫn, cán bộ của phòng Hoá Lýl-
Viện Kiểm nghiệm , các cán bộ của bộ môn hoá dược
Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tân tình của TS.
Thái Phan Quỳnh Như-Trưởng phòng Hoá Lý 1-Viện Kiểm nghiệm và TS.
Thái Duy Thìn -Bộ môn Hoá Dược -Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp tôi
có những tài liệu và kỹ năng cần thiết trong quá trình thực hiện khoá luận.
Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, các kỹ
thuật viên khác trong bộ môn Hoá Dược và các cán bộ phòng Hoá Lý 1 -Viện
Kiểm nghiệm đã giúp tôi hoàn thành khóa luận của mình trong thời gian ngắn


34
2.5. BÀN LUẬN 36
Phần 3: KÊT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
NHỮNG CHỮ VIẾT TAT
CTD-VTYT
: Công ty Dược - Vật tư y tế.
HPLC
: Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
nm
: Nanomet.
|um
: Micromet.
III
: Microlit.
: Microgam.
PA
: Tinh khiết phân tích (pure analysis).
SKĐ
: Sắc ký đồ.
UV-VIS
: Tử ngoại - khả kiến
ĐẶT VÂN ĐỂ
•
Với sự phát triển nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là cá<
thành tựu khoa học của ngành dược, các dạng bào chế đa thành phần nhằn
phối hợp tác dụng dược lý giữa các hoạt chất ngày càng được sản xuất, lưi
hành, sử dụng rộng rãi. Nhiều biệt dược đã trở nên quen thuộc với người tiêi

- Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và quinin
sulfat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Đánh giá, so sánh với phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại-khả
kiến nhằm cho các cơ sở lựa chọn áp dụng. Đồng thời mong được góp phần
xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng của ngành cũng như của quốc gia cho các
dạng thuốc có thành phần tương tự.
2
Phần l:TổNG QUAN
1.1. PARACETAMOL. [1], [12], [15], [16],
1.1.1. Công thức:
HO— — NH-CO—CH3
[C8H9N02].
- Tên khoa học: N-Acetyl-p-Aminophenol; p-Hydroxyacetanilid.
- Tên khác: Acetaminophen.
1.1.2. Tính chất:
- Bột kết tinh trắng, không màu, dễ tan trong ethanol, khó tan trong
nước, hầu như không tan trong cloroform, tan trong kiềm do tạo muối
phenolat.
- Nhiệt độ nóng chảy từ 168°c - 172°c.
- Cho phản ứng của -OH phenol tự do: Với Fe3+ cho màu lam tím.
- Dễ bị thuỷ phân do chức amid không bền.
- Tạp chất cần chú ý: Là p-Aminophenol, thường xác định giới hạn tạp
chất này bằng phép đo nitrit và phương pháp sắc ký lớp mỏng.
1.1.3. Tác dụng dược lý: [7], [12].
- Thuộc nhóm thuốc chống viêm phi steroid có tác dụng hạ nhiệt, giảm
đau. So với Aspirin, paracetamol xuất hiện tác dụng nhanh và duy trì lâu hơn,
hạ nhiệt êm dịu hơn, giảm đau tốt hơn, ít tác dụng phụ hơn nên hay được dùng
để hạ sốt giảm đau hơn.
- Không có tác dụng chống viêm và chống ngưng kết tiểu cầu chủ yếu
do ức chế prostaglandin ở ngoại vi yếu nên được dùng để hạ sốt do mọi

ở trong phức hợp này có thể là sắt II hoặc sắt III. Phức chất sắt II có màu đỏ,
4
phức chất sắt III có màu xanh. Khi đến điểm tương đương, lượng Ceri IV quá
thừa sẽ oxy hoá phức chất sắt II thành sắt III và chỉ thị sẽ chuyển màu.
[(Cl2H8N2)3Fe]2+ - e' ► [(C12H8N2)3Fe]3+
1.2. QUININ SULFAT. [1], [3].
1.2.1.Công thức
+ Nguồn gốc: Là alcaloid chính phân lập từ vỏ cây canh ki na
[C20H24N2O2)2.H2SO4].
Phân tử Quinin gồm nhân quinolin gắn với nhân quinuclidin qua nhóm
alcol bậc hai.
+ Tên khoa học: bis[(R)-(6-methoxyquinolin-4-yl)-[(2S,4S,5R)-5-
ethenyl-l-azabicyclo[2 .2 .2 ]oct-2 -yl]methanol] sulfat.
1.2.2. Tính chất:
- Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng hoặc tinh thể hình kim không
màu, mịn. Vị rất đắng. Khó tan trong nước, hơi tan trong nước sôi và ethanol
96%, thực tế không tan trong ether.
- Quinin có tính base do hai nitơ mang lại, ứng dụng để điều chế các
muối quinin vững bền hoặc muối dễ hoà tan trong nước pha dung dịch tiêm.
1.2.3. Tác dụng dược lý: [7], [3].
+ Có tác dụng chủ yếu lên thể vô tính trong hồng cầu, nhất là với
p.falciparum. Còn diệt được giao bào p.vivax và p.malariae trong máu nhưng
không diệt được thể giao tử cuả p.falciparum. Là thuốc phòng và cắt cơn sốt,
5
quinin độc hơn và kém tác dụng hơn cloroquin nên hay dùng cho người bệnh
ở các vùng mà p.falciparum đã kháng với cloroquin .
+ Tác dụng hạ nhiệt: Thường phối hợp với paracetamol để điều trị
chứng cảm sốt, nhứe đầu, đau mình mẩy.
+ Vị đắng, giúp ăn ngon, dễ tiêu (rượu bổ quinquina).
1.2.3.MỘÍ số phương pháp đã được áp dụng để định lượng quinin sulfat:

với pha tĩnh, để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, ta cần có một pha động
được bơm vào cột sắc ký dưới áp suất cao.Như vậy nếu ta nạp mẫu phân
tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, c vào cột tách, kết quả là các chất
A, B, c sẽ được tách khỏi nhau khi đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự
tách sắc ký ở đây là tổng của các tương tác.
Tổng của ba tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi
cột trước tiên khi lực lưu giữ là nhỏ nhất, và ngược lại. Đối với mỗi chất sự lưu
giữ được qui định bởi ba lực thành phần : FI, F2, F3. Trong đó FI, F2 là quyết
định còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. ở đây F1 là lực giữ chất phân tích
trên cột, F2 là lực kéo nó đi khỏi cột. Như vậy các chất khác nhau thì FI, F2
sẽ khác nhau, kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ
khác nhau và tách hẳn nhau khi ra khỏi cột. Sau khi ra khỏi cột các chất sẽ
7
được phát hiện bằng detector và được chuyển qua bộ phận sử lý kết quả. Kết
quả sau khi được sử lý sẽ được đưa ra máy ghi hoặc hiển thị trên màn hình.
Tín hiệu phân tích định tính mỗi thành phần trong hỗn hợp là thời gian
lưu của chất đó trên cột hay vị trí của pic tương ứng trên sắc ký đồ, còn tín
hiệu phân tích định lượng là diện tích pic (hoặc chiều cao pic) thu được, phụ
thuộc vào nồng độ của chất đó trong dung dịch đem đo HPLC.
1.3.2. Các đại lượng đặc trưng: [1], [9].
Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại
và ghi thành sắc ký đồ .
signal Component 1 Component 2
Hình 1: Các đại lượng đặc trưng trên sác ký đồ trong phép định lượng bằng HPLC
❖ Thòi gian lưu tp(Retention timeV
+ Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc bơm mẫu vào cột
đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cựe đại.
8
+ Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì
thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn. Vì vậy

bố, nó được tính theo công thức:
Trong đó cs, CM lần lượt là nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha
động.
Khi nồng độ chất tan không cao quá thi K là một hằng số chỉ phụ thuộc
vào bản chất các pha và chất tan, nhiệt độ.
Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao của đĩa( H):
Hiệu lực của cột thường được đo bằng hai thông số: Số đĩa lý thuyết và
chiều cao đĩa lý thuyết. Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi
tầng sự phân bố chất tan vào hai pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới.
Mỗi tầng được giả định như là một lớp chất nhồi có chiều cao là H.Ta có thể
tính số đĩa lý thuyết N theo công thức sau:
Trong đó :+WBlà chiều rộng píc ồ đáy píc
+W1/2 là chiều rộng píc đo ở nửa chiều cao của đỉnh.
Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết
được tính bằng công thức:
❖ Đỏ phân giải (Rg):
Độ phân giải là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký.
Độ phân giải được định nghĩa như sau:
(4)
N = Ỉ6
w
VY B
R
(5)
(6)
10
Khoảng cách giữa hai pic
t R,B ~ Ír ,A
_
______________________________________________________________________________________________

cỡ hạt từ 3-10 |um, diện tích bề mặt riêng thường từ 50-500 m2/g.
❖ Phân loại pha tĩnh.
- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người
ta chia nó thành nhiều loại: Hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử.
- Căn cứ vào trạng thái rắn hay lỏng thì pha tĩnh được chia làm hai loại:
nếu pha tĩnh là chất rắn thì ta có sắc ký lỏng rắn LSC (Liquid Soli
Chromatography), riếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký lỏng lỏng LLC
(Liquid Liquid Chromatography).
- Xét về cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn thì pha tĩnh có hai kiểu
xốp là : Xốp toàn phần hạt và xốp chỉ lớp vỏ ngoài (xốp bề mặt).
Điều kiện đối với một pha tĩnh:
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký.
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều
kiện sắc ký nhất định.
-Tính chất bề mặt phải ổn định.
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất.
Chê tạo pha tĩnh: pha tĩnh được chế tạo trên các chất nền sau:
+ Pha tĩnh trên nền Silicagel.
+ Pha tĩnh trên nền oxyd nhôm.
+ Pha tĩnh trên nền mạch carbon.
+ Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ.
12
Trong các loại trên thì pha tĩnh trên nền Silicagel ưu việt hơn và được sử
dụng nhiều nhất. Có hai loại Silicagel hấp phụ cho sắc ký hấp phụ (pha thuận)
và silicagel được biến đổi hoá học cho một số kiểu sắc ký khác nhau:
- Silicagel trung tính: sử dụng cho sắc ký hấp phụ pha thuận. Loại này
trên bề mặt của nó có chứa các nhóm -OH. Đó là các nhóm hoạt động có tính
chất phân cực và ái nước. Loại chất nhồi cột này dùng để tách các chất không
phân cực và các chất ít phân cực. Pha động của loại này là những chất ít phân

dịch các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức. Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ
có các hệ dung môi rửa giải riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất.
Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu quả và hiệu suất
tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất
mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký. Pha động có thể làm thay đổi:
- Độ chọn lọc của hệ pha.
- Thời gian lưu giữ chất tan.
- Hiệu lực của cột tách.
- Độ phân giải R.
-Độ rộng hoặc sự cân đối của các pic sắc ký.
❖ Trong HPLC, pha động phải thoả mãn một số điều kiện sau:
- Trơ đối với pha tĩnh.
- Hoà tan được chất cần phân tích.
- Bền vững theo thời gian.
- Có độ tinh khiết cao.
- Phải nhanh đạt các quá trình cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Phù hợp với các loại detector được lựa chọn để phát hiện các chất phân
tích.
- Có tính kinh tế, dễ kiếm.
14
Trong sắc ký hấp phụ (pha thuận): Pha động phải là các dung môi hữu
cơ không phân cực hoặc ít phân cực như n-hexan, n-heptan, cloroform,
tetraclorocarbon.
Trong sắc ký hấp phụ (pha đảo): Pha động là hệ dung môi của những
dung môi đồng tan với nước, có khi nước lại là thành phần chính trong pha
động ví dụ như methanol, acetonitril Trong nhiều trường hợp, thành phần pha
động còn có thêm các chất đệm pH để ổn định pH cho quá trình sắc ký, chất
tạo phức để tạo ra sự rửa giải chọn lọc, chất tạo cặp ion để sử dụng trong sắc
ký cặp ion.
Trong sắc ký trao đổi ion: pha động là dung dịch nước của acid hoặc

(ewragel, tinh bột, talc, magnesi stearat, HPMC, tinh dầu tràm, tinh
dầu hương nhu).
Quinin sulfat
Paracetamol
Tá dược vđ
30 mg
150 mg
1 viên
16
Số kiểm soát: 050801-08-03
Nơi sản xuất: CTD-VTYT Tiền Giang
Các chất đối chiếu:
Là các chất chuẩn làm việc paracetamol (99,8%) và quininsulfat
(95,5%) (Phòng hoá lý I- Viện Kiểm nghiệm cung cấp)
2.2.2. Nội dung nghiên cứu
Khảo sát các điều kiện đ ể xây dựng chương trình sắc ký định
tính và định lượng đồng thời paracetam ol và quinin sulfat
trong viên nén A ntigrip F .
Qua tham khảo một số tài liệu và trong điều kiện trang thiết bị của cơ
sở nghiên cứu (Phòng hoá lý I-Viện Kiểm Nghiệm), cũng như điều kiện thực
nghiệm ở nước ta hiện nay, chúng tôi khảo sát những điều kiện sau để chọn
chương trình sắc ký thích hợp:
+ Lựa chọn cột sắc ký: Chúng tôi sử dụng cột sắc ký pha đảo
Lichrosorb RP18 (250mm X 4mm; 5 ịim). Đây là cột sắc ký thông dụng
được sử dụng khá nhiều trong công tác kiểm nghiệm.
+ Khảo sát, lựa chọn dung môi pha động và tốc độ dòng thích hợp cho
phép tách đồng thời paracetamol và quinin sulfat. Chúng tôi tiến hành khảo sát
các hệ dung môi có trong tài liệu tham khảo, lựa chọn và điều chỉnh tỷ lệ các
thành phần sao cho các thành phần được tách tốt nhất.
+ Khảo sát chọn bước sóng xác định đồng thời paracetamol và

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp dùng trong khoá luận là phương pháp HPLC
- Bằng thực nghiệm tìm các điều kiện tối ưu để xây dựng phương pháp,
xử lý thống kê và rút ra nhận xét.
❖ Một sô đặc trưng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả.
Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê thông
qua các đặc trưng sau:
18
Giá trị trung bình:
Độ lệch chuẩn:
Sai số chuẩn:
- 1 J L
n ,=1
5 =
5 (x) - —
ấ ( x/ - x )2
_M
________
n -ỉ
( 10)
(11)
(12)
Sai số tương đối: 8% = a- x^
So sánh các phương sai (test F):
8% = ^ ^ 1 0 0
X
p =
1 TN
S]
nA 1 /=1

acid acetic để đưa pH pha động về vùng acid. Dung môi hữu cơ được sử dụng
là methanol. Hoà tan 1,1 g natriheptansulfonat trong 1 lit hỗn hợp gồm có
methanol và dung dịch acid acetic 4%. Tỷ lệ ban đầu được lựa chọn là đồng
thể tích. Ở tỷ lệ này, quinin sulfat được rửa giải rất chậm, pic doãng và không
cân xứng. Chính vì thế chúng tôi tăng dần tỷ lệ methanol. Qua các thực
nghiệm khảo sát, tỷ lệ methanol được xác định là khoảng 65% (tt/tt). Để pic
của quinin sulfat gọn và cân xứng, chúng tôi cho thêm 1 tỷ lệ nhỏ diethylamin
(khoảng 1 %).
Pha động được lựa chọn cuối cùng như sau: hoà tan 1,1 g
natriheptansulfonat trong 1 lit hỗn hợp gồm có methanol- dung dịch acid
acetic 4% (tt/tt) - diethylamin tỷ lệ (650 : 350: 1 ).
Với dung môi này, hai dược chất được phân tách hoàn toàn,
Paracetamol được rửa giải ra trước (thời gian lưu = 2,3 phút), Quinin sulfat
được rửa giải ra sau (thời gian lưu = 4,9 phút), các pic đều cân xứng.
20
- Qua khảo sát chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng 1 mỉ/phút cho kết quả tách
tốt nhất, thời gian lưu vừa phải.
- Lựa chọn bước sóng:
Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện paracetamol và quininsulfat
chúng tôi quét phổ tử ngoại của 2 chất chuẩn trên (mỗi chất đều được pha
trong pha động với nồng độ như sau: Paracetamol là 7,5|ig/ml; quininsulfat là
8 |Lig/ml. Kết quả cho thấy paracetamol có đỉnh hấp thụ cực đại tại bước sóng
250,9 nm và quininsulfat có 3 đỉnh hấp thụ cực đại tại các bước sóng (233,6
nm; 265,0 nm; 327,5 nm)
Hình 2: Phổ UV-Vis của paracetamol (7,5|ig/m l) và của
quinin sulfat (8 |!g/ml) trong pha động
21