ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

=======

VŨ ANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT
TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. TẠ THỊ THẢO
2. TS. HÀ TRẦN HƯNG

HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo và
TS. Hà Trần Hưng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhân
viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
được học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc
biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá

DANH SÁCH HÌNH
Chương 1.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
% RSD
% RSDR
ACN
AS
ATP
BN
DAD
DQ
EPQ
GC - MS
HP
HPLC
LC - MS
LOD
LOQ
MeOH
ppm
PQ
R
ROC
RP-HPLC
SD
SIPP
TCA
tR

spectroscopy
Hemoperfusion
High performance liquid
Chromatography
Liquid Chromatography - Mass
Spectroscopy
Limit of Detection
Limit of Quantification
Methanol
Parts per million
Paraquat
Relative coefficient
Receiver operating characteristics
Reverse phase-HPLC
Standard deviation
Severity Index of Paraquat
Poisoning
Trichloroacetic acid
Retention time

Sắc ký khí khối phổ
Lọc máu hấp phụ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng khối phổ
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Methanol
Phần triệu
Paraquat
Hệ số tương quan



ĐẶT VẤN ĐỀ
Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) là một thuốc diệt cỏ giá
thành rẻ, hiệu quả diệt cỏ dại nhanh chóng, ít ảnh hưởng tới môi trường do đó hiện
đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam với nhiều tên thương mại khác nhau. Tuy
nhiên, paraquat (PQ) lại là một chất hóa học vô cùng độc với người. Liều tử vong của
PQ ước tính là khoảng 10 ml dung dịch 20%. Tại nhiều nước phát triển, PQ đã bị cấm
sử dụng nhưng ở Việt Nam việc thiếu các chính sách và biện pháp quản lý sử dụng hóa
chất này nên trong những năm vừa qua có rất nhiều trường hợp ngộ độc PQ đến cấp
cứu [1]. Trên thế giới, nhiều ca tử vong do ngộ độc PQ đã được báo cáo [10][19][27].
Tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong những năm gần đây, số lượng
bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùng
nghiêm trọng, vượt ngưỡng 300 ca trong năm 2013 và năm 2014 lên tới 391 ca. Tỉ lệ tử
vong do ngộ độc PQ rất cao, thường khoảng 70-80% theo nhiều nghiên cứu của các tác
giả nước ngoài [29][32]. Tại Trung tâm chống độc (TTCĐ) bệnh viện Bạch Mai, tỉ lệ tử
vong năm 2007 là 72,5% [4], năm 2011 là 72,9% [2], nghiên cứu tại bệnh viện Chợ
Rẫy thành phố Hồ Chí Minh là 85%.
Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQ
trong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của
ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều
trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ. Tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp PQ rất cao vì thiếu
các biện pháp điều trị hiệu quả. Gần đây, các nghiên cứu của nhiều tác giả nước
ngoài và một số tác giả Việt Nam cho thấy các kĩ thuật lọc máu mới, nhất là lọc
máu hấp phụ bằng cột than hoạt hoặc cột resin nhằm tăng cường đào thải PQ cho
kết quả khả quan, cứu sống một số không nhỏ bệnh nhân ngộ độc cấp PQ. Xét
nghiệm định lượng nồng độ PQ huyết tương cung cấp công cụ quan trọng để đánh
giá hiệu quả của các biện pháp điều trị tăng thải trừ này.
Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm PQ chỉ dừng ở mức độ
định tính trong nước tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc

Trường ĐHKH Tự nhiên


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về paraquat
1.1.1. Công thức paraquat
Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là 1,1'dimethyl-4,4' bipyridilium là thuốc diệt cỏ phổ biến nhất hiện nay do đặc tính
diệt cỏ nhanh và triệt để. PQ thuộc nhóm hợp chất amonium bậc 4 bipyridylium,
được tổng hợp đầu tiên vào năm 1882, ứng dụng trong nông nghiệp làm thuốc
trừ cỏ từ những năm 1950 [42].
PQ có khối lượng phân tử tương đối 186,2 có công thức hóa học như hình 1.1:

Hình 1.1: Công thức hóa học của paraquat
1.1.2. Tính chất lý, hóa học của paraquat
PQ thường có màu trắng hơi vàng, không mùi, tỷ trọng ở 20 oC là 1,240 1,260, điểm chảy 175 - 180 oC, điểm sôi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQ
trong nước 6,5 - 7,5.
PQ thường ở dạng dimethylsulphate hoặc dichloride. Dạng dichloride tinh
thể trắng, dạng dimethylsulphate chảy rữa. PQ ổn định trong dung dịch môi trường
acid hoặc trung tính và không ổn định trong môi trường kiềm.
PQ tan tốt trong nước (độ tan 700 g/l ở 20 oC), ít tan trong cồn và hầu như
không tan trong các dung môi hữu cơ khác.
PQ bị phân hủy dưới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bề
mặt anionic và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc với đất. PQ không
bay hơi. Dung dịch PQ đặc ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhôm [43].

Vũ Anh Phương

10

Trường ĐHKH Tự nhiên

một phản ứng tạo ra ion paraquat bị khử (PQ +) và NADP+. PQ+ phản ứng hầu như
ngay lập tức với oxy tái tạo lại PQ 2+ và gốc superoxid. Có sẵn NADPH và oxy, chu
trình oxy hoá - khử của PQ xảy ra liên tục, với việc NADPH liên tục bị mất đi và
không ngừng tạo ra gốc superoxid. Gốc tự do superoxid sau đó phản ứng với bản
thân nó để tạo ra peroxid hydro (H2O2), và với H2O2 cùng Fe để tạo thành gốc tự do
hydroxyl [18] [31]. Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào. Chu trình oxy hoá - khử
tạo thành gốc tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ chế làm tổn thương tế bào: phản ứng
với lipid trên màng tế bào (peroxide hoá lipid), DNA và các protein tối cần thiết cho
tế bào sống sót cũng bị các gốc tự do hydroxyl phá hủy [12] [39] [40].
Hậu quả lên tế bào do việc hình thành các gốc tự do (superoxid và các gốc tự
do khác) là đối tượng của rất nhiều nghiên cứu. Các thử nghiệm điều trị nhằm vào
việc thay đổi các gốc tự do bằng các chất như desferioxamin, superoxid dismutase,
α-tocopherol và vitamin C cùng với bài niệu cưỡng bức. Tuy nhiên, cho đến hiện
nay không có chất nào trong số này được khuyến cáo dùng.
Mặc dù chi tiết đầy đủ về độc chất học của các gốc tự do do PQ sinh ra vẫn
chưa được biết nhưng những gì người ta đã biết về cơ sở để ngộ độc là sự tương tác
giữa PQ, NADPH và oxy. Sau đó, ở mức độ tế bào, oxy là yếu tố tối cần thiết cho
việc hình thành bệnh lý do PQ. Đây là cơ sở cho việc hạn chế cung cấp oxy trong
việc điều trị ban đầu bệnh nhân ngộ độc PQ.
PQ có tính ăn mòn và gây tổn thương giống như kiềm khi tiếp xúc với da,
mắt và các niêm mạc. Các cơ quan đích chủ yếu trong ngộ độc toàn thân PQ là
đường tiêu hoá, thận và phổi. Dạ dày, ruột bị tổn thương nặng nề do tác dụng ăn
mòn trực tiếp khi bệnh nhân uống PQ có chủ ý với nồng độ cao. Thận là cơ quan
đào thải PQ và DQ và có nồng độ bipyridyl cao hơn so với các cơ quan khác. Riêng
ở phổi, PQ vào các phế bào týp I và II không phụ thuộc bậc thang nồng độ mà theo
cơ chế vận chuyển tích cực phụ thuộc ATP.
Do vậy PQ gây tổn thương hầu hết tất cả các cơ quan trong cơ thể vì đều có
liên quan đến chuyển hóa và hô hấp tế bào, tuy nhiên tại các vị trí hấp phụ nhiều PQ

Vũ Anh Phương

cao [8][22]. Thể tích phân bố của PQ là 1,2 - 1,6 l/kg.
PQ đạt được nồng độ cao và tồn tại lâu hơn trong phổi, nồng độ trong phổi
có thể cao hơn so với nồng độ huyết tương gấp 50 lần. Sau uống 5-7 giờ, nồng độ
PQ trong tổ chức phổi đạt cao nhất. Tuy nhiên, lượng PQ huyết tương cũng cần đạt
đến một ngưỡng tới hạn để cho quá trình hấp thu ở phổi diễn ra [11].

Vũ Anh Phương

13

Trường ĐHKH Tự nhiên


PQ qua được nhau thai. Trong một nghiên cứu, nồng độ PQ trong dịch ối và
máu dây rốn, bào thai cao hơn nồng độ trong máu mẹ 4-6 lần [11]. Không có bào thai
nào sống sót. Tuy nhiên nếu mẹ ngộ độc PQ còn sống thì đến lần có thai sau không
nguy hiểm đến bào thai.
1.1.4.3. Chuyển hoá, thải trừ
PQ được đào thải hầu như hoàn toàn qua thận nhờ cả quá trình lọc của cầu
thận và quá trình bài tiết tích cực của ống thận. Trong vòng 12-24 giờ sau uống, trên
90% PQ được đào thải dưới dạng không đổi qua thận, nếu chức năng thận bình
thường [11].Tuy nhiên có thể xét nghiệm thấy PQ trong nước tiểu vài ngày sau do
có sự tái phân bố PQ từ các cơ quan. Thời gian bán thải của PQ có thể kéo dài 12120 giờ hoặc lâu hơn khi có suy thận. Ngoài ra PQ còn đào thải qua phân dưới dạng
không đổi [8][22].
1.1.5. Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương.
Tiên lượng bệnh nhân uống PQ có thể dựa vào nồng độ PQ huyết tương theo
thời gian. Nồng độ PQ phải đo trước khi điều trị vì các biện pháp điều trị có thể làm
giảm nồng độ PQ (dùng than hoạt, lọc máu hấp phụ…). Proudfoot và cộng sự [29]
lần đầu tiên trình bày biểu đồ tiên lượng khả năng sống từ kết quả định lượng nồng
độ PQ huyết tương tại nhiều thời điểm khác nhau trên 79 bệnh nhân. Những BN

Năm 1988 Sawada và cộng sự [34] báo cáo chỉ số tiên lượng ngộ độc PQ
dựa trên nghiên cứu nồng độ PQ huyết thanh ở 30 bệnh nhân, 20 tử vong và 10 BN
sống. Chỉ số độ nặng của ngộ độc PQ (SIPP: severity index of PQ poisoning) tính
bằng thời gian từ khi uống (giờ) cho đến khi bắt đầu điều trị nhân với nồng độ PQ
huyết thanh (µg/ml) khi vào viện.
SIPP = [nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml)] × [thời gian từ uống đến bắt đầu điều trị (h)]
Khi điểm SIPP ít hơn 10, bệnh nhân có thể sống sót; điểm 50 phân biệt tử
vong muộn do suy hô hấp (10 < SIPP 50). Mặc dù đây là nghiên cứu quan trọng, Sawada xét nghiệm định

Vũ Anh Phương

15

Trường ĐHKH Tự nhiên


lượng dùng huyết thanh không phải huyết tương. Suzuki và cộng sự (1991) đã so
sánh SIPP với đồ thị tiên lượng sống trên 167 BN nhập viện trong vòng 24 h sau
uống PQ. Các kết cục của BN dự đoán theo đồ thị của Proudfoot đã sai ở 1
trường hợp tử vong và 2 BN sống; trong khi đó, SIPP sai ở 1 BN sống và 10
trường hợp tử vong. Những khác biệt này có ý nghĩa thống kê, và tác giả kết luận
rằng dựa trên nồng độ PQ trong 24 h đầu sau uống, đồ thị của Proudfoot tiên
lượng chính xác hơn SIPP [36].
1.2. Các phương pháp xác định paraquat trong huyết tương
1.2.1. Phương pháp quang phổ
Rai M.K và cộng sự [30] định lượng PQ sử dụng NaBH4 để khử PQ trong
môi trường kiềm tạo ra dung dịch màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 600nm
trong khi Kato K. và cộng sự [20] lại dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester
(TBPE) phản ứng với PQ để tạo ra dung dịch hữu cơ PQ-TBPE màu xanh da trời,

thực phẩm và các mẫu trong môi trường.
Với phương pháp đo quang phổ thông thường, không phát hiện được PQ tại
bước sóng 257 nm. Nên Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định lượng nồng độ PQ
trong huyết tương dựa trên việc đo quang phổ dẫn xuất thứ 2 (tuân theo định luật
Lambert Beer với r = 0,996). Dung dịch nước chuẩn PQ 10 μg/ml được quét bước
sóng từ 200 đến 300 nm, với mẫu trắng là nước cất. Huyết tương sạch và các dung
dịch huyết tương chuẩn PQ 50 và 10 μg/ml được thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1, v/v).
Lắc xoáy, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy dịch trong phần trên đi đo quét
bước sóng từ 200 đến 300 nm. Sau khi xử lý mẫu như trên, dịch trong phần trên
được chuyển vào ống Eppendorf mới, bảo quản tránh ánh sáng. Trước khi đo, 400
μl mẫu được lắc trộn nhẹ nhàng và hoàn toàn với 100 μl hỗn hợp đồng thể tích
Na2S2O4 10% và NaOH 5M. Làm tương tự với mẫu huyết tương trắng đối chiếu và
đo độ hấp thụ quang trong khoảng bước sóng từ 300 đến 500 nm (khoảng bước
sóng Δλ = 0,5 nm). Từ đó dẫn xuất thứ 2 này có thể được tính toán theo công thức
Δ2Abs/(Δλ)2 (khoảng bước sóng dẫn xuất Δλ=4 nm) [24].
1.2.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ
Phương pháp GC-MS là phương pháp đơn giản có độ nhạy và độ tin cậy cao,
từ lâu đã được sử dụng để định lượng PQ trong dịch sinh học. L. Gao [16] và
Almeida R. M. [5] cùng sử dụng phương pháp GC-MS để định lượng PQ. Trong cả
hai nghiên cứu, các tác giả đã sử dụng hệ thống chọn lọc ion (selected ion
monitoring – SIM) để nhận biết PQ, đồng thời cũng thêm EPQ làm chất nội chuẩn,
khí He được dùng như là khí mang để đưa chất phân tích vào cột. Dung dịch mẫu

Vũ Anh Phương

17

Trường ĐHKH Tự nhiên




Trường ĐHKH Tự nhiên


photodiode Water 996 hoạt động từ bước sóng 210-400 nm với độ phân giải 1,2 nm.
Độ hấp thụ UV được đo ở 258 nm.
Cả hai tác giả đều sử dụng pha động là ammonium formate và acetonitrile.
Trong khi ZhaohongWang dùng ammonium formate 250 mM (điều chỉnh đến pH
3,7 bằng acid formic) và acetonitrile. Và chạy pha động theo chế độ gradient với tốc
độ dòng 0,3 ml/phút. Ngay sau khi tiêm mẫu, % acetonitrile giảm từ 60% đến 20%
trong 0,5 phút, sau đó tăng tới 60% ở 1,5 phút và duy trì 60% ở 1,5 phút tiếp. Tổng
thời gian chạy là 3 phút. Thì tác giả Proenca P. dùng pha động gồm acetonitrile và
đệm ammonium formate (200 mM) pH 3,6 với chế độ đẳng dòng (30:70, v/v) và tốc
độ 300 µl/phút.
Các tác giả trên đều sử dụng nguồn ion hóa tia điện dương để ion hóa PQ và
chuẩn nội nhưng có khác nhau về điều kiện khối phổ.
Tác giả ZhaohongWang sử dụng bộ phân tích phổ khối ACQUITY
BSM_SM_Quattro Premier XE MS. Tối ưu hóa điều kiện MS-MS bằng cách tiêm
dòng PQ và ethyl viologen trong acetonitrile/dung dịch ammonium formate 250
mM (40:60, v/v) với tốc độ khí cone là 50 l/h và tốc độ dòng khí làm khô là 651 l/h
ở 350oC. Điện áp mao quản là 3,5 kV và điện áp cone là 20 V, điện áp extractor là
4,0 V và điện áp thấu kính RzFl à 0,5 V. Định lượng bằng kỹ thuật quét ion (multireaction monitoring, MRM), bắt các mảnh ion ban đầu có m/z 186 và các ion sản
phẩm có m/z 155 và 171 đối với PQ; mảnh ion ban đầu có m/z 214 và các ion sản
phẩm có m/z 158 và 185 đối với chuẩn nội ethyl viologen [41].
Còn với tác giả Proenca P [28] phát hiện phổ (MS) được thực hiện trên máy
khối phổ tứ cực Water ZQ 2000. Thiết lập các điều kiện: nguồn nhiệt 120 oC; nhiệt
độ làm khô 400oC; tốc độ dòng khí cone (N2) 0 l/h và tốc độ dòng khí làm khô (N 2)
600 l/h. Điện thế capillary 3,5 kV; điện thế cone 40 V; extractor 4 V; năng lượng
ion 0,5 V; Quét phổ từ m/z 130-500, thời gian quét 0,5 s và thời gian trễ (interscan)
0,1s. Đường chuẩn độ PQ trong máu tuyến tính từ 0,010-2,0 µg/ml trong máu

C18 (150×4,6 mm, 5µm). Tiền cột C18 (100×4,6 mm, 10µm). PQ và chất nội chuẩn
được rửa giải ở 25oC với tốc độ dòng 0,8 ml/phút và bước sóng hấp thụ 258 nm.
Pha động gồm acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong
900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine. Acetonitrile
nồng độ 10% (v/v). Kết quả: Thời gian lưu của PQ và chuẩn nội là 6,5 và 9,5 phút.
Giới hạn phát hiện (LOD) 0,1 µg/ml, giới hạn định lượng (LOQ) 0,4 µg/ml trong
huyết tương và huyết thanh. Độ đúng trong ngày không vượt quá 3,5%; 3,2% đối

Vũ Anh Phương

20

Trường ĐHKH Tự nhiên


với huyết tương, huyết thanh. Độ đúng trong khác ngày không vượt quá 4,7%; 3,1%
đối với huyết tương, huyết thanh. Độ thu hồi trong huyết tương và huyết thanh lần
lượt là 98,9% và 98,7%.
Shuuji Hara [17] định lượng đồng thời PQ và DQ trong huyết tương bằng
phương pháp HPLC. Hệ sử dụng bơm L-7120 (Hitachi, Tokyo, Nhật), van bơm
mẫu (20 µl) Rheodyne 7125. PQ, DQ, IS được tách trên cột pha đảo Capcell PaK
C18 UG120 (150-4,6 mm, cỡ hạt 5µm, của Shiseido Co., Tokyo, Nhật) bằng dung
dịch rửa giải của methanol và 200 mM axit phosphoric với diethyl amine 0,1M và
sodium 1-heptane sulphonate 12 mM (1:4, v/v). Tốc độ dòng của pha động 0,5
ml/phút và nhiệt độ cột trong khoảng từ 15-20oC. Dịch rửa từ cột HPLC được trộn
với dung dịch kiềm của Sodium hydrosulfite bằng thiết bị trộn. Tốc độ dòng 0,4
ml/phút. Hỗn hợp được dẫn vào sợi dây (1 m x 0,5 mm) và được làm ấm trong bể
nước SB-9 (EYELA, Tokyo, Nhật) ở nhiệt độ 20oC và đo ở bước sóng 391 nm bằng
detector UV Hitachi L- 7405. Độ cao của pic được dùng để định lượng bằng máy CR6A Chromatopak (Shimadzu, Kyoto, Nhật). Giới hạn phát hiện của PQ và DQ là
50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol) trên ml huyết tương.

trong acid orthophosphoric 0,05 M. Điều chỉnh đến pH 2,8 bằng TEA.

Các dung dịch và pha động được lọc màng 0,45 µm và loại khí trong bể siêu
âm trước khi sử dụng. Giới hạn phát hiện, tỉ lệ tín hiệu (Signal) / Nhiễu đường nền
(Noise) với S/N > 3, là 0,005 µg/ml PQ với thể tích tiêm mẫu 200 µg [9].
Chen Lu và cộng sự [25] đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
để xác định PQ trong huyết thanh người. Trong thí nghiệm này, các mẫu huyết
thanh đã được kết tủa protein lần lượt 30% acid perchloric, acetonitrile và
dichlormethane, thu được 50 ml dung dịch. Pha động acetonitrile-đệm (10:90), dung
dịch đệm chứa natri heptanesulfonate 0,02 M và acid phosphoric 0,26 M, điều chỉnh
pH đến 2,0 bằng triethylamine. Tốc độ dòng 1,2 ml/phút, bước sóng phát hiện 256
nm, nhiệt độ cột 40oC. Đường chuẩn tuyến tính với nồng độ PQ huyết thanh từ 0,1 40 mg/l (r = 0,9999). Giới hạn phát hiện là 0,1 mg/l (S/N = 3). Độ lệch chuẩn (RSD)
của các mẫu chứng nồng độ thấp, trung bình và cao là trong vòng 3,061% - 6,149%,
độ lệch chuẩn giữa các lô 0,705% - 2,796%, và độ thu hồi của phương pháp xử lý
mẫu 96,79 % - 100,07%, và độ thu hồi phương pháp là 91,66% - 108,49%. Phương
pháp này là đơn giản, nhạy cảm, chính xác, nhanh chóng và cũng chỉ ra rằng có thể
được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng.
* Ngoài ra, một vài phương pháp khác cũng đã được nghiên cứu để định
lượng PQ trong máu như: miễn dịch phóng xạ [14], điện di mao quản [38]…
1.3. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat
Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định
lượng đó là phương pháp xử lý mẫu.
Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý mẫu sinh
học trong phân tích PQ [5][16][20][28][41]. Một số tác giả dùng đệm phosphate để
thêm vào mẫu thử trước khi cho qua cột chiết pha rắn [5][16][41].

Vũ Anh Phương

22


được bay hơi đến cắn dưới dòng khí nitrogen ở 40 oC. Cắn được hòa tan trong 100 µl
methanol và bơm 10 µl vào hệ thống LC-ESI-MS.

Vũ Anh Phương

23

Trường ĐHKH Tự nhiên


Kyoko KATO, P. Paixão đều dùng acid perchloric để loại protein [20][26].
Tuy nhiên, một số công trình khác sử dụng acid trichloracetic để kết tủa protein
trong mẫu huyết tương [7][17][24][30] rất đơn giản và cho hiệu quả cao vì vậy có
thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị xét nghiệm.
Phương pháp này được Rai M.K. và cộng sự áp dụng để định lượng PQ trong
máu, nước tiểu và sữa mẹ. Thêm 1 ml dung dịch EDTA 5% và 1ml acid
trichloracetic 1% vào để loại sự ảnh hưởng của các ion kim loại và loại protein. Ly
tâm 1850 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch trong ở trên đem đo quang [30].
Huyết tương sạch và các dung dịch huyết tương chuẩn PQ 50 và 10 μg/ml
được thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1). Lắc xoáy, li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
Lấy dịch trong phần trên đi đo quét bước sóng từ 200 đến 300 nm [24].
Arys K [7] xử lý mẫu bằng cách lấy 1 ml (hoặc 1 g) mẫu, thêm 50 µl chuẩn
nội và thêm nước vừa đủ 4 ml. Tủa protein bằng acid trichloroacetic là bước làm
sạch đầu tiên của các mẫu máu, gan, thận. Thêm 1,5 ml dung dịch acid
trichloroacetic 25%, lắc 10 phút, ly tâm 400 vòng/phút trong 5 phút. Sau khi chuyển
dịch trong ở trên sang ống nhựa sạch, phần tủa protein phía dưới được hòa tan lại
bằng 2,5 ml dung dịch

acid trichloroacetic 5%, lắc 10 phút, ly tâm 1100


Vũ Anh Phương

25

Trường ĐHKH Tự nhiên