BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
========== NGUYỄN ANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ CONOTOXIN TỪ BA LOÀI
ỐC CỐI CONUS STRIATUS, CONUS TEXTILE, CONUS VEXILLUM
VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN CỦA ĐỘC TỐ BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
1. PGS – TS. NGÔ ĐĂNG NGHĨA
2. CN. NGUYỄN THANH SƠN

Nha Trang, tháng 07 năm 2010
iii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT v
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC HÌNH vii
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Đặt vấn đề 3
1.1.1. Tính cấp thiết của đề tài 3
1.1.2. Ý nghĩa khoa học của đề tài 4
1.1.3. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4
1.2. Tổng quan về ốc Conus và tuyến độc tố 4
1.2.1. Bộ máy nọc độc của ốc cối 6
1.2.2. Cơ chế tác động của độc tố ốc cối 11
1.2.3. Tác dụng của độc tố ốc cối 11
1.2.4. Những công trình nghiên cứu trong và ngoài nước 13
1.2.4.1. Tài liệu nước ngoài 13
1.2.4.2. Tài liệu trong nước 14
1.3. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 15
1.3.1. Tổng quan về phương pháp sắc ký 15
1.3.1.1. Lịch sử ra đời phương pháp sắc ký 15
1.3.1.2. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 17
1.3.1.3. Phân loại phương pháp sắc ký 17
1.3.1.4. Các cách tiến hành phân tích sắc ký 19
v

DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Kí hiệu viết tắt Diễn giải
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
IUPAC Hội hoá học cơ bản và ứng dụng quốc tế
GC Sắc ký khí
LC Sắc ký lỏng
LSC Sắc ký lỏng – rắn
BPC Sắc ký hấp phụ
IEC Sắc ký trao đổi ion
SEC Sắc ký phân loại theo kích cỡ
GSC Sắc ký khí – rắn
GLC Sắc ký khí – lỏng
WLOT Cột ống mở
PLOT Cột nhồi
KL Khối lượng
NP Pha thuận
RP Pha ngược
MeOH Methanol
ACN Acetonitril
TFA Trifluoro acetic acid

vi

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình

Tên hình Trang

1.1 Hình dáng bên ngoài conus vexillum 6
1.2 Hình dáng bên ngoài conus textile 6
1.3 Cấu tạo tuyến nọc độc conus textile 6
1.4 Phân loại các phương pháp sắc ký 18
1.5 Quá trình tách các chất A và C trong cột tách sắc ký 20
1.6 Sắc ký đồ quá trình phân tách ở Hình 1.5 21
1.7 Các thông số chính của quá trình sắc ký lỏng cơ bản 24
1.8 Độ phân giải ở các nồng độ khác nhau 24
1.9 Tính không đối xứng của peak 26
1.10 Các bộ phận cơ bản của hệ thống HPLC 26
2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 35
3.1
Biểu đồ so sánh khối lượng trung bình tuyến nọc độc

 Thảo luận kết quả và đề xuất ý kiến.
2

Chương 1. TỔNG QUAN
Ốc là tên chung để chỉ hầu hết các loài động vật thân mềm trong lớp Chân
bụng với đặc điểm có vỏ xoắn khi trưởng thành (có các loài ốc không có vỏ hoặc vỏ
rất nhỏ, ví dụ ốc sên trần). Đặc điểm chung là có vỏ cứng bằng đá vôi, tạo thành
ống rỗng, cuộn vòng quanh trục chính thành các vòng xoắn, thường theo chiều
thuận với chiều kim đồng hồ. Ốc sống ở rất nhiều môi trường, từ rãnh nước, sa mạc,
cho đến những vực biển sâu. Đa số các loài ốc sống ở môi trường biển. Nhiều loại
khác sống trên cạn, trong môi trường nước ngọt và nước lợ [3].
Ở Việt Nam, ốc là một trong những nhóm nguồn lợi hải sản quan trọng, có
mức độ phong phú về thành phần loài, trong đó có nhiều loài có giá trị thương mại
cao như ốc Tù Và, ốc Hương, ốc Bàn Tay, ốc Cối đã được khai thác với sản lượng
lớn. Tuy nhiên trong những năm gần đây, nguồn lợi ốc đã và đang có chiều hướng
suy giảm nhanh chóng do việc khai thác quá mức, chưa có biện pháp quản lý và sử
dụng hợp lý nguồn lợi. Nhiều loài ốc có nguy cơ tuyệt chủng hoặc đe dọa bị tuyệt
chủng đã được liệt kê trong danh mục những loài cần được bảo tồn (Sách đỏ Việt
Nam, 2003).
Hiện nay tại Việt Nam người ta chỉ quan tâm đến các loài ốc bởi giá trị
thương mại và thực phẩm của chúng, trong khi đó chúng còn có các giá trị như

Liên họ (Superfamily): Conoidea Fleming.
Họ (Family): Conidae Rafinesque, 1815 - Cone.
Giống (Genus): Conus Linnaeus, 1758.
1.1. Đặt vấn đề
1.1.1. Tính cấp thiết của đề tài
Conotoxin trong các loài Conus là một trong những độc tố đa dạng nhất. Ước
tính có khoảng 700 loài ốc Conus trên toàn thế giới, mỗi loài có đến 50-200 độc tố
conotoxin khác nhau [1]. 4

Độc tố của Conus là hỗn hợp của các polypeptide gồm các acid amin trong
đó có một khung là các cystein với các cầu nối disulfide có khả năng ức chế các
kênh ion và các thụ thể dẫn truyền thần kinh. Ngoài vai trò quan trọng là bắt mồi và
bảo vệ thì conotoxin còn là một công cụ hữu ích trong khoa học thần kinh. Hơn nữa,
conotoxin cũng cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển thuốc, ví dụ ω-
conotoxin MVIIA từ Conus magus có khả năng bao vây kênh calcium N đang là
một trong những loại thuốc đặc hiệu để điều trị cơn đau mãn tính và đột quị [1].
Ốc cối Conus striatus, Conus textile, Conus vexillum là một trong hơn 700
loài Conus sống ở vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới. Độc tố conotoxin của chúng
nằm ở bầu độc và ống độc. Đa dạng về thành phần và cấu trúc của các conotoxin
đang được nghiên cứu và một số loài được cho là có tiềm năng sử dụng như là các
tác nhân dược lý đặc biệt trong chẩn đoán và trị liệu.
Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành “NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ
CONOTOXIN TỪ BA LOÀI ỐC CỐI Conus striatus, Conus textile, Conus
vexillum VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN CỦA ĐỘC TỐ BẰNG
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)”.
1.1.2. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Bước đầu xác định phổ Sắc ký đồ của độc tố 3 loài ốc Conus striatus, Conus

Ốc cối có hình dạng như trái tim (một số vùng ở Việt Nam ngư dân thường
gọi là ốc trái tim), cùng với sự đa dạng về loài thì chúng cũng có kích cỡ rất khác
nhau. Loài có kích cỡ lớn nhất có thể dài đến 23 cm. Ốc cối thường có màu sắc sặc
sỡ và có hoa văn rất độc đáo. Ốc cối là động vật ăn thịt, chúng ăn mồi sống. Chúng
thường đi săn mồi và ăn các loại giun, trùng, cá nhỏ, động vật hai mảnh vỏ và cả
một số loài ốc cối khác. Vì chúng chuyển động rất chậm nên khi bắt một số con mồi
di chuyển nhanh như cá chúng sử dụng độc tố để tấn công con mồi. Chúng cung cấp
nguồn dược phẩm quan trọng nhất và lớn nhất so với bất kỳ loài sinh vật nào trong
tự nhiên. Khi lọt vào cơ thể, phân tử độc của ốc Conus liền phá vỡ liên lạc giữa các
tế bào. Các nhà nghiên cứu đang bào chế thuốc chữa trị cho các bệnh thuộc hệ thần 6

kinh tự động miễn dịch, ung thư và triệu chứng đau mạn tính. Thuốc tổng hợp chế
từ chất độc ốc Conus có công dụng gấp morphine hàng nghìn lần mà lại không gây
nghiện. Ngoài ra, nọc độc ốc Conus còn có thể chữa động kinh và trầm cảm mãn
tính. Hình 1.1: Hình dáng bên ngoài Hình 1.2: Hình dáng bên ngoài
Conus vexillum Conus textile

Hiện nay khoa học đã nghiên cứu khoảng 1000 loại peptide từ độc tố ốc cối.
1.2.1. Bộ máy nọc độc của ốc cối
Bộ máy nọc độc của ốc Conus gồm 4 bộ phận: túi độc, ống dẫn độc, túi răng
kitin và vòi phóng độc.

kính khoảng 250 µm. Dưới kính hiển vi quang học cho thấy có 3 vùng khác biệt
trong phần này: lớp ngoài cùng của mô liên kết, lớp biểu mô của tế bào, và một
khoang ở bên trong. Lớp ngoài được tạo nên bởi hầu hết các sợi fibril giống
collagen, các tế bào cơ được nằm sâu trong lớp collagen và kết hợp với các lớp
dưới. Bề mặt bên trong của lớp collagen này là một lớp mỏng vô định hình mà nó
bao bọc lớp tế bào biểu mô. Các tế bào trong lớp biểu mô này có chứa các ty thể tập
trung ở bề mặt quay về phía lớp collagen. Bề mặt trên cùng của các tế bào biểu mô
được bao bọc bởi các lông nhung nhỏ. 8

Mặc dù bản chất của quá trình vận chuyển giả định trong phần đầu ống dẫn
nọc độc chưa được biết, nhưng có thể các chức năng của biểu mô cũng giống như
con đường hấp thu các ion và các phân tử hữu cơ nhỏ (như amino acid, acid béo) từ
khoang ống dẫn giống như một phần của cơ chế tuần hoàn. Các mảnh vỡ tế bào
trong khoang chính là một nguồn cơ chất phân tử hấp dẫn.
- Ống dẫn nọc độc ngoại biên:
Là phần ống dẫn nọc độc khoảng 1/4 khoảng cách đến hầu, có hình thái thay
đổi đột ngột, màu trắng kem, có đường kính khoảng 375 µm. Lớp ngoài vẫn là
collagen, nhưng bản chất của lớp biểu mô khá khác nhau. Các hạt độc có đường
kính ≥ 5 µm.
Trong vùng sâu hơn của ống dẫn nọc độc ngoại biên, các hạt độc cho thấy sự
khác biệt về siêu cấu trúc và có thể được phân chia ít nhất thành 2 lớp. Mối quan hệ
giữ hai lớp này với nhau hoặc với quá trình sinh độc tố nhìn chung chưa được hiểu
rõ từ những đặc điểm giải phẫu. Rất nhiều hạt độc đặc trưng cho toàn bộ ống dẫn
độc ngoại biên, chúng được tìm thấy cả trong các tế bào biểu mô và trong khoang.
Các hạt độc trưởng thành có kích thước dài khoảng 20 µm và rộng khoảng 5 µm
được tìm thấy trong phần gần đầu của ống dẫn độc.
+ Phức hệ vòi hầu: nằm ở phía trước của bộ máy nọc độc:

hầu, và chúng xếp theo đường dẫn cho đến điểm mà ở đó lớp biểu mô này gặp lớp
biểu mô không gấp nếp của túi hầu. Đặc điểm đặc trưng và sự định vị của các tế bào
màu tía này cho thấy rằng chúng đóng một vai trò quan trọng trong sự sản xuất hay
phóng độc. Có thể các tế bào này tiết và góp một thành phần đặc trưng vào chất độc
cuối cùng dùng để phóng. Nhiều thành phần có thể là các peptide không được tìm
thấy ở nơi khác trong ống dẫn độc, các enzyme như phospholipase hoặc chất nhày
đơn giản.
+ Túi chứa kim phóng độc: gồm có một nhánh ngắn và một nhánh cong dài,
nằm phía bên phải hầu. Túi này có chứa rất nhiều kim phóng độc còn được gọi là
dải răng kitin.
+ Phức hệ vòi hầu: 10
Giải phẫu bộ răng kitin của ốc Conus: Dải răng kitin là một bộ phận trong cơ
quan tiêu hóa, những cơ quan này đã biến đổi trong quá trình tiến hóa. Loài Conus
có rất nhiều răng. Các dải răng kitin được xếp song song thành 2 hàng theo chiều
dọc, các đầu nhọn quay về phía đáy túi. Hình thái của răng kitin có thể biến đổi rất
lớn giữa các loài và nó quan hệ mật thiết với các loại thức ăn (Endean & Rudkin,
1965).
Conus không những nhạy cảm với những biến đổi hóa học của môi trường
mà còn có khả năng tạo ra các chất hóa học có mùi hôi làm vũ khí tấn công làm tê
liệt con mồi. Những chất hóa học này tiết ra từ thực quản hoặc tuyến nước bọt sẽ
làm mềm vỏ con mồi và bơm vào cơ thể con mồi sau khi vỏ con mồi bị khoan thủng
bằng hàm răng kitin. Chúng tiêm nọc độc bằng các kim tiêm có dạng như những
chiếc răng kitin. Những dải răng kitin cùng với các chất hóa học đã giúp chúng vượt
qua được sự phòng thủ của con mồi.
+ Túi răng kitin:
- Các tế bào tạo răng nằm ở cuối túi kim phóng độc, chịu trách nhiệm cho
việc hình thành răng. Răng bằng kitin, ban đầu mềm dẻo, nhưng sau đó nó trở nên

- Conotoxin tác động lên kênh natri: µ-, µ0- và δ-conotoxin.
- Conotoxin tác động lên kênh canxi: nhóm ω-conotoxin.
- Conotoxin tác động lên thụ thể nicotinic acetylcholine: họ α-conotoxin.
- Conotoxin tác động lên kênh kali: κ-conotoxin. Conotoxin tác động lên N-
methyl-D-aspartate: họ conantokin.
1.2.3. Tác dụng của độc tố ốc cối
Tác dụng của độc tố ốc cối: chính nhờ vào khả năng phá vỡ liên lạc giữa các tế
bào mà khoa học có thể hiểu được cơ chế hoạt động của tế bào. Tuy nhiên, nghiên
cứu chất độc của ốc cối tỏ ra hứa hẹn nhất ở khu vực y tế chữa bệnh. Hiện nay, các
nhà nghiên cứu đang bào chế thuốc chữa trị cho các bệnh thuộc hệ thần kinh tự động
miễn dịch, ung thư và triệu chứng đau mãn tính. Thuốc tổng hợp chế từ chất độc ốc 12
cối có công dụng gấp morphine hàng nghìn lần mà lại không gây nghiện. Ngoài ra,
nọc độc ốc cối còn có thể chữa động kinh và trầm cảm mãn tính [8].
Trong vòng 20 năm qua, đã có hơn 2.600 cuộc nghiên cứu được tiến hành
nhằm đánh giá một cách chính xác về đóng góp quan trọng của các độc tố chiết xuất
từ loài ốc cối đối với ngành dược và sinh học tế bào. Trong khi nghiên cứu chất độc
có thể gây chết người của một loài ốc biển, các nhà khoa học đã phát hiện chất này
có tác dụng giảm đau. Nhiều độc tố khác của ốc biển cũng đã được dùng để chữa
các bệnh nguy hiểm như tim mạch, Parkinson. Những người bị đau nhức kinh niên
như bệnh nhân bị ung thư, bị cắt cụt tay chân dùng các thuốc giảm đau thông
thường không có hiệu quả, chỉ còn mong vào những thuốc loại morphine - một
chế phẩm của thuốc phiện. Morphine dùng lâu gây nghiện, cứ phải tăng liều và
đến một lúc nào đó, người ta phải truyền chậm để morphine liên tục có trong máu,
ở Mỹ có gần 50.000 người phải truyền thuốc như vậy. Nhưng trong số đó, nhiều
người vẫn còn đau đớn khổ sở. Người ta đã tìm ra thuốc Prialt mạnh gấp 50 lần
morphine, dùng dưới dạng bơm truyền. Prialt là một thuốc tổng hợp, giống như
độc tố của loài ốc biển hình chóp (Cone snail). Người tìm ra thuốc này là Olivera

độc gồm: vòi hút, hầu, ống dẫn độc tố, túi nọc độc, túi răng kitin và các loại
conotoxin trong hệ thống độc tố ốc cối. Cũng trong năm này các nhà khoa học Mỹ
là Manami Nishi

và Alan J Kohn đã nghiên cứu so sánh túi răng kitin của 11 loài
trong giống Conus spp. Trong đó có Conus bandanus và Conus textile.
Năm 2002, Jennifer Marshall, Wayne P. Kelley, Stanislav S. Rubakhin, Jon-
Paul Bingham, Jonathan V. Sweedler, và William F. Gilly trong “Những yếu tố
tương quan đến giải phẫu về sự sản sinh độc tố trong Conus californicus” mô tả chi
tiết về cấu trúc mô học của ống dẫn độc và dải răng kitin đồng thời cho biết chức
năng các cơ quan trong tuyến nọc độc của Conus californicus.
Năm 2008, các nhà khoa học Thomas F.Duda Jr, Matthew B.Bolin,
Christopher P.Meyer, Alan J.Kohn (Mỹ) đưa ra kết quả nghiên cứu khi sử dụng kỹ
thuật di truyền để phân định và mô tả một số loài trong giống Conus spp mà trước
đây biện pháp mô học thông thường chưa thực hiện được gồm các loài sau: Conus 14
sponsalis, Conus nanus, Conus ceylanensis, Conus musicus và Conus parvatus tại
miền tây Ấn Độ - Thái Bình Dương và Conus nux đông Thái Bình Dương.
1.2.4.2. Tài liệu trong nước
Năm 2006, Đào Việt Hà Viện Hải Dương học Nha Trang đưa tin: “Loài ốc
bùn Nassarius papillosus (Linnaeus, 1758) được xác định là đối tượng gây ra vụ
ngộ độc ngày 17-10-2006 tại Quảng Ngãi” [9]. Tại Việt Nam, đã xác định được ít
nhất ba loài ốc cối chứa độc tố dưới dạng nọc độc (venom) có khả năng gây chết
người, nhưng qua con đường chích khi chúng ta vô tình đụng chạm, cầm nắm phải
chúng chứ không phải qua đường tiêu hóa.
Nhưng cũng từ mẫu ốc trên viện Pasteur Nha Trang lại có kết quả sau khi
phân tích là đối tượng gây ra vụ ngộ độc trên với cái tên Pimple Nassa chứa độc tố
tetrodotoxin giống như độc tố có trong cá nóc. Là loại độc tố thần kinh cực độc (liều

chất lượng. Nó đã trở thành kỹ thuật chính trong phân tích định tính, định lượng và
chế tạo các phân tử sinh học…
Các mốc thời gian về phát minh sắc ký có thể khái quát như sau:
+ 1903: Mikhail Twsett dùng ete tách các sắc tố thảo mộc ở một cột phấn
ông đặt tên cho phương pháp là “sắc ký” (Chromatography).
+ 1951: Martin và Synge được giải thưởng NOBEL do định đề về lý thuyết
sắc ký.
+ 1958: Stein và Moore phát triển phương pháp tách trao đổi ion tự động của
các axit amin, kết quả họ nhận được giải NOBEL năm 1972 vì đã xác định Protein
bằng kỹ thuật này.
+ 1959: Porath và Flodin phát hiện Polydextran liên kết chéo có thể được
dùng để phân tách các phân tử sinh học.
+ 1965: Stahl phát hành “Thin Layer Chromatography Handbook (sổ tay sắc
ký lớp mỏng).
+ 1969: Journal Of Gas Chromatography (báo sắc ký khí) trở thành Journal
of Chromatography (báo sắc ký). 16
+ 1972: Maors và Kirkland dùng các tiểu phần có kích thước nhỏ (

10 pm)
làm chất nhồi cột.
+ 1976: Regnier báo cáo phân tách protein bằng HPLC rây phân tử và trao
đổi ion. Sự di chuyển bề mặt phân cách có thể hình thành bởi phép phân tích sắc ký
lỏng/khối phổ (Mass Spectrography).
+ 1977: Krummeu và Frei, Molnar và Horvath thông báo kết quả phân tách
protein, dùng các bơm HPLC kiểm soát bằng bộ vi xử lý. Bennett dùng TFA
(Trifluoro Acetic Axit) để phân tách Peptide bằng sắc ký pha đảo.
+ 1978: Toga Soda giới thiệu các cột TSK để dùng trong các sắc ký rây phân

và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…). Trong
hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá
trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ
lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với
pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác
yếu hơn pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình
sắc ký [6].
1.3.1.3. Phân loại phương pháp sắc ký [5]
Trong phương pháp sắc ký, pha động phải là các lưu thể (các chất ở dạng khí
hay lỏng) còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng
thái tập hợp của pha động, người ta có thể chia sắc ký thành hai nhóm lớn: SẮC KÝ
KHÍ (Gas Chromatography - GC) và SẮC KÝ LỎNG (Liquid Chromatography -
LC). Dựa vào cơ chế trao đổi của các chất giữa hai pha động và tĩnh người ta lại
chia các phương pháp sắc ký thành các nhóm nhỏ hơn. 18
Hình 1.4: Phân loại các phương pháp sắc ký
- Sắc ký khí: trong sắc ký khí mẫu được tách do sự phân bố giữa pha tĩnh và
pha động nhờ cơ chế hấp phụ, phân bố hoặc kết hợp cả hai cơ chế này.
+ Khi pha tĩnh là một chất hấp phụ rắn thì kỹ thuật phân tích được gọi là sắc
ký khí – rắn.
+ Khi pha lỏng được gắn lên bề mặt của chất mang trơ hoặc được phủ dưới
dạng một lớp phim mỏng bên thành cột mao quản thì kỹ thuật này được gọi là sắc
ký khí – lỏng.
- Sắc ký lỏng: là quá trình tách do ái lực khác nhau của các cấu tử lỏng đối
với lưu chất hấp phụ rắn.
+ Lực hấp phụ bao gồm lực Van de Walls, lực cảm ứng, lực liên kết hóa học
và lực liên kết hydrogen.