1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 4
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VÀ ĐỒ THỊ 5
MỞ ĐẦU 5
1. Tính cấp thiết của đề tài 7
2. Mục đích, nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu của đề tài 8
3. Điểm mới và ý nghóa khoa học, thực tiễn của đề tài 8
Chương 1. TỔNG QUAN 9
1.1. Tổng quan về rong Nâu [1] 9
1.2. Tổng quan về Alginate 11
1.2.1. Alginate[1][11] 11
1.2.2. Công thức cấu tạo của axit alginic và muối alginate [1],[11] 12
1.2.2.1. Đặc điểm, cấu tạo của Alginic 12
1.2.2.2. Đặc điểm, cấu tạo của các keo Alginate. 14
1.2.3. Tính chất của một số loại keo Alginate 15
1.3 Một số nghiên cứu về alginate lyase 18
1.4. Những nghiên cứu về Oligo alginate (OA) 19
1.4.1. Những nghiên cứu trong nước 19
1.4.2. Những nghiên cứu ngoài nước 21
1.5. Tổng quan sơ lược về các phương pháp nghiên cứu 23
1.5.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật[6],[8] 23
1.5.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 23
1.5.3. Phương pháp nghiên cứu hình thái vi sinh vật.[6] 24
1.5.4. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme và thu nhận chế phẩm
enzyme[3][4][5][7] 25
1.5.4.1. Phương pháp nuôi cấy 25
1.5.4.2. Thu hồi chế phẩm enzyme 26
Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1. Nội dung nghiên cứu. 28
2


3.5 Kết quả đònh danh vi sinh vật 47
3.5.2. Kết quả nhuộm Gram và sinh hóa đònh danh bằng hệ thống IDS14GNR 48
3.5.3. Kết quả giải trình tự gene 16S trên máy CEQ 8000 và tra cứu trên
BLAST SEARCH 49
3.6. Kết quả thí nghiệm xác đònh hoạt độ enzyme 51
3.7. Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển
của vi sinh vật và khả năng phân cắt của algL do vi sinh vật sinh ra 53
3.8. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả
năng phân cắt của algL 54
3.9. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của
algL 56
3.10. Kết quả thí nghiệm chọn tác nhân kết tủa thích hợp để tách chiết algL từ
dòch enzyme 58
3.11. Đề xuất quy trình thu hồi chế phẩm enzyme algL từ vi khuẩn Klebsiella
sp 60
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 63
4.1. Kết luận 63

4.2. Đề xuất ý kiến 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
PHỤ LỤC 1. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 70
PHỤ LỤC 2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN 75 4

2
Bảng
1.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ oligo alginate đến khả
năng nảy mầm của hạt thóc giống
19
3 Bảng 3.4. Mức độ hao tổn độ nhớt của các dung dòch Na-
alginate khác nhau
44
4 Bảng 3.5.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa đònh danh

47
5
Bảng 3.10. Ảnh hư
ởng của nhiệt độ đến hoạt động của alginate
lyase
55
TÊN HÌNH

1
Hình 1.2.2.1a
:Công thức cổ điển của hai đơn vò monomeric
trong axit Alginic

12
2 Hình 1.2.2.1b: Hình thể dạng ghế của axit Uronic 13
3 Hình 1.2.2.1c: Cấu tạo của axit Alginic 13
4

Hình 1.2.2.1d
: Cấu tạo axit alginic theo mô hình các công thức

trên môi trường
thạch chỉ có Na-
alginate 1,5% và soi dưới kính hiển vi vật kính
100x
43

13

Hình 3.5.1. Khuẩn lạc vi sinh vật phân lập trên các môi trường
khác nhau

46
14 Hình 3.5.2. Hình ảnh tế bào vi sinh vật phân lập được 47
15
Hình 3.5.3. Sơ đồ giải trình tự gene 16S của chủng vi sinh vật
phân lập
49
TÊN ĐỒ THỊ

1
Đồ thò 3.2. Mức độ hao tổn độ nhớt của dung dòch Na-
alginate
1% theo thời gian phân cắt
41

2
Đồ thò 3.4. Mức độ hao tổn độ nhớt của các dd Na-
alginate 1%
khác nhau theo thời gian phân cắt
44

Rong biển là nguồn lợi biển cung cấp các chất keo quan trọng như
Agar, Alginate, Carrageenan dùng trong công nghệ thực phẩm và các ngành
công nghiệp khác. Trên thế giới từ những năm 1980 rong biển đã được quan
tâm nghiên cứu. Năm 1930 công nghệ chế biến các chất Alginate, Manitol,
Agar phát triển mạnh và ngày càng ứng dụng nhiều trong thực tế, đặc biệt là
ở các nước Nhật Bản, Mỹ và Trung Quốc. Theo Luning (1990) tổng sản lượng
của Alginate là 35.000 tấn.[1]
Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng của Alginate
trong các ngành công nghiệp như: Thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công
nghệ dệt, nông nghiệp, công nghệ sinh học, nghiên cứu khoa học…
Kết quả của các công trình nghiên cứu ứng dụng alginate trong nông
nghiệp cho thấy rằng, mạch alginate sau khi cắt mạch có tác dụng kích thích
sự sinh trưởng và phát triển đối với cây trồng [9][10][12][13][14]. Với ứng
dụng này, thiết nghó việc nghiên cứu các phương pháp cắt mạch alginate để
sản xuất chế phẩm kích thích tăng trưởng thực vật là rất cần thiết nhằm tăng
năng suất cây trồng và tạo ra các sản phẩm có giá trò tốt từ đó nâng cao giá trò
kinh tế là một hướng quan trọng đang được các nhà khoa hoc Việt Nam quan
tâm. Chính vì lẽ đó, đề tài “ Nghiên cứu tách chiết Enzyme Alginate lyase từ
vi sinh vật có trong rong biển và bước đầu ứng dụng nó để thuỷ phân
alginate” là rất cần thiết, góp phần ứng dụng công nghệ sinh học vào nông
nghiệp và đời sống sản xuất ở nước ta. 8

2. Mục đích, nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu của đề tài
 Mục đích, nhiệm vụ
Đề tài nhằm phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật trong tự nhiên có
khả năng sinh tổng hợp alginate lyase cao. Tiến hành nuôi cấy chủng vi sinh
vật đã tuyển chọn trong môi trường thích hợp sau đó lựa chọn phương pháp

ống hoặc phân nhánh phức tạp hơn dạng cây có gốc, rễ, thân, lá. Rong sinh
trưởng ở đỉnh, ở giữa, ở gốc các lóng. Ngoài ra, do các tế bào rong dạng phiến
chia cắt sinh trưởng khuếch tán gọi là sinh trưởng bề mặt.
 Thành phần hoá học của rong Nâu
+ Sắc tố
Sắc tố rong Nâu là diệp lục tố (Chlorophyl), diệp hoàng tố
(Xanthophyl), sắc tố màu nâu (Fucoxanthin), sắc tố đỏ (Caroten). Tuỳ theo tỷ
lệ các loại sắc tố mà rong có màu từ nâu – vàng nâu – nâu đậm – vàng lục.
Nhìn chung sắc tố của rong Nâu khá bền.
+ Gluxit
− Monosachride
Monosacharide quan trọng trong rong Nâu là đường Manitol được
Stenhouds phát hiện năm 1884 và được Kylin (1913) chứng minh thêm.
Manitol có công thức tổng quát là : HOCH
2
– (CHOH)
4
– CH
2
OH
Manitol tan được trong ancol, dễ tan trong nước có vò ngọt. Hàm lượng
từ 14 ÷ 25% trọng lượng khô tuỳ thuộc vào điều kiện sống.
− Polysacharide
10


Alginic: là một polysacharide tập trung giữa ở vách tế bào, là thành
phần chủ yếu tạo thành tầng bên ngoài của màng tế bào rong Nâu
Alginic và muối của nó có nhiều công dụng trong ngành công nghiệp,
nông học, y học và thực phẩm.

dạng liên kết với Iod tạo Iod hữu cơ có giá trò cao như: MonoIodInzodizin,
DiIodInzodizin.
Hàm lượng prôtêin rong Nâu ở vùng biển Nha Trang dao động 8,05 ÷
21,11% so với trọng lượng khô. Hàm lượng axit amin cũng đáng kể và có giá
trò cao trong prôtêin của rong biển.
+ Chất khoáng
Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong rong Nâu thường lớn hơn nước
biển. Chẳng hạn: Iod của rong biển lớn hơn trong nước biển từ 80 ÷90 lần.
Hàm lượng Ba lớn hơn trong nước biển là 1.800 lần.
Hàm lượng khoáng ở vùng biển Nha Trang dao động trong từ 15,51 ÷
46,30% phụ thuộc vào mùa vụ và thời kỳ sinh trưởng
1.2. Tổng quan về Alginate
1.2.1. Alginate[1][11]
Alginate là thuật ngữ thường dùng cho các loại muối của axit alginic,
nhưng cũng có thể xem là tất cả các dẫn xuất của axit alginic hay chính bản
thân axit alginic. Ở một số nơi thì thuật ngữ “algin” được dùng thay cho
alginate. Alginate tồn tại trong các thành tế bào của rong Nâu dưới dạng muối
canxi, Magiê, natri của axit alginic. Alginate được hình thành nhờ phản ứng
đồng trùng hợp không phân nhánh của axit α – L – guluronic và axit β – D –
manuronic. Sự khác nhau giữa các block là về kích thước và sự thay đổi các
12

đoạn manuronic (M) và guluronic (G) cũng như sự tồn tại của các block ngẫu
nhiên. Cấu trúc của alginate chòu ảnh hưởng của nguồn rong biển cũng như
điều kiện phát triển của rong. Người ta rất quan tâm đến tỷ lệ M/G vì nó
quyết đònh đến tính chất của gel được tạo thành. Nếu tỷ lệ này càng nhỏ thì
khả năng tạo gel của alginate càng cao và ngược lại.
Alginate cũng có thể được sinh tổng hợp từ một loại vi sinh vật robacter
vinelandii, tuy nhiên sản phẩm alginate do vi sinh vật sản sinh ra có khả năng
tạo gel kém, ít có tính thương mại nên thường chỉ được đề cập đến trong công

6
)
n
. Hai thuyết tương tự nhau,
n = 80 ÷83 do vậy có sự trùng hợp rất lớn. III.1.2.2. Một số tính chất của các alginate.
Hình 1
.2.2.1a
:Công thức cổ điển của hai đơn vò
monomeric trong axit Alginic

13

Theo các tài liệu hoá sinh gần đây mô tả cấu tạo của Alginic gồm các
axit D.Manuronic liên kết với L.Lunuronic bằng liên kết 1 – 4 mạch thẳng
không phân nhánh
1.2.2.2. Đặc điểm, cấu tạo của các keo Alginate.


 Natri Alginate.
Công thức phân tử: (C
5
H
7
O
4
COONa)
n.
Công thức cấu tạo:




 Alginate Amonium
1.2.3. Tính chất của một số loại keo Alginate
Muối alginate của kim loại hoá trò I ( Natri alginate ) dễ hòa tan trong
nước, tạo dung dòch keo nhớt, có độ dính và độ nhớt cao, khi làm lạnh không
đông và khi khô trong suốt có tính đàn hồi.
Muối Alginate của kim loại hóa trò II ( Alginate Canxi, Alginate
Magiê,…) không hoà tan trong nước, tuỳ theo kim loại mà có màu khác nhau.
Khi muối ẩm thì dẻo dễ biến hình, khi khô rất cứng, rất khó thấm nước, nhờ
có tính chất này mà Alginate có rất nhiều ứng dụng trong các lónh vực khác
nhau.
Bột Alginate dễ bò giảm độ nhớt nếu không được bảo quản ở nhiệt độ
thấp.
Khác với Agar thì khi giảm nhiệt độ thì dung dòch Alginate không bò
đông lại, ngay cả khi làm lạnh và tan giá thì độ nhớt và bề ngoài cũng không
thay đổi.
Hình 1.2.2.2b: Công thức cấu tạo Ca-alginate
16

Propyleneglycol Alginate ( PGA) với 80 – 85% nhóm -COOH được
ester hoá có tác dụng nhỏ nhất với ion Canxi, do đó hợp chất này được ứng
dụng trong công nghiệp sữa. PGA giảm tính hoà tan khi pH môi trường < 4.
pH = 2 thì PGA bò kết tủa.
Các loại Alginate khác nhau thì sẽ bò phân huỷ ở các nhiệt độ khác
nhau. Theo nghiên cứu của Kenfikato – Khoa Thuỷ sản Trường Đại học
Hokaido, Nhật Bản cho thấy nhiệt phân hủy của các Alginate trong bảng sau:
Alginate
Nhiệt độ phân hủy (


Trọng lượng phân tử trung bình của Alginate được xác đònh bằng phương
pháp độ nhớt (Viscometric method).
18

1.3 Một số nghiên cứu về alginate lyase
R. Scott Doubet và Ralph S. Quatrano (1982), thuộc trường Đại học
Oregen State. Nghiên cứu phân lập các vi khuẩn biển có khả năng sinh Lyase
đặc hiệu cắt mạch Alginate. Cho thấy các Alginate lyase được chiết rút từ
môi trường của một số vi sinh vật đã được phân lập. Các lyase này được sinh
ra nhờ môi trường có alginate tự nhiên và có hoạt tính với cả block của axit
manuronic và axit guluronic của chuỗi polymer alginate. Lyase đặc hiệu đối
với axit guluronic được tách chiết từ môi trường, trong khi đó lyase đặc hiệu
với axit manuronic được tách chiết từ tế bào vi khuẩn.[20]
Năm 1992, Manabu Kitamikado, Chao-Huang Tseng, Kuniko
Yamaguchi và Takashi Nakamura thuộc trường Đại học Fukuoka, Nhật Bản.
Nghiên cứu hai chủng vi sinh vật sinh enzyme alginate lyase. Cho thấy các
algiante lyase ngoại bào được tinh sạch từ Vibrio harveyi Al-128 và V.
alginolyticus ATCC 17749. Sự hình thành enzyme này đầu tiên cắt đứt liên
kết α 1,4 bao gồm các đơn vò L-guluronate và sau đó là cắt đứt các liên kết
beta 1,4 bao gồm các đơn vò D-manuronate. Phân tử lượng của enzyme này
được xác đònh khoảng từ 47.000 đến 57.000 Da và có điểm đẳng điện lần lượt
là 4,3 và 4,6. Enzyme từ chủng AL-128 hầu như hoạt động ở môi trường có
nồng độ NaCl từ 0,3 đến 1,0 M. Còn môi trường hoạt động tối thích của
enzyme từ chủng ATCC 17749 là sự có mặt của CaCl
2
có nồng độ từ 5 đến 10
mM.[17]
Năm 2000, Wataru Hashimoto, Osamu Miyake, Keiko Momma,
Shigeyuki Kawai và Kousaku Murata thuộc trường Đại học Kyoto, Nhật Bản.

C. Hoạt lực của enzyme
bò mất hoàn toàn bởi sự thẩm tích và phục hồi trở lại khi thêm 0,1 M Na
+
hoặc
K
+
.[21]
1.4. Những nghiên cứu về Oligo alginate (OA)
1.4.1. Những nghiên cứu trong nước
Năm 2002, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt đã sản xuất chế phẩm tăng
trưởng thực vật T&D bằng cách chiếu xạ tia gamma lên phân tử alginate để thu
nhận OA có khối lượng phân tử thấp hơn.
20

Năm 2002, Trần Thái Hòa và Nguyễn Thò Ái Nhung ở Trường Đại học
Khoa học, Đại học Huế nghiên cứu ảnh hưởng của oligo alginate đến khả
năng nảy mầm của hạt thóc giống. Oligoalginate dùng để thí nghiệm được tạo
ra bằng 3 phương pháp : chiếu xạ, phân cắt bằng kiềm và axit mạnh. Kết quả
như sau:[10]
STT
Tổ hợp nồng
độ tối ưu
Sức nảy
mầm (%)

Chênh lệch %
so với mẫu đối
chứng
Tăng % so
với đối

tất cảc các nồng độ nghiên cứu. Sản lượng lạc tăng 1,77 – 7,48 tạ/ha và đạt
cao nhất (26,83 tạ/ha, tăng 38,66%) ở nồng độ OA tối thích (80 ppm).
1.4.2. Những nghiên cứu ngoài nước
Năm 2003, các nhà nghiên cứu ở Trường Đại học Nagasaki, Nhật Bản
đã nghiên cứu khả năng kích thích sự phát triển rể cây cà rốt và lúa của các
Oligo uronate chưa bảo hoà từ alginate. Các oligo uronate chưa bảo hoà được
chuẩn bò nhờ một enzyme alginate lyase tiêu hoá polymannuronate ( PM ) và
polyguluronate ( PG ), được tinh sạch từ Pseudomonas sp. Sự phát triển của rể
được xác đònh bởi sự dài ra của rể cây càrốt và cây lúa được ủ trong môi
trường có chứa 0,8% agar trong bóng tối. PG và PM không có khả năng kích
thích sự phát triển rể nhưng khi ta trộn lẫn các enzyme tiêu hoá PG thì nó lại
có khả năng kích thích sự phát triển của rể của hai loại cây này ở nồng độ tối
thiểu là 0,5mg/ml, khả năng kích thích sự phát triển rể là cực đại ở nồng độ
0,75 mg/ml.

Hình 1.4.2a: Ảnh hưởng của hỗn hợp Oligomanuronate (Oligo-M) chưa
bảo hoà và hỗn hợp Oligoguluronate (Oligo-G) chưa bảo hoà lên sự dài ra
của rể cây cà rốt (a) và cây lúa (b).
Độ dài của rể (cm)

Thời gian (ngày)
Độ dài của rể (cm)
T
hời gian (ngày)

không được phân cắt được loại bỏ hoàn toàn. Phần alginate được giữ lại là
một hỗn hợp của disacharide tới octosacharide và có khả năng kích thích sự
phát triển chiều dài rể cây rau diếp ( khoảng 2 lần so với mẫu đối chứng) ở
Độ dài của rể (cm)

Nồng độ (mg/ml)

Hình
1.4.2b
:

Ảnh hưởng của nồng
độ
hỗn hợp oligo-G đến sự dài ra của rể cây
càrốt (□) và lúa (■). Độ dài của rể xác
đònh sau 8 và 14 ngày.
Hình
1.4.2c
:

Ảnh hưởng của mức độ
đồng trùng hợp oligo-G đến sự dài ra
của rể cây càrốt (□) và lúa (■). Độ
dài của rể xác đònh sau 8 và 15
ngày. (nồng độ 0,75mg/ml)
Độ dài của rể (cm)

23

nồng độ trong khoảng 200 – 300 µg/ml. Mức độ ảnh hưởng khác nhau của các

1.5.3. Phương pháp nghiên cứu hình thái vi sinh vật.[6]
Vi sinh vật là những cơ thể sống vô cùng nhỏ bé. Phần lớn các vi sinh
vật không thể quan sát bằng mắt thường mà phải nhờ đến độ phóng đại của
kính hiển vi. Chính vì thế, kính hiển vi là một dụng cụ vô cùng quan trọng,
không thể thiếu trong việc nghiên cứu đặc tính hình thái của vi sinh vật cũng
như hình dáng, kích thước, khả năng di động, sự hình thành bào tử, sinh sản….
Các tiêu bản tạm thời được sử dụng để quan sát hình thái vi sinh vật
Đối với tiêu bản tạm thời có nhuộm màu, thuốc nhuộm vi sinh vật phải
không độc hoặc ít độc đối với vi sinh vật cần quan sát và phải pha loãng đến
nồng độ nhất đònh để đảm bảo vi sinh vật vẫn còn sống và di động.
Tế bào sống và tế bào chết có thể phân biệt khi nhuộm màu với xanh
methylene. Methylene có màu xanh khi không có sự hiện diện của hydro và
không có màu khi có mặt của hydro. Khi các tế bào ở trạng thái nghỉ ( trạng
thái ở pha ổn đònh trên đường cong sinh trưởng ), mặc dù còn sống nhưng
không có khả năng khử màu xanh của methylene thành không màu. Do đó,
nên quan sát tế bào ở giai đoạn đầu của pha tăng trưởng.
Cũng có thể nghiên cứu hình thái vi sinh vật bằng phương pháp nhuộm
của Christian Gram. Nhuộm Gram không những giúp phân biệt vi khuẩn nhờ
các đặc điểm của hình thái và sự sắp xếp của tế bào mà còn cung cấp thông
tin về lớp vỏ tế bào. Khi nhuộm theo phương pháp này tế bào vi khuẩn Gram
dương có lớp vỏ tế bào tạo bởi peptidolycan sẽ có màu tím còn vi khuẩn Gram
25

âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn ( do có ít peptidolycan ) và được bao bọc bởi
lớp màng mỏng sẽ có màu hồng.
1.5.4. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme và thu nhận
chế phẩm enzyme[3][4][5][7]
1.5.4.1. Phương pháp nuôi cấy
Để thu được enzyme có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật khác nhau
về nguyên tắc. Phương pháp nuôi cấy bề mặt hay phương pháp nuôi cấy bề