I HC QUC GIA HÀ NI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyc Tú

TẠO KHỐI CẦU ĐA BÀO UNG THƯ BIỂU MÔ TUYẾN VÚ
DÒNG MCF-7
LU THC S KHOA HC
Hà Ni - 2014

I HC QUC GIA HÀ NI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

nhnh và tiêu chun nghiêm ngt c chc kim nghic
phm.
Mt quy trình kim ngim thuc ch loi thuc khác
nói chung có th kéo dài t 10- m nhi n khác nhau, t phát hin
thuc, sàng lc tivi s ng chtng, m
nghim khác nhau nhm bo các loi thu     m s t
c hiu qu u tr cao và có ít tác dng ph nhi bnh.
Sàng lc tin lâm sàng trên các dòng t bào nuôi cp in vitro 
mt vai trò không th thay th u tiên ca kim nghim thuc. Vi s
ng cht có th lên ti hàng vn, mô hình nuôi cy t p cho phép nhanh
chóng tìm ra nhóm cht có hiu qu u tr tt nht. Tuy nhiên, thc t cho thy rt
nhiu chp li không có tác dng khi th nghim trên
ng v tip tc phát trin thành thuu tr. V này
bt ngun t vic các t p thiu hu hm ca các kh
in vivo  
Chính vì vy, vic phát trin mt mô hình in vitro mi mô phc chính xác
c tính ca các kh s  hiu qu
sàng lc, hn ch s ng thuc phi th nghing vt thí nghi
i tình nguyn, t m ti thiu thi gian và chi phí cho vic phát trin mt loi
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
2

thuc mc nhng tr ngi liên quan tc khoa hc vi các t
chc bo v ng vt, t chc nhân quyn, t chc y khoa.
 góp phn thc hic nhng m ti Vit Nam, chúng tôi tin hành
thc hi tài:
“Tạo khối cầu đa bào ung thư biểu mô tuyến vú dòng MCF-7”
Vi các mc tiêu:

thuc là tin hành sàng lc các hp cht có ti hàng vn các hp chu trên
các mô hình in vitro (drug discovery). Ti   p cht này s c   th
nghim tin lâm sàng (pre-clinical) trên ng vt vi các c n. Trong
n này, các t chc kim nghim da trên các kt qu kim tra tin 
quynh các cht trên   nghii hay không. Toàn
b n này din ra trong khong 6-
Khi mt loi thu tin hành sàng li bnh hay còn
gi là sàng lc lâm sàng (clinical), nó s phi trn th nghim vi quy mô
n trong thi gian kho
 n I: c tin hành  nhi khe mnh nhm kim tra các tác dng
ph ca thu chuyn hóa và bài tit ca thu.
 c tin hành vi mm tra hiu qu và thu thp s li
b v hong ca thui bnh. Bu tr vi loi thu
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
4

th nghim s c so sánh vi các bu tr hou tr vi
mt loi thuc khác song song vng ph.
 n III: các kim tra v tính an u qu s c tip tc tin
i bnh khác nhau, liu ng thu
khi kt hu tr cùng vi các thuc khác.
 t yêu cu ca c n trên, các loi thuc th nghim s phi
hoàn thành mt s th tc pháp lý và khoa hc trong khong thi gian mi
 có th chính thc tr thành mt sn phi.

Hình 1. Thời gian trung bình cho một quy trình phát triển thuốc. Quá trình sàng lc
c phm có th dii vài ch hàng vn chu tuyn
chn ra mt hoc vài cht yêu cu kinh[74].

mà vm bc các v c trong khoa hc. Vi s ng cht phi sàng
lc tu tiên có th lên ti hàng vn thì vic s dng các mô hình in vitro 
trên t y là rt cn thit  có th c
các nhóm cht có hiu qu thu thp các s li v c tính, các tác dng
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
6

không mong mun c c  T nhng
kt qu thu u, các kim tra ting vt  mô hình in vivo
s tit kim tht nhiu thông qua gim thic s ng cht, s
ng vt tham gia các th nghim.
1.1.2.1.Mô hình in vitro
Mô hình nuôi cấy cơ quan
i mô hình nuôi cy c n nht c s dng t nh
c tách ra khy in vitro, 
vi các hp cht cn thm cc tính nguyên vn ca
i quan h gia t bào vi t bào, nh v
vu kin in vivo. Tuy nhiên, do nht v mu vt mà vi
giá hiu qu ca thuc có nhiu sai s, do vy vic s dng mô hình này b hn ch, và
 áp dng vào sàng lc thuc quy mô ln [4].

Hình 2. Nuôi cấy tinh hoàn chuột để sản xuất tinh trùng in vitro.
(A) Các mnh tinh hoàn nuôi trên giá th    ng nuôi cy có b sung
KBR. (B) Mô tinh hoàn nuôi cy sau 7 ngày. Bar=20µm [38].
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
7

 rng cùng mt thma t
bào  vi hp cht ch theo mt chiu, thiu s a t  vi
h min da h min dch vi hp chy, mô hình này không mô
phu kin in vivo c [48].
Mô hình nuôi cấy ba chiều (3D)
Mô hình nuôi cy 3D là mô hình mà  c t chc trong không
gian ba chiu vi s h tr ca các giá th sinh hc nhm mô phng mt cách chính xác
u trúc ca mt khi mô thc s  sinh hc. Trong mô hình 3D, các t
bào không ch th hia chúng vi các t bào xung quanh
i giá th sinh hc, cht nn ngoi bào mà còn th hin khá chính xác các
phn ng vu king, thuc th nghim.
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
9

Mt mô hình th nghim th him c
sinh hc rõ ràng s cho các kt qu th nghii các t bào nuôi cy
ng. Tuy nhiên, mô hình nuôi cy ba chih mô phng
a h min dch lên các th nghim [18, 48, 51].
1.1.2.2.Mô hình động vật - in vivo
Thc nghim cho thy rng các t bào ca khi u ác tính có th cy truyn cho các
các th khác thuc cùng dòng, chúng có kh n và git cht vt ch mi. Tt
c các t ng cng vng thành và các t bào  khi
u ca thc vng vt da gai và các dng sng thp khác không có kh 
này. Ch có các dng sng t chng vt có vú
mi có kh  khi u ác tính. U là mnh c y
bng chng v  ng long t c.
c s dng v thay th i trong vic nghiên cu
c thuu hoàn  khoa hc [48].

phòng thí nghim trên th gii trong 40 . Tuy nhiên nuôi cy 2D không phn ánh
c cng thái sinh lí c. Chính vì vy, gây dng
mô hình nuôi cy 3D rõ ràng là hu ích và phù hc thit k các b khung có
vai trò h tr cho s t chc các t  kim soát s i các cht dinh
ng và cht thy h thng nuôi cy 3D tin b và phc chính xác
m sinh lý khi mô cng vng thi, mô hình nuôi cy
kh t k các h thng ng nuôi cy gia nhiu loi t bào.
Mc tiêu ch yu là gây to các h thng nuôi c phát trin các mô hình
sàng lc thuc. Ma tng quan này là cung cp c
thu thit k mt mô hình 3D [13, 30].
Mô hình nuôi cy 3D có th c chia thành các nhóm  ki
gm c phôi), mô hình khi cy microcarrier, mô hình thit k
mô. Mô hình nuôi cy c s dng trong các nghiên ci s chính xác
tuyi các thông tin cho mt loi i
vi mô não và thn  c duy trì trên gel hoc trên màng bán thm
trong ng nuôi cm ca mô hình này c cu
trúc và s hin din ca các loi t bào khác nhau trong mô p nhi
trong duy trì mu  thi gian dài và cn các thit b c bi có th chp nh sâu trong
mu [13, 35, 38].
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
12 Hình 5. Các mô hình nuôi cấy ba chiều -3D.
(A) Mô hình nuôi cquan nuôi cc ct nh thành các m
t trên giá th xp có h tr b i kim lo  c nuôi c   ng
chuyên dng. H thng nuôi c  c gi  mt phân cách gia pha khí và pha
lng. (B) Mô hình nuôi cy khi c bt treo. Các t bào t tp

nhng t bào t tp vi nhau trong quá trình nuôi cy in vitro. c tính ca mt s
dng t   ng vt. Nhng t bào ca khi cu 
 m bo phát trin trong không gian ba chi 
bào - t bào, t bào - cht nn ngoi bào, t bào - chng ca ng nuôi
cy và chúng vn gi c nh  u ki.
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
14

Trong nghiên cmô hình c gi vi mt tên riêng là khi c
t tt là MCTS hay spheroid. Nhng khi c
bào  i nhng khi u rn nh  vì chúng có
nh ng khi u in vivo [58]. Nhng t bào phát trin
bên trong nhng khi c vm bc nh
n  u kin in vivo. Nhng thí nghim trên nhng khi cu này cho kt
qu  khi làm thí nghim trên nhng khi u rn in vivo.
Khong 
lp nhng t bào mô phôi gà và phát hin chúng có kh p hp li vi nhau
u kic bit. T  ra mt thi k mi cho nghiên c
phát trin ca nuôi cy 3D.
- ng s c kht khi ung
 và có nhng nghiên cu v s phát trin ca nhng t  [45].
- ng s tin hành các thí nghim nghiên cu s 
ng ca nhng t u x [43].
- Tháng 10/1977, Robert Sutherland công b trên tp chí Cancer Research v 
pháp to khi spheroid t tám dòng t i và sáu ca chut) trên
giá th agar [44].
- Trên tp chí Cancer Research s  mt
cách chính thc mô hình mi s dng khi c trong nghiên c

vng in vivo [13, 43, 49].
Cấu trúc: Khi c có cu trúc vi ba lp i tách bit vi
ng và t ch
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
16

 Lp vòng ngoài: Gm khong t 2-3 lp t bào sng, phân chia mnh xp khít
 dày mng ca lp này tùy thuc tng dòng t u kin
ng và ngun t  to spheroid. Trong nuôi cy khi
co thành t nhng mnh mô sinh thit, có th quan sát thy các liên
kt t bào-t bào  li kính hin t.
 Lp trung gian: Gm nhng t bào vn sng phân chia. Các t
bào ca vùng này có th hòa nh  thành nhng t bào ca vòng ngoài hoc
vòng trong tùy thu u kin nuôi cy (có mch máu hoc không, n 

 Lp trong cùng: còn gi là lõi hoi t, bao gm nhng t t, có nhân kt
c li nên ánh sáng quang hc không th c, vì vy lp này có màu
i kính hi dày mng ca lp này tùy thuc vào tng
n khác nhau ca quá trình ng khi spheroid [2, 43, 57].

Hình 7. Sự tương đồng trong cấu trúc các lớp tế bào và sự tương tác với các điều kiện
môi trường của mô hình khối cầu đa bào ung thư (phải) khối u in vivo (trái) [36]
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
17

Hình thái tế bào: Các t y 2D có hình thái tri rng không t

khi nuôi cy 2D. T phát trin  mô hình 3D phn ánh các mô hình toán hng
hc ca khi u in vivo ti mô hình 2D. m cu trúc
ca khi spheroid khin cho ch mt vài lp t bào bên ngoài cùng ca khi mu
kin tip xúc và thu nh các yu t ng nuôi cy, o
 i các sn phm không cn thit hay bt li. c li, các t
bào nuôi cc cung c u king thi
không b gii hn b t nhiu [31, 43].
Chu trình tế bào: nhng d liu so sánh gia t l các pha trong chu trình t bào
ca khi spheroid vi nhng t bào trong khi u in vivo và nuôi cy có s
ging nhau v s ng t bào  n khác nhau (pha G, M,  các t bào
 pha G1, mt t l nh  t bào  pha S và G2, rt ít các t bào  pha M [11, 66].
Đường cong sinh trưởng: Nhng hóa
sinh gia khi cng khi u in vivo dn s ng v kích
c, t l nhng vùng cu trúc và c ng gia khi cu 
nhng kh. S ng ca các khi c tuân theo ng
thng cc mt, bc hai. Có th da trên ng
ca khi c   u tr  nhng thm có li
nht [2, 43].
Sự di cư của các tế bào: Nhiu kt qu thc nghim trên các khi c
các dòng t bào biu mô vú chui chun
i) cho thy, các t p ngoài có kh i
b mt khi. T l a các t bào có th b ng rõ rt c x lý vi các
c EDTA. Nghiên cu s u t n s di
ca các t bào trong khi ccó th hu ích cho s hiu bit s  di
a khi u in vivo [43, 68].
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
19


Mt trong nho khi c n nht là s dng các loi
y có b mt chng bám dính. c công b t nh
1977 bi Robert Sutherland và cng sc s dng và ci tin bi nhiu nhóm
tác gi khác (Landry J. et al., 1985; Haminton GA et al.,2001). Nguyên lý c
pháp này là to mt b my c bit nhn s bám dính xung nn
ca t u kin cho các t ng liên kt li vi
nhau to thành khi t n nht là s dng dung dch aga hoc
agarose m hong nuôi cy ph mt lp mng lên trên b mt
cy nhn s tip xúc ca t bào vi b m [26, 44, 62].
Cho t dng b mt chu ci
tic kia. Nhiu loi nchng bám dính c sn xut
chuyên cho vic gây to khi cc phi ph b mt nhng lo
n hóa các thao tác thc nghim. Gt hic
ng dng là s dng các bc thit k c bit, Các bc
làm t các hp kim và polymer mi vi b mn khin t bào hoàn toàn
mt kh ng thc to sn các khuôn/ging nh bên trên giúp
cho s to thành khi t c l so v [51,
62].
t trong nhc s dng ti nhiu phòng thí nghim
nuôi cy t ng vt trên th gii do có p, d thc hin, thao
tác, theo dõi       n. Tuy nhiên, m  m rt ln mà
p ph khng ch c hình dc ca
các khi co thành. u này s dn nhnh trong các
th nghim sàng lc và kim nghim thuc [26, 44].
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
21

Phương pháp tạo giọt treo

cho ty gic ci thin nhiu nhm to thun li
v mt thao tác k thui thc hin.  nht là vic ch to thành công giá
th to spheroid 384 chuyên dng cho gây to khi cu bt treo phc
v cho th nghim thuc. Giá th c làm t polestyrene và ch to bng cách ép
phun vnh dng 16 hàng, 24 ct, bao gm 384 ging (v trí) to git treo. Mi v trí
to gic thit k vi phn g gii hn  i hn và nh
c ca các git treo, tng. Các rãnh cha
c  phn vin  n ch s 
cng nuôi cy các git treo. Các thao tác trên giá th 384 t gây to git treo
ti thay th ng, b sung thuc th nghic h tr bi cánh tay robot vi
phn mm chuyên dn và chính xác hóa các th nghim [51].
Các phương pháp tạo khối cầu đa bào khác
t nhiu cách thc gây to khi spheroid
c phát trin và s dng vi nhm riêng. Mt nhóm l
pháp phát tring s dng các yu t  làm t bào t tp và liên kt
Luận văn cao học

Nguyễn Đắc Tú K20 - Sinh học thực nghiệm
23

vi nhau. Có th k  ng, âm thanh. Tuy nhiên nhng ng này
ng là không ti vi t bào,  cn s dng nhin thit b chuyên dng.
Mt k các vi khuôn hay giàn r vi m
va tu kin cho s bám và hình thành khi da vào các khung sinh hc này, va
u khic hình dng và cu trúc không gian ca các khi t bào to thành theo mc
a th nghim. Cháp này rt tn kém và phc tp do cn nhiu máy
móc và k thuc bit [28, 47, 67, 70].
1.2.3.2.Các phương pháp nuôi cấy khối cầu đa bào
Nuôi cấy động
K thut nuôi cy khi cc v cho kim nghim thuc cm bo