Bộ môn Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẶNG THỊ OANH NGHIÊN CỨU TỈ LỆ LƢU HÀNH VÀ PHÂN TYPE CÁC
CHỦNG SALMONELLA TRONG THỊT GÀ TƢƠI SỐNG TẠI
BỐN TỈNH MIỀN TRUNG VÀ NAM BỘ CỦA VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. PHẠM XUÂN ĐÀ
HÀ NỘI, NĂM 2013
Bộ môn Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc
tới:
- PGS.TS. Phạm Xuân Đà đã tận tâm hướng dẫn, góp ý, giúp đỡ, động viên
và khuyến khích tôi cả trong học tập và nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian tôi
học tập tại khoa sinh học trường ĐH KHTN- ĐHQG Hà Nội và làm việc tại Viện
Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia.
- Các thầy cô trong bộ môn Vi sinh vật học, trường ĐH KHTN- ĐHQG Hà
Nội đã đào tạo và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học.
- Các đồng nghiệp tại Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc
gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi và đóng góp những ý kiến quý báu
nhất cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này .
- Tập thể các bạn lớp K17 Sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho
tôi và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận
văn này
- Cuối cùng cho phép tôi được gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và đồng
nghiệp đã cổ vũ tôi học tập và nghiên cứu.

21
1.2.4. Các phương pháp truyền thống
22
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….
27
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu…………………………………………………
27
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu……………………………………………………….
28
2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu
28
2.2.2. Phân lập và định typ Salmonella…………………………………………
29
2.2.3. Xử lý số liệu ………………………………………………
44
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
45
3.1. Xác định tỉ lệ lƣu hành của Salmonlella trong thịt gà tươi tại bốn tỉnh
miền Trung và Nam bộ ……………………………………………………………
45
3.1.1. Tỉnh Hà Tĩnh…………
48
3.1.2. Đà Nẵng
50
3.1.3. Đồng Nai
52
3.1.4. Thành phố Hồ Chí Minh
54
3.1.5. Tỉ lệ dương tính Salmonella trên mẫu thu thập tại siêu thị và chợ…….
57

tử sử dụng kỹ thuật PCR với độ nhạy và độ đặc hiệu cao đã đóng góp không nhỏ
vào việc phát hiện nhanh nguồn lây nhiễm Salmonella. Hơn nữa, kỹ thuật PCR còn
có khả năng phát hiện các nguồn lây nhiễm bị tổn thương, không thể mọc trên môi
trường nuôi cấy. Phương pháp miễn dịch cũng đã và đang được áp dụng ở nhiều nơi
trên thế giới. Bên cạnh đó không thể phủ nhận vai trò to lớn của phương pháp nuôi
cấy truyền thống, mặc dù mất nhiều thời gian hơn nhưng vẫn là một phương pháp
sáng giá, một công cụ hữu ích trong việc xác định sự có mặt của Salmonella trong
mẫu, và vẫn là phương pháp mà phần lớn các phòng kiểm nghiệm thực phẩm trong
nước sử dụng.
Salmonella đã và đang là nguyên nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm tại
nhiều nước trên thế giới. Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng Salmonella có trong
các thực phẩm như thịt, gia cầm, trứng, các sản phẩm sữa, hoa quả, rau và các sản
phẩm thực phẩm khác, trong đó gia cầm được xem là nguồn thực phẩm chính mang
Bộ môn Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ 2
mầm bệnh salmonellosis [10]. Thịt gà là một trong những thực phẩm phổ biến của
người Việt Nam, trong đó có tới 621.1 nghìn tấn thịt gia cầm được sản xuất vào
năm 2010 [6]. Trung bình lượng thịt gia cầm tiêu thụ theo đầu người ở Việt Nam là
7.1 kg một người. Cũng như nhiều nước đang phát triển khác, dữ liệu về sự lưu
hành Salmonella trên thịt gà tươi của Việt Nam hiện nay còn đang hạn chế. Một vài
nghiên cứu trước đây đã được công bố, nhưng có phần hạn chế về phạm vi lấy mẫu,
chỉ một vài tỉnh, thành phố hoặc một vùng miền nào đó, ngoài ra còn hạn chế về số
lượng mẫu phân tích. Do vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã mở rộng phạm vi
lấy mẫu và số lượng mẫu phân tích trên 2 vùng sinh thái.
Để góp phần vào công cuộc kiểm soát sự lây nhiễm Salmonella ngay từ khởi
nguồn lây nhiễm, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tỉ lệ lưu hành và
phân typ các chủng Salmonella trong thịt gà tươi sống tại bốn tỉnh miền Trung
và Nam bộ của Việt Nam”, với mục đích và nội dung nghiên cứu như sau:

chứa FeSO
4
như thạch TSI. Salmonella có quan hệ mật thiết với chủng Escherichia
và đều được tìm thấy rộng rãi trong động vật máu nóng, máu lạnh, bao gồm cả con
người, và trong môi trường tự nhiên. Chúng gây ra các bệnh như thương hàn, phó
thương hàn và các bệnh ngộ độc thực phẩm.
Salmonella sống được trong đất, nước và đường tiêu hóa của một số động
vật. Salmonella có thể sống trong môi trường pH 6 đến pH 9, nhưng sinh trưởng tối
ưu ở pH trung tính. Với những môi trường có nồng độ muối cao hơn 8%,
Salmonella không thể tồn tại được. Salmonella phát triển tốt ở nhiệt độ 6
0
-42
0
C,
thích hợp nhất ở 35-37
0
C, ở nhiệt độ từ 18-40
0
C, vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày.
Bộ môn Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ 4
Salmonella là vi khuẩn kị khí tùy tiện, có thể phát triển được trên những môi
trường nuôi cấy thông thường. Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển
sau 24 giờ nuôi cấy.
Salmonella không lên men đường lactose (hình 1.2), lên men đường glucose
và sinh hơi. Thường không lên men đường sucrose, salicin và inositol, sử dụng
được citrate ở môi trường Simmons. Tuy nhiên, không phải loài Salmonella nào
cũng có những tính chất này, như Salmonella Typhi lên men đường lactose, lên men

Arizonae
IV
diarizonae
V
houtenae
VI
indica
V
Tính chất sinh hóa

Dulcitol
+
+
-
-
-
D
+
ONPG
-
-
+
+
-

-
-
+
-
+
L(+) -tartrate(a)
+
-
-
-
-
-
-
Galacturonate
-
+
-
+
+
+
+
Glutamyltransferase
+(*)
+
-
+
+
+
+
Glucuronidase

-
Lysis by phage O1
+
+
-
+
-
+
D
Số lƣợng typ
huyết thanh
1.454
489
94
324
70
12
20
Phân bố
Động
vật máu
nóng
Động
vật máu
nóng
Động vật máu lạnh và môi trường
Bộ môn Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ 6

C trong 2 giờ), kháng cồn (không bị phá hủy khi tiếp xúc với cồn 50%), rất
độc (1/20 mg có thể giết chết chuột nhắt sau 24 giờ) nhưng bị phá hủy bởi formol 5
‰. Trong sơ đồ Kauffmann – White, các kháng nguyên thân O được phân chia
thành các nhóm kháng nguyên O riêng biệt và được đặt tên bắt đầu từ nhóm A bao
gồm các kháng nguyên O:1, O:2, O:12 đến nhóm Z, nhóm mà chỉ có một kháng
nguyên duy nhất là O:50. Từ nhóm Z (O:50), các kháng nguyên được đặt tên bởi
các kháng nguyên O bắt đầu từ O:51 đến O:67 [18] (Bảng 1.2).
Salmonella nhóm A: kháng nguyên O chính là O:2
Salmonella nhóm B: kháng nguyên O chính là O:4
Salmonella nhóm C1-C4: kháng nguyên O chính là 6,7
Salmonella nhóm C2-C3: kháng nguyên O chính là O:8
Salmonella nhóm Z: kháng nguyên O chính là O:50
Sau đây là bảng các nhóm huyết thanh Salmonella và các kháng nguyên O:
Bảng 1.2. Nhóm huyết thanh Salmonella và các kháng nguyên O [18]
Nhóm
Kháng nguyên O
Nhóm
Kháng nguyên O
Nhóm
Kháng nguyên O
A
2
G1-G2
13
O
39
B
4
H
6,14

W
45
E1-E2-E3
3,10
N
30
X
47
E4
1,3,19
O
35
Y
48
F
11
P
38
Z
50

Bộ môn Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ 8
1.1.2.2. Kháng nguyên roi H Hình 1.5. Kháng nguyên roi H


H:g,m ở Salmonella Typhi. Nếu nuôi cấy các vi khuẩn này trong môi trường có
huyết thanh kháng a, g, m hoặc d thì chúng trở nên không di động. Nhiều typ huyết
thanh quan trọng chỉ gồm có một pha kháng nguyên H là: Salmonella Paratyphi A,
Salmonella Typhi, Salmonella Derby, Salmonella Enteritidis và Salmonella Dublin.
1.1.2.3. Kháng nguyên Vi [38]
Đây là một kháng nguyên đặc biệt và thuộc nhóm các kháng nguyên K.
Kháng nguyên Vi chỉ có ở các chủng quan trọng là Salmonella Typhi và Salmonella
Paratyphi C và Salmonella Dublin. Kháng nguyên Vi là lớp màng mỏng bao bọc
ngoài cùng tế bào vi khuẩn, liên quan đến tính độc đối với một số vật chủ nhất định,
không quan sát được bằng kính hiển vi quang học thông thường. Tuy nhiên kháng
nguyên Vi có thể bao phủ kín kháng nguyên O, trong trường hợp này vi khuẩn sẽ
không ngưng kết O, cần phải đun nóng huyền dịch vi khuẩn (100
o
C/20 phút) để
tách kháng nguyên Vi ra khỏi tế bào.
Ngoài ra một số chủng còn có kháng nguyên tua riềm (fimbriae). Kháng
nguyên tua riềm là những lông nhỏ trên bề mặt của tế bào, có vai trò quan trọng
trong quá trình lây nhiễm sớm của mầm bệnh với vật chủ. Trong đó, Salmonella
Enteritidis có kháng nguyên tua riềm.
1.1.3. Ngộ độc thực phẩm do Salmonella
Bộ môn Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ 10
Ngộc độc thực phẩm là một vấn đề luôn được quan tâm trên toàn thế giới và
giải quyết vấn đề này là rất cần thiết để nâng cao sức khỏe cộng đồng trong bối
cảnh những yêu cầu về chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm của người tiêu dùng
ngày một khắt khe. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm gồm có tác nhân hóa học,
chất độc tự nhiên, biến chất thức ăn và do vi sinh vật.
Salmonella được biết đến như là một nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm

thời có thể dẫn đến tử vong. Khi bị nhiễm Salmonella, mùi vị thức ăn không hề thay
đổi nên rất khó phát hiện. Những thức ăn dễ nhiễm khuẩn Salmonella: thịt gia súc,
gia cầm, trứng, sữa, sò, ốc, cá, thịt băm nhuyễn, trong đó trứng gà và gan gà dễ bị
nhiễm vi khuẩn này hơn cả.
Salmonella spp. là nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm, ngay cả ở các
nước phát triển. Đặc biệt ở các nước đang phát triển, vấn đề này càng nghiêm trọng
hơn do nguồn nước bị nhiễm khá nhiều vi khuẩn. Salmonella cũng là một trong
những nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm lớn nhất trên toàn cầu.
Salmonellosis là bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra, được lây nhiễm qua đường
tiêu hóa. Các bệnh do Salmonella gây ra cho con người như bệnh viêm ruột, thương
hàn, nhiễm trùng huyết với các triệu chứng như sốt, đau bụng, ỉa chảy, nôn mửa.
Salmonella có trong các thực phẩm như thịt, gia cầm, trứng, các sản phẩm sữa, hoa
quả, rau và các sản phẩm thực phẩm khác.
Bệnh thương hàn gây ra chủ yếu bởi Salmonella Typhi [22], số ca nhiễm
bệnh hàng năm trên toàn thế giới ước tính lên tới 16.6 triệu người trong đó có
600.000 người chết. Một triệu chứng tương tự thương hàn trên người gây ra bởi các
typ Salmonella paratyphoidal (Salmonella Paratyphi A, Salmonella Paratyphi B,
Salmonella Paratyphi C) được phát hiện với tỉ lệ thấp hơn so với Salmonella Typhi.
Giống như các vi sinh vật gây bệnh đường ruột khác, Salmonella Typhi được lây
truyền qua thực thẩm hoặc nguồn nước có nhiễm phân, dịch nôn của người bệnh.
Đặc biệt, Salmonella Typhi chỉ được phát hiện trên người. Ngược lại những chủng
không gây ra bệnh thương hàn như Salmonella Enteritidis, Salmonella
Typhimurium, Salmonella Muenchen, Salmonella Anatum, Salmonella Paratyphi và
Bộ môn Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ 12
Salmonella Give được phát hiện chủ yếu trên động vật như gia cầm, các sản phẩm
thịt, rau quả và các sản phẩm ngũ cốc khác.
Những loài Salmonella có thể gây bệnh cho người được quan tâm nhiều hơn

Ước tính thiệt hại kinh tế ở Mỹ do ngộ độc thực phẩm gây ra hàng năm là 10-83 tỉ
đô la [27]. Theo ước tính có 75% trường hợp ở người mắc phải bệnh do Salmonella
là do ăn phải những thức ăn bị nhiễm khuẩn bao gồm thịt bò, thịt heo, thịt gia cầm
và trứng . Thống kê từ 1990 đến 1995, Salmonella Enteritidis, Salmonella
Typhimurium chiếm khoảng 70% tổng số Salmonella được phân lập trên toàn thế
giới [20]. Số lượng các ca ngộ độc và nhập viện do Salmonella gây ra năm 2011 ở
Mỹ được thể hiện trong hình 1.7.
Bộ môn Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ 14

Hình 1.7. Số lượng ca ngộ độc và nhập viện do Salmonella gây ra ở Mỹ [10]
Hàng năm ở Mỹ có khoảng 1,5 nghìn ca nhiễm Salmonella không gây bệnh
thương hàn, và 95 % số ca liên quan đến thực phẩm [26], ước tính chiếm khoảng 10
% số bệnh liên quan đến thực phẩm tại Mỹ. Mặc dù việc nhiễm Salmonella tại các
nước phát triển được giải quyết bằng kháng sinh, nhưng vẫn có thể dẫn tới nguy cơ
tử vong cao, đặc biệt là trẻ nhỏ. Các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và tử
vong do ngộ độc thực phẩm tại Mỹ được thể hiện trong Bảng 1.3 và Bảng 1.4.
Bộ môn Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ 15
Bảng 1.3. Nguyên nhân gây ngộ độc tại Mỹ [11]
STT
Nguyên nhân gây
ngộ độc tại Mỹ
Số ca hàng năm
1
Vi rút dạng Norwalk

499
0,19
3
Toxoplasma
374
0,14
4
Vi rút dạng Norwalk
124
0,046
5
Campylobacter
99
0,037
6
Bệnh về dạ dày-ruột
5100
1,9
Tại Pháp, hàng năm có 75 vạn ca ngộ độc thực phẩm (1.210 ca/10 vạn dân),
trong đó: 7 vạn ca cấp cứu trong tình trạng nguy kịch (113 ca/10 vạn dân); 113
nghìn ca phải nhập viện (24 ca/10 vạn dân); 400 người chết (0.9 người/ 10 vạn dân).
Các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và tử vong do ngộ độc thực phẩm tại Pháp
được thể hiện trong Bảng 1.5 và Bảng 1.6.

Bộ môn Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ 16
Bảng 1.5. Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm tại Pháp [32]
STT

Nguyên nhân gây tử
vong do ngộ độc thực
phẩm tại Pháp
Số ca hàng năm
Tỉ lệ
(trên 1 vạn dân)
1
Salmonella
~300
0,5
2
Listeria
~80
0,13
3
Ký sinh trùng
~37
0,06
(95% do
toxoplasma gây ra)
4
Campylobacter
~15
0,02
5
Hepatitis A
~2
0,003
Tại Úc, hàng năm ước tính có khoảng 5,4 triệu ca ngộ độc thực phẩm [17],
trong đó: 18 nghìn ca nhập viện, 120 ca tử vong, 2,1 triệu ca phải nghỉ làm vì ngộ

41843
7829
62
6525
2009
152
40432
5212
35
4137
2010
175
24072
5664
51
3978
2011
148
38915
4700
27
3663

Ở Việt Nam, có hàng trăm vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra hàng năm với hàng
ngàn ca nhiễm bệnh. Theo thống kê của Viện dinh dưỡng Quốc gia và UNICEF, từ
năm 2006-2010, có tổng số 944 vụ ngộ độc thực phẩm với 33168 người bị ngộ độc,
259 người chết. Năm 2010, có 175 vụ ngộ độc thực phẩm, 5664 người bị nhiễm và
51 ca tử vong.
Gia cầm và sản phẩm gia cầm thường liên quan đến các ca xảy ra lẻ tẻ và
trong các ổ dịch Salmonella ở người [8], [22]. Ở nước ta, tình hình ô nhiễm

Hiện nay, phương pháp miễn dịch và sinh học phân tử đã và đang được phát
triển để phát hiện nhanh Salmonella trong vòng 48 giờ. Trong các phương pháp
miễn dịch thì Elisa là một trong những kĩ thuật sinh học phân tử hiện đại để phát
Bộ môn Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ 19
hiện nhanh Salmonella. Mỗi bộ kit Elisa phải đáp ứng hai yếu tố: độ nhạy và độ đặc
hiệu. Độ nhạy là khả năng phát hiện chính xác mẫu có chứa tác nhân gây bệnh
(được tính bằng tỉ số giữa mẫu dương tính trong thử nghiệm chia cho số mẫu dương
tính được kiểm tra bằng một phương pháp tin cậy khác trước đó). Độ đặc hiệu là
khả năng phát hiện chính xác mẫu không chứa tác nhân gây bệnh (được tính bằng tỉ
số giữa mẫu âm tính trong thử nghiệm chia cho số mẫu âm tính được kiểm tra bằng
một phương pháp tin cậy trước đó). Thường thì mỗi phương pháp lại có ưu điểm,
nhược điểm khác nhau tùy thuộc vào độ nhạy và độ đặc hiệu. Nếu độ nhạy được coi
trọng thì độ đặc hiệu bị giảm đi hoặc ngược lại. Nếu độ nhạy là 100% tức là nếu
muốn phát hiện chính xác các mẫu dương tính là dương tính thực thì sẽ có những
mẫu dương tính không được phát hiện tức độ đặc hiệu nhỏ hơn 100%. Nếu độ đặc
hiệu là 100% thì tức là muốn xác định được tất cả các mẫu dương tính thì sẽ có
trường hợp mẫu âm tính được phát hiện là dương tính tức độ nhạy nhỏ hơn 100%.
Trên thực tế đã phát triển được những bộ kit Elisa đáp ứng được cả độ nhạy và độ
đặc hiệu là 100%.
Bên cạnh đó, với các thành tựu đạt được của sinh học phân tử, các phương
pháp sử dụng kĩ thuật PCR đã và đang phát triển và đóng góp lớn vào việc phát hiện
Salmonella.
1.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử
Tế bào chứa ADN và ARN, và chính những phân tử này được làm đích để
phát hiện. Đích thường là một trình tự axit nucleic đặc biệt được phát hiện bằng
cách sử dụng một phân tử nucleic bổ sung được gọi là mẫu dò. Mẫu dò thường được
đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ, enzym hoặc chỉ thị huỳnh quang. Phương pháp lai

Salmonella trong thịt gà, phương pháp này khuếch đại một phần vùng khởi đầu sao
chép của gen oriC của Salmonella. Độ nhạy của phương pháp là 1CFU/10g và mẫu
phải được nuôi cấy trong môi trường chọn lọc trong 24 giờ. Năm 1996, Cohen và
cộng sự đã sử dụng cặp mồi bổ sung với một phần gen fimA của Salmonella
Typhimurium để phát hiện Salmonella được phân lập từ động vật. Manzano đã sử
dụng một đoạn 389 bp của gen invA để kiểm tra 75 mẫu thực phẩm. Gen ompC
được dùng để phát hiện Salmonella, cặp mồi nhân gen này đã phát hiện được 40 typ
huyết thanh Salmonella. Bằng kĩ thuật PCR, Jitrapakdee và cộng sự phát hiện được
52 typ Salmonella có phổ biến ở gia cầm với độ nhạy là 3 CFU/1 g thịt gà đông
lạnh. Cocolin và cộng sự kết hợp PCR với enzym hạn chế đã phát hiện được
Salmonella Typhimurium trong các mẫu thịt lợn xay, thịt bò xay, thịt gia cầm, lạp
xưởng lên men và thịt cá. Chen và cộng sự đã dùng PCR với các mồi đánh dấu
Bộ môn Vi sinh vật học Luận văn thạc sĩ 21
huỳnh quang để phát hiện Salmonella trong các mẫu gà lây nhiễm nhân tạo. Heid và
cộng sự đã áp dụng phương pháp này để kiểm tra Salmonella.
Ngày nay, kĩ thuật Real-time PCR đã và đang được phát triển rộng rãi. Kĩ
thuật này chỉ gồm một bước nên có thể giảm được sự nhiễm chéo giữa các mẫu. Sự
phát hiện các mẫu dương tính phụ thuộc vào lượng huỳnh quang được giải phóng
trong quá trình khuếch đại. Lượng huỳnh quang được đọc và được biểu thị bằng
phần mềm và các kết quả được chuyển thành các tín hiệu điện nên không cần phải
điện di trên gel agarose. Với các vụ ngộ độc, cần xác định nguyên nhân sớm, có thể
sử dụng kĩ thuật Real-time PCR nếu sử dụng hóa chất đã đông khô và máy khuếch
đại ADN. Kỹ thuật này cho phép phát hiện nhanh hơn tác nhân gây bệnh trong các
vụ ngộ độc thực phẩm.
1.2.3. Các phƣơng pháp miễn dịch
Các phương pháp miễn dịch dựa trên phản ứng kháng nguyên kháng thể.
Trong đó, Elisa cũng là phương pháp dùng để phát hiện kháng nguyên hoặc kháng