ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN RHODOTORULA CÓ
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE
TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN LÀM THỨC ĂN
BỔ SUNG CHO GÀ ĐẺ TRỨNG
LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT
Nghiên cứu sinh NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu
của riêng tôi. Các kết quả nêu trong luận án là
MỤC LỤC
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các sơ đồ và hình
MỞ ĐẦU
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 NẤM MEN RHODOTORULA 1
1.1.1 Giới thiệu chung và đặc điểm phân loại 1
1.1.2 Đặc điểm sinh lý, hình thái 3
1.1.3 Đặc điểm sinh hóa 4
1.1.4 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula 4
1.1.5 Khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất khác của Rhodotorula .
11
1.2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY BÁN RẮN 12
1.2.1 Khái quát về lên men bán rắn 12
1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bán rắn 14
1.2.3 Phương pháp định lượng sinh khối trong lên men bán rắn 15
1.2.4 Lên men bán rắn nấm men Rhodotorula 17
1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula 18
1.3 VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ CHẤT DINH DƯỠNG ĐỐI VỚI GIA CẦM ĐẺ
TRỨNG 22
1.3.1 Vai trò dinh dưỡng của protein và acid amin 23
1.3.2 Vai trò của sắc tố carotenoid đối với gà đẻ 24
1.3.3 Vai trò của enzym phytase 25
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NẤM MEN RHODOTORULA 28
2.1.1 Vật liệu phân lập 28
2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 52
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 KẾT QUẢ CHỌN RHODOTORULA CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
BETA-CAROTENE TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN 53
3.1.1 Phân lập các nấm men sinh sắc tố carotenoid 53
3.1.2 Tuyển chọn và định danh các nấm men thuộc giống Rhodotorula trên cơ sở
thực hiện các thí nghiệm theo khoá phân loại của Kreger-van Rij 53
3.1.3 Chọn chủng nấm men nghiên cứu chính từ các chủng phân lập được trên cơ
sở khả năng sinh tổng hợp beta-carotene 56
3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM
MEN RHODOTORULA THEO PHƯƠNG PHÁP BÁN RẮN 59
3.2.1 Khảo sát các phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men 59
3.2.2 Tối ưu hàm lượng các chất dinh dưỡng bổ sung cho quá trình sinh tổng hợp
beta-carotene của Rhodotorula 62
3.2.3 Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của
nấm men Rhodotorula 71
3.2.4 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp sinh khối, phytase, carotenoid tổng và
beta-carotene của nấm men Rhodotorula theo thời gian 77
3.2.5 Khảo sát quá trình tự phân của nấm men 81
3.2.6 Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm 82
3.2.7 Phân tích thành phần dinh dưỡng của chế phẩm 83
3.3 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TÍNH AN TOÀN CỦA CHẾ PHẨM TRÊN
ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 87
3.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM TRÊN GÀ ĐẺ
TRỨNG 90
3.4.1 Công thức thức ăn cho gà đẻ trứng sử dụng trong thí nghiệm 90
3.4.2 Năng suất trứng 92
3.4.3 Mối tương quan giữa hàm lượng carotenoid tổng và năng suất trứng gà
93
3.4.4 Tỷ lệ gà sống 94
Sac. : đường saccharose
UI : đơn vị hoạt độ DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Các sắc tố chính do nấm men Rhodotorula tổng hợp 8
Bảng 1.2 Các nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp carotenoid và beta-
carotene của nấm men Rhodotorula theo phương pháp nuôi cấy chìm 10
Bảng 1.3 Sắc tố carotenoid do Rh. glutinis DBVPG 3853 tổng hợp được sau
120 giờ trên môi trường nước ép nho ở các nhiệt độ khác nhau 21
Bảng 2.1 Các nguồn phân lập nấm men sinh sắc tố carotenoid 28
Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát phương pháp phá vỡ thành tế bào 31
Bảng 2.3 Thành phần nguyên liệu sử dụng 33
Bảng 2.4 Mức khảo sát của hàm lượng saccharose, nitơ, phosphor và lưu
huỳnh để tìm thí nghiệm tại tâm 35
Bảng 2.5 Ma trận qui hoạch thực nghiệm 4 yếu tố theo phương án quay bậc 2
36
Bảng 2.6 Mức biến thiên hàm lượng saccharose, nitơ, phosphor và lưu huỳnh
(mg/Kg MT) 37
Bảng 2.7 Các mức khảo sát độ ẩm, độ dày lớp môi trường và tỷ lệ giống để
tìm thí nghiệm tại tâm 37
Bảng 2.8 Ma trận qui hoạch thực nghiệm tối ưu 3 yếu tố theo phương án toàn
phần 38
Bảng 2.9 Mức biến thiên của các yếu tố điều kiện nuôi 38
Bảng 2.10 Thành phần dinh dưỡng của thức ăn đối chứng cho chuột 42
Bảng 2.11 Thành phần dinh dưỡng thức ăn đậm đặc GD 26 Star Feed 46
Bảng 3.14 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ở các tỷ lệ giống khác nhau 73
Bảng 3.15 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula từ thực
nghiệm tối ưu điều kiện nuôi cấy 74
Bảng 3.16 Các hằng số b
j
tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện
nuôi cấy ………. 75
Bảng 3.17 Các hệ số hồi qui t
j
tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu điều
kiện nuôi cấy 75
Bảng 3.18 Các phương sai và F theo số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện nuôi
cấy 75
Bảng 3.19 Kết quả xác định hàm lượng beta-carotene, carotenoid tổng theo
thời gian LBR 79
Bảng 3.20 Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng của chế phẩm βCR 84
Bảng 3.21 Thành phần acid amin trong chế phẩm βCR … 85
Bảng 3.22 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm βCR biểu hiện lên chuột 87
Bảng 3.23 Công thức thức ăn gà đẻ sử dụng trong thí nghiệm 91
Bảng 3.24 Kết quả trung bình khảo sát các chỉ tiêu chất lượng trứng qua các
tuần thí nghiệm 95
Bảng 3.25 Hàm lượng beta-carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng ở các lô
thí nghiệm 97
Hình 3.1 Các nấm men sinh sắc tố carotennoid phân lập được 53
Hình 3.2 Giống nấm men Rhodotorula phân lập được 54
Hình 3.3 Trình tự nucleotid đoạn 28S DNA 58
Hình 3.4 Giải trình tự 28S DNA của chủng MN12 58
Hình 3.5 Kết quả tra cứu trình tự 28S DNA của chủng MN12 58
Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng beta-carotene thu được theo các
phương pháp phá vỡ tế bào 60
Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn khả năng sinh tổng hợp sinh khối của Rhodotorula
theo thời gian 77
Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh tổng hợp phytase theo thời gian 78
Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh tổng hợp beta-carotene và
carotenoid tổng theo thời gian . 80
Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của thời gian tự phân đến hàm lượng
beta-carotene giữa hai nghiệm thức có bổ sung và không bổ sung chitinase 81
Hình 3.11 Khay lên men bán rắn Rhodotorula và chế phẩm βCR thu được 82
Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của chế phẩm βCR lên hàm lượng
calci, phosphor trong xương và phosphor trong phân của chuột thí nghiệm 88
Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của chế phẩm βCR lên hàm lượng
hemoglobin, beta-carotene và vitamin A trong huyết thanh chuột 89
Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn năng suất cho trứng (%) của gà qua các tuần khảo
sát 92
Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa hàm lượng carotenoid tổng với
năng suất cho trứng 93
Hình 3.16 Quan sát hệ vi sinh vật trong phân gà 96 TÓM TẮT LUẬN ÁN
là một đòi hỏi cấp thiết cho ngành công nghệ thực phẩm. Trong khẩu phần thức ăn của
người, ngoài nền tảng tinh bột như cơm, ngô, khoai , lượng đạm cơ bản được cung cấp
chủ yếu từ các sản phẩm vật nuôi và cây trồng như thịt, trứng, sữa, rau, đậu, … đặc biệt
trong đó là các sản phẩm từ chăn nuôi. Theo số liệu thống kê, trong những năm đầu của
thế kỷ 21, ước tính tổng giá trị gia cầm đã đóng góp khoảng 5% GDP của Việt Nam
[139]. Tiềm năng và kỳ vọng đóng góp của ngành chăn nuôi này vào việc cung cấp đủ
nhu cầu thức ăn đáp ứng tiêu chuẩn và cho sự phát triển của nền kinh tế đất nước trong
tương lai là rất lớn. Tuy nhiên, tại Việt Nam, gia cầm chủ yếu được nuôi bằng nguồn
thức ăn tự nhiên sẵn có thiếu hoặc không cân đối về dinh dưỡng hay bằng nguồn thức
ăn nhập từ nước ngoài với giá cao [6].
Thức ăn là vấn đề quan trọng nhất trong chăn nuôi, nó quyết định trực tiếp đến
năng suất, chất lượng và giá thành của các sản phẩm thịt, trứng, sữa, Đặc biệt, sắc tố
carotenoid là yếu tố cần phải có trong thức ăn. Ngoài tác dụng cung cấp chất tiền
vitamin A, sắc tố carotenoid còn là chất chống oxi hóa sinh học để bảo vệ tế bào,
buồng trứng, làm tăng năng suất và sản lượng trứng [9, 84, 97]. Tuy nhiên nguồn thức
ăn thực vật dồi dào tại Việt Nam như tấm, khoai mì, cám, v.v… dùng trong chăn nuôi
gia cầm nói chung hay gà đẻ hầu như không có sắc tố carotenoid. Do đó, gia cầm bị
thiếu sắc tố vàng nên sức đề kháng yếu, dễ sinh bệnh tật, giảm tỷ lệ đẻ và chất lượng
trứng kém [9].
Trong số các vi sinh vật có khả năng tổng hợp carotenoid thì giống nấm men
Rhodotorula có khả năng sản xuất carotenoid [14, 37-39, 55-59] trong đó có beta-
carotene [91, 116] đang được nghiên cứu sản xuất ở quy mô công nghiệp để làm chất
màu thực phẩm [51] và đã được dùng làm thức ăn chăn nuôi [80, 110].
Đề tài luận án: “Nghiên cứu tuyển chọn Rhodotorula có khả năng sinh tổng
hợp beta-carotene trên môi trường bán rắn làm thức ăn bổ sung cho gà đẻ trứng”
được thực hiện nhằm phân lập, tuyển chọn, tối ưu môi trường nuôi cấy dòng vi sinh vật
để sản xuất nguồn thức ăn giàu beta-carotene và sản phẩm này sử dụng có hiệu quả cho
chăn nuôi gia cầm đẻ trứng. Ngoài ra, các loại thực phẩm tự nhiên dùng cho người hiện
tại đang rất thiếu và cần bổ sung vitamin A. Đề tài luận án còn giải quyết bài toán là cải
tạo nguồn thức ăn cho vật nuôi với nguyên liệu sẵn có và rẻ, thông qua đó nâng hàm
góp vào sự phát triển đất nước.
1
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 NẤM MEN RHODOTORULA
1.1.1 Giới thiệu chung và đặc điểm phân loại
Hiện nay có hai cách phân loại vi sinh vật. Cách thứ nhất dựa vào đặc điểm sinh lý,
sinh hoá; cách thứ hai dựa vào cơ sở cấu trúc phân tử của tế bào. Nấm men thuộc giới
(Regnum) nấm (Fungi). Giới này bao gồm nấm và nấm lớn (hay nấm quả thể). Ước tính
có khoảng 1,5 triệu loài nấm [74] và giới này cho đến nay vẫn còn là điều bí ẩn [106].
Đại diện tiêu biểu của giới nấm là nấm mốc (Mold), nấm men (Yeast) và nấm lớn
(Mushroom). Nấm men được chia thành 2 ngành là nấm túi (Ascomycota) và nấm đảm
(Basidiomycota) [15]. Trong mỗi ngành (Phylum) có các lớp (Classis), trong mỗi lớp
chia thành các bộ (Ordo), trong mỗi bộ chia thành nhiều họ (Familia), trong mỗi họ
chia thành nhiều giống (Genus), trong mỗi giống có nhiều loài (Species) và loài là đơn
vị cơ bản của hệ thống phân loại.
Năm 1928, Harrison F.C. phân lập và định danh được loài Rhodotorula
mucilaginosa và một số loài khác thuộc giống này. Sau đó giống nấm men trên được
đặt tên là nấm men Rhodotorula Harrison [54]. Theo Harrison, nấm men Rhodotorula
không có khả năng đồng hóa nguồn carbon inositol.
Thực tế, khóa phân loại của Lodder và Kreger-van Rij được sử dụng khá phổ biến ở
Việt Nam. Tuy nhiên, hiện tại phương pháp phân loại nấm chính xác là phương pháp
dựa trên cơ sở vật chất di truyền [75]. Theo Swarajit và cộng sự (2001) việc định danh
các loài nấm men thuộc giống Rhodotorula phải trên cơ sở cấu trúc của rARN [143].
Guinet F. (2007) cho rằng khi định danh giống Rhodotorula nếu chỉ dựa vào kết quả
phản ứng từ bộ test- KIT thì chỉ chính xác khoảng 72%. Nếu kết hợp với các quan sát
đại thể, vi thể về đặc trưng hình thái, các phản ứng sinh hóa trên thạch đĩa sẽ nâng độ
chính xác lên 87,8% [69]. Thực tế hiện nay, một số loài thuộc giống Rhodotorula và
Rhodosporidium tuy có tên gọi khác nhau nhưng có cấu trúc ADN giống nhau [16,
134]. Nghiên cứu của Belloch C. và cộng sự (2007) cũng kết luận rằng giống
Rhodotorula đã xuất hiện nhiều loài mới và nhiều chủng mới ngay trong cùng một loài
3
do đó khi định danh nấm men cần phải có sự hỗ trợ của sinh học phân tử để xác định
cấu trúc của nhân tế bào [21].
1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý
1.1.2.1 Đặc điểm hình thái
Tế bào nấm men Rhodotorula là tế bào sinh dưỡng ở thể đơn bào, quan sát dưới kính
hiển vi có dạng hình tròn, hình oval, tế bào có thể bị kéo dài và bị uốn cong. Kích
thước tế bào nấm men trung bình khoảng 5µm x 8µm [4, 10].
Hình 1.1 Hình thái tế bào và hình thức sinh sản nẩy chồi của Rhodotorula glutinis [95]
Thành tế bào nấm men Rhodotorula bao gồm nhiều lớp, thành phần chủ yếu là các
polysaccharid như: 1,3-alpha-glucan; mannan; 1,3-beta-1,6-beta-glucan và chitine (n-
acetyl glucosamine). Các cấu tử tham gia vào cấu tạo của tế bào nấm men Rhodotorula
thường khác nhau ở các loài, đa số các loài có thành phần cấu tạo gồm glucose,
mannose, galactose và fucose [18, 95].
Khuẩn lạc Rhodotorula phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc mờ đục,
đôi khi gồ ghề, mịn và nhớt. Bờ khuẩn lạc Rhodotorula không có răng cưa, có màu từ
vi sinh vật nhưng có chức năng sinh lý đặc hiệu đối với cơ thể người và động vật. Số
lượng các carotenoid tìm thấy trong tự nhiên lên đến 700 loại với các màu sắc khác
nhau. Carotenoid được tổng hợp từ các tiền chất isoprenoid (C5), hợp chất này sau đó
chuyển thành geranyl diphosphat (C20). Sau đó, chuỗi phân tử 20 nguyên tử carbon
này liên kết đuôi – đuôi để tạo thành chuỗi C40. Do đó các carotenoid còn được gọi là
5
tetraterpenoid [35].
Các carotenoid được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm dưới dạng các chất
màu bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cá hồi [34], gia cầm [84]. Trong số hàng trăm loại
carotenoid được biết thì beta-carotene được xem là tiền chất cao nhất của vitamin A
[20]. Phân tử beta-carotene có cấu tạo cân đối, được hình thành do một chuỗi prolene
và 2 vòng beta-ionone ở hai đầu, khi thủy phân cho hai phân tử vitamin A. Dưới tác
dụng của nhiệt độ cao, ánh sáng và bức xạ, beta-carotene bị mất màu do xảy ra quá
trình chuyển hóa như hình 1.2.
Hình 1.2 Sự chuyển hóa beta-carotene dưới tác dụng của nhiệt độ, ánh sáng và bức xạ [35]
1.1.4.2 Sinh tổng hợp carotenoid ở nấm men
Nấm men sinh tổng hợp sắc tố carotenoid qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu sinh tổng
hợp các isoprenoid gồm dimethyallyl-pyrophosphat (DMAPP) và isopentenyl-5-
pyrophosphat (IPP) từ acetyl-CoA. Giai đoạn tiếp theo, DMAPP và IPP sẽ tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp carotenoid [137, 144].
- Giai đoạn 1: Sinh tổng hợp isoprenoid (DMAPP và IPP)
Sau phát minh ra con đường mevalonate về quá trình sinh tổng hợp isopenoid ở
sinh vật [20], các tác giả Boll M. và cộng sự (1975) [32], Trocha và cộng sự (1976)
[146], Ratledge (1982) [119], Servouse M. và cộng sự (1986) [132] khẳng định quá
trình sinh tổng hợp isoprenoid IPP của nấm men cũng theo hướng mevalonate. Nghiên
cứu của Chappell (1995), McGarvey và Croteau (1995) về quá trình đồng phân hóa
6
không màu. Quá trình khử phytoene sẽ hình thành lycopene, là một chuỗi các nối đôi
liên hợp có màu đỏ. Lycopene bị đóng vòng để hình thành beta-carotene có màu vàng
[41, 83].
Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp carotenoid từ isoprenoid [83]
Chú thích: IPP- isopentenyl diphosphat, acetyl-CoA - acetyl coenzym A, HMG-CoA-
3-hydroxi-3-methylglutaryl coenzym A, DMAPP- dimethylallyl diphosphat; FPP-
farnesyl diphosphat, GPP- geranyl diphosphat, GGPP- geranylgeranyl diphosphat.
Sự hình thành các carotenoid của nấm men xảy ra theo kiểu chuỗi từ nhiều tiền chất
bão hòa giống các sinh vật tổng hợp carotenoid khác. Theo Daisuke Umeno và cộng sự
(2003) [43], các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp carotenoid không được phân
loại cụ thể bằng cách dựa vào cơ chất. Theo Simpson và cộng sự (1964) [137],
Kocková (1990) [89], Visser H. và cộng sự (2003) [152] từ phytoene sẽ xảy ra các quá
trình khử, tạo vòng và oxi hóa để tạo ra các carotenoid riêng biệt và các quá trình này ở
nấm men có thể xảy ra theo nhiều hướng khác nhau.
1.1.4.3 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula
Khả năng hình thành sắc tố carotenoid là một đặc điểm sinh lý quan trọng dùng để
Copyright: Tài liệu đại học ©