Phương pháp phổ khối lượng
Bách khoa toàn thư mở Wikipedia
Bước tới: menu, tìm kiếm
Mô hình cơ bản của một khối phổ kế.
Phương pháp phổ khối là một kĩ thuật dùng để đo đạc tỉ lệ khối lượng-trên-điện tích của
ion; dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế. Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, bao gồm:
• Xác định các hợp chất chưa biết bằng cách dựa vào khối lượng của phân tử hợp chất hay
từng phần tách riêng của nó
• Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất
• Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần tách riêng của nó
• Định lượng lượng hợp chất trong một mẫu dùng các phương pháp khác (phương pháp phổ
khối vốn không phải là định lượng)
• Nghiên cứu cơ sở của hóa học ion thể khí (ngành hóa học về ion và chất trung tính trong
chân không)
• Xác định các thuộc tính vật lí, hóa học hay ngay cả sinh học của hợp chất với nhiều hướng
tiếp cận khác nhau.
Một khối phổ kế là một thiết bị dùng cho phương pháp phổ khối, cho ra phổ khối lượng của
một mẫu để tìm ra thành phần của nó. Có thể ion hóa mẫu và tách các ion của nó với các khối lượng
khác nhau và lưu lại thông tin dựa vào việc đo đạc cường độ dòng ion. Một khối phổ kế thông
thường gồm 3 phần: phần nguồn ion, phần phân tích khối lượng, và phần đo đạc.
Mục lục
[ẩn]
• 1 Ví dụ về cách hoạt động
• 2 Ứng dụng sinh học
o 2.1 Khối phổ của protein
o 2.2 Protein và các phân mảnh peptit
o 2.3 Xác định Protein
• 3 Xem thêm
• 4 Liên kết ngoài
• 5 Tham khảo
[sửa] Ví dụ về cách hoạt động

có thể là acid hoặc ester Và khả năng phát hiện
ra hợp chất với độ nhậy cực cao từ 10
-6
dến 10
-12
gram. Dưới đây là một khối phổ (electrospray)của
phân tử Kaempferol-rhamnose-rhamnose-glucose(m/z 741) trong loại cỏ thaliana, phân tích với
5.10
-6
L (nếu dùng máy MALDI thì chỉ cần 0,5.10
-6
L).
[sửa] Ứng dụng sinh học
[sửa] Khối phổ của protein
[sửa] Protein và các phân mảnh peptit
Protein mà các nhà nghiên cứu sinh học quan tâm thường là sự kết hợp phức tạp của nhiều protein
và phân tử khác nhau, cùng tồn tại trong một môi trường sinh học. Điều này đặt ra hai vấn đề chính.
Thứ nhất, hai kĩ thuật ion hóa dùng cho các phân tử lớn chỉ làm việc tốt khi mà hỗn hợp từ các
thành phần có cấu tạo gần giống, trong khi trong các mẫu sinh học, các protein khác nhau thường là
có lượng khác biệt nhau lớn. Nếu hỗn hợp được ion hóa dùng phương pháp phun ion hay MALDI,
thì những protein dạng mà dư thừa nhiều có xu hướng giảm tín hiệu so với những cái ít dư thừa
hơn. Vấn đề thứ hai, quang phổ khối từ hỗn hợp phức tạp là rất khó để nghiên cứu do có quá nhiều
thành phần phức hợp. Đó là vì với tác động của enzym, một protein tạo ra hàng loạt sản phẩm
peptit.
Để giải quyết vấn đề này, hai phương pháp được sử dụng rộng rãi để phân mảnh protein, hay các
sản phẩm peptit từ sự tác động của enzym. Phương pháp đầu tiên sẽ phân mảnh toàn bộ protein và
được gọi là điện chuyển gel hai chiều (2-DE: two-dimensional gel electrophoresis). Phương pháp
thứ hai, ghi sắc lỏng hiệu suất cao (HPLC) được dùng với các phân mảnh peptit sau khi protein
phân tách bởi tác động của enzym. Trong một số tình huống, có thể cần phải kết hợp cả hai phương
pháp.

1. What is mass spectrometry (MS)? What Information does mass spectrometry provide?
Khối phổ (MS) là gì? Thông tin không gì khối phổ cung cấp
2. Where are mass spectrometers used? Trường hợp được quang phổ kế khối lượng được sử
dụng
3. How can mass spectrometry help biochemists? Làm thế nào khối phổ có thể giúp các nhà
sinh hóa học
4. How does a mass spectrometer work? Làm thế nào một công việc phổ khối lượng
5. Introduction Giới thiệu
1. Sample introduction Mẫu giới thiệu
2. Methods of sample ionisation Phương pháp ion hoá mẫu
3. Analysis and separation of sample ions Phân tích và tách các ion mẫu
4. Detection and recording of sample ions Phát hiện và thu âm của các ion mẫu
6. Electrospray ionisation Electrospray ion hóa
1. Electrospray ionisation Electrospray ion hóa
2. Nanospray ionisation Nanospray ion hóa
3. Data processing Xử lý dữ liệu
7. Matrix assisted laser desorption ionisation Ma trận giúp giải hấp laser ion hóa
8. Positive or negative ionisation? Tích cực hay tiêu cực ion hoá
9. Tandem mass spectrometry (MS-MS): Structural and sequence information from
mass spectrometry Tandem khối phổ (MS-MS): Kết cấu và trình tự thông tin từ các phép đo
phổ khối lượng
1. Tandem mass spectrometry Tandem khối phổ
2. Tandem mass spectrometry analyses Tandem khối phổ phân tích
3. Peptide sequencing by tandem mass spectrometry Peptide trình tự do đo phổ khối
tandem
4. Oligonucleotide sequencing by tandem mass spectrometry Oligonucleotide trình tự do đo
phổ khối tandem
10. Background reading Nền đọc
1. What is mass spectrometry (MS)? What information does mass spectrometry
provide?

• Biotechnology: the analysis of proteins, peptides, oligonucleotides.
Công nghệ sinh học: các phân tích của các protein, peptide, oligonucleotides
• Pharmaceutical: drug discovery, combinatorial chemistry, pharmacokinetics, drug
metabolism
Dược phẩm: thuốc phát hiện, tổ hợp hóa học, dược động học, sự trao đổi chất ma túy
• Clinical: neonatal screening, haemoglobin analysis, drug testing
Lâm sàng: trẻ sơ sinh sàng lọc, phân tích huyết cầu tố, kiểm nghiệm thuốc
• Environmental: PAHs, PCBs, water quality, food contamination
Môi trường: PAHs, PCBs, chất lượng nước, thức ăn ô nhiễm
• Geological: oil composition
Địa chất: thành phần dầu
3. How can mass spectrometry help biochemists?
• Accurate molecular weight measurements: Trọng lượng phân tử chính xác các phép đo
sample confirmation, to determine the purity of a sample, to verify amino acid substitutions,
to detect post-translational modifications, to calculate the number of disulphide bridges
mẫu xác nhận, để xác định độ tinh khiết của một mẫu, để xác minh sự thay thế acid amin, để phát hiện
thay đổi sau tịnh, để tính số cầu disulphide
• Reaction monitoring: Phản ứng theo dõi
to monitor enzyme reactions, chemical modification, protein digestion
theo dõi các phản ứng enzyme, biến đổi hóa học, tiêu hóa protein
• Amino acid sequencing: Amino acid trình tự
sequence confirmation, de novo characterisation of peptides, identification of proteins by
database searching with a sequence "tag" from a proteolytic fragment
trình tự xác nhận, de novo mô tả đặc điểm của peptide, xác định các protein của cơ sở dữ liệu tìm kiếm
với một "tag" trình tự từ một đoạn phân giải protein
• Oligonucleotide sequencing: Oligonucleotide trình tự
the characterisation or quality control of oligonucleotides
kiểm soát đặc tính hoặc chất lượng của oligonucleotides
• Protein structure: Protein cấu trúc
protein folding monitored by H/D exchange, protein-ligand complex formation under

The method of sample introduction to the ionisation source often depends on the ionisation
method being used, as well as the type and complexity of the sample. Phương thức giới thiệu mẫu cho
các nguồn ion hóa thường phụ thuộc vào phương pháp ion hóa được sử dụng, cũng như loại và sự phức
tạp của mẫu
The sample can be inserted directly into the ionisation source, or can undergo some type of
chromatography en route to the ionisation source. This latter method of sample introduction usually
involves the mass spectrometer being coupled directly to a high pressure liquid chromatography
(HPLC), gas chromatography (GC) or capillary electrophoresis (CE) separation column, and hence
the sample is separated into a series of components which then enter the mass spectrometer
sequentially for individual analysis. Mẫu này có thể được chèn trực tiếp vào nguồn ion hóa, hoặc có thể
trải qua một số loại sắc ký trên đường đến các nguồn ion hóa. Phương pháp thứ hai giới thiệu mẫu thường
liên quan đến pháp phổ khối lượng được kết trực tiếp đến một sắc ký lỏng cao áp (HPLC), sắc ký khí (GC)
hoặc điện mao dẫn (CE) tách cột, và do đó mẫu được tách thành một loạt các thành phần đó sau đó nhập
vào các máy phổ khối tuần tự để phân tích cá nhân
4.3 Methods of sample ionisation Các phương pháp ion hoá mẫu
Many ionisation methods are available and each has its own advantages and disadvantages
("Ionization Methods in Organic Mass Spectrometry", Alison E. Ashcroft, The Royal Society
of Chemistry, UK, 1997; and references cited therein). Nhiều phương pháp ion hoá có sẵn và từng có
những lợi thế riêng của mình và bất lợi ("Đầu báo phương pháp hữu khối phổ", Alison E. Ashcroft, Hội Hóa
học Hoàng gia, Vương quốc Anh năm 1997; và tài liệu tham khảo trích dẫn trong đó).
The ionisation method to be used should depend on the type of sample under investigation
and the mass spectrometer available. Các phương pháp ion hóa được sử dụng nên phụ thuộc vào loại
mẫu điều tra và phổ kế khối lượng sẵn có
Ionisation methods include the following: Ion hoá các phương pháp bao gồm
Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI) Áp suất khí quyển Hóa chất ion hoá (APCI)
Chemical Ionisation (CI) Hóa chất ion hoá (CI)
Electron Impact (EI) Tác động điện tử (EI)
Electrospray Ionisation (ESI) Electrospray ion hoá (ESI)
Fast Atom Bombardment (FAB) Atom nhanh Ném bom (FAB)
Field Desorption / Field Ionisation (FD/FI) Lĩnh vực giải hấp / trường ion hoá (FD / FI)

hợp với ion hoá electrospray, trong khi MALDI thường không đi đôi với một phân tích tứ cực
Tandem (MS-MS) mass spectrometers are instruments that have more than one analyser
and so can be used for structural and sequencing studies. Two, three and four analysers have all
been incorporated into commercially available tandem instruments, and the analysers do not
necessarily have to be of the same type, in which case the instrument is a hybrid one. More popular
tandem mass spectrometers include those of the quadrupole-quadrupole, magnetic sector-
quadrupole , and more recently, the quadrupole-time-of-flight geometries. Tandem (MS-MS)
quang phổ kế khối lượng là những công cụ mà có nhiều hơn một phân tích và do đó có thể được sử dụng
cho nghiên cứu cấu trúc và trình tự. Hai, ba và bốn phân tích có tất cả được kết hợp vào công cụ thương
mại song song, và các phân tích không nhất thiết phải cùng loại, trong trường hợp cụ này là một lai một.
Phổ biến hơn dù cùng quang phổ kế khối lượng bao gồm những người của tứ cực-tứ cực, từ khu vực kinh
tế-tứ cực, và gần đây, các tứ cực-thời gian-hình học-bay
4.5 Detection and recording of sample ions. phát hiện và ghi của các ion mẫu.
The detector monitors the ion current, amplifies it and the signal is then transmitted to the
data system where it is recorded in the form of mass spectra . The m/z values of the ions are
plotted against their intensities to show the number of components in the sample, the molecular
mass of each component, and the relative abundance of the various components in the sample.
Phát hiện này theo dõi các ion hiện nay, khuyếch đại và sau đó tín hiệu được truyền đến hệ thống dữ liệu
mà nó được ghi lại trong các hình thức phổ khối lượng. Các m / z các giá trị của các ion là các âm mưu
chống lại cường độ của họ để chỉ số lượng các thành phần trong mẫu, khối lượng phân tử của mỗi thành
phần, và sự phong phú tương đối của các thành phần khác nhau trong mẫu
The type of detector is supplied to suit the type of analyser; the more common ones are the
photomultiplier , the electron multiplier and the micro-channel plate detectors. Các loại máy phát
hiện được cung cấp cho phù hợp với các loại phân tích, những người phổ biến hơn là những, quang
electron nhân và các thiết bị dò tấm vi kênh
5. Electrospray ionisation Electrospray ion hóa
5.1 Electrospray ionisation Electrospray ion hóa
Electrospray Ionisation (ESI) is one of the Atmospheric Pressure Ionisation (API)
techniques and is well-suited to the analysis of polar molecules ranging from less than 100 Da to
more than 1,000,000 Da in molecular mass. Electrospray ion hoá (ESI) là một trong những áp lực không

Fenn
,
J.

Phys

Chem
,
năm 1984,

88,

4451
),
mẫu

được

hòa tan

trong

một

vùng cực
,
dễ bay hơi

dung môi


từ 1

L

/

phút

và

1

ml

/ phút
.
Một

điện áp

cao

của

3 hoặc

4

kV


một

hệ quả

của

điện trường

mạnh
,
các

mẫu

đang nổi lên

từ đầu

được phân tán

vào

một

bình phun

các

giọt



mao mạch
.
Khí này
,
thường là

nitơ
,
giúp

chỉ đạo

phun

mới nổi

từ

đầu

mao mạch

đối với

các

máy phổ

khối


được gọi

là

khí

khô

mà

đi

qua

mặt trước

của

các

nguồn

ion hóa
.
Cuối cùng

mẫu

ion


vùng

chân không

trung
,
và

từ đó

thông qua

một

lỗ

nhỏ

vào

các

phân tích

của

pháp phổ khối
lượng
, được

application of this technique is for a protein digest mixture to be analysed to generate a list of
molecular masses for the components present, and then each component to be analysed further by
tandem mass spectrometric (MS-MS) amino acid sequencing techniques (see Section 8).
Nanospray ion hoá (M. Wilm, M. Mann, vây hậu môn Chem , Năm 1996, 68, 1) là một dòng chảy
của phiên bản tốc độ thấp của ion hoá electrospray. Một khối lượng nhỏ (1-4 microL) của mẫu hoà tan trong
dung môi bay hơi phù hợp, ở nồng độ ca. 1-10 pmol / microL, được chuyển vào một lọ mẫu thu nhỏ. Một
điện áp cao, hợp lý (khoảng 700-2000 V) được áp dụng cho các lọ mạ vàng đặc biệt sản xuất dẫn đến ion
hóa mẫu và phun. Tốc độ dòng chảy của chất tan và dung môi bằng cách sử dụng thủ tục này là rất thấp, 3-
10 phút / nL, và do đó không chỉ là mẫu tiêu thụ ít hơn so với tiêu chuẩn kỹ thuật ion hoá electrospray, mà
còn một lượng nhỏ mẫu kéo dài trong vài phút tạo điều kiện cho nhiều thí nghiệm được thực hiện. Một ứng
dụng phổ biến của kỹ thuật này là dành cho tiêu hóa protein hỗn hợp được phân tích để tạo ra một danh
sách các khối lượng phân tử cho các thành phần hiện nay, và sau đó mỗi thành phần được phân tích thêm
theo khối lượng song song phổ (MS-MS) amino acid kỹ thuật lập trình tự (xem Phần 8)
ESI and nanospray ionisation are very sensitive analytical techniques but the sensitivity
deteriorates with the presence of non-volatile buffers and other additives, which should be avoided
as far as possible. ESI và ion hoá nanospray rất nhạy cảm với kỹ thuật phân tích nhưng độ nhạy càng thấp
sự hiện diện của các bộ đệm không dễ bay hơi và các phụ gia khác, mà nên tránh càng xa càng tốt
In positive ionisation mode, a trace of formic acid is often added to aid protonation of the
sample molecules; in negative ionisation mode a trace of ammonia solution or a volatile amine is
added to aid deprotonation of the sample molecules. Proteins and peptides are usually analysed
under positive ionisation conditions and saccharides and oligonucleotides under negative
ionisation conditions. In all cases, the m/z scale must be calibrated by analysing a standard sample
of a similar type to the sample being analysed (e.g. a protein calibrant for a protein sample), and
then applying a mass correction.Trong chế độ ion hóa tích cực, một dấu vết của acid formic thường được
thêm vào để hỗ trợ proton hóa của các phân tử mẫu, trong chế độ ion hóa tiêu cực một chút dung dịch
amoniac hoặc một amin dễ bay hơi được thêm vào để hỗ trợ khử proton của các phân tử mẫu. Protein và
peptide này thường được phân tích theo các điều kiện ion hóa tích cực và saccharides và oligonucleotides
ion hoá trong điều kiện tiêu cực. Trong mọi trường hợp, m / quy mô z phải được hiệu chuẩn bằng cách phân
tích một mẫu chuẩn của một loại tương tự như các mẫu được phân tích (ví dụ như một protein calibrant cho
một mẫu protein), và sau đó áp dụng một điều chỉnh hàng loạt

multiplied by the total number of carbon atoms in the molecule. Additionally the fact that the 13C
ions are one Da higher on the m/z scale than the 12C ions is an indication that z = 1, and hence the
sample ions are singly charged. If the sample ions had been doubly charged, then the m/z values
would only differ by 0.5 Da as z, the number of charges, would then be equal to 2. m Các / z quang
phổ cũng cho thấy các ion khác có cường độ thấp hơn (khoảng 25% các m / z 556,1 ion) tại m / z 557,2.
Những đại diện cho các phân tử trong đó một nguyên tử 12C đã được thay thế bởi một nguyên tử 13C, bởi
vì carbon có một đơn vị đồng vị tự nhiên xảy ra một khối lượng nguyên tử (Đà) cao hơn. Cường độ của các
ion đồng vị liên quan đến sự phong phú tương đối của các đồng vị tự nhiên nhân với tổng số nguyên tử
cacbon trong phân tử. Ngoài ra một thực tế là các ion 13C là một Đà cao hơn trên m / z quy mô hơn so với
các ion 12C là một dấu hiệu cho thấy z = 1, và do đó các ion mẫu được đơn phương tính phí. Nếu các ion
mẫu đã được gấp đôi tính, sau đó là m / z các giá trị chỉ có thể khác nhau từ 0,5 Đà là z, số phí, sau đó sẽ là
bằng 2
The m/z spectrum also contains ions at m/z 578.1, some 23 Da higher than the expected
molecular mass. These can be identified as the sodium adduct ions, (M+Na)+, and are quite
common in electrospray ionisation. Instead of the sample molecules being ionised by the addition
of a proton H+, some molecules have been ionised by the addition of a sodium cation Na+. Other
common adduct ions include K+ (+39) and NH4+ (+18) in positive ionisation mode and Cl- (+35)
in negative ionisation mode. Các m / z quang phổ cũng chứa các ion tại m / z 578,1, một số 23 Đà cao
hơn so với khối lượng phân tử dự kiến. Đây có thể được xác định là các ion natri adduct, (M + Na) +, và là
khá phổ biến trong ion hoá electrospray. Thay vì các phân tử bị ion hóa mẫu bằng cách cho thêm một proton
H +, một số phân tử đã được ion hóa bằng cách cho thêm một cation Na Na +. Ion khác adduct phổ biến
bao gồm K + (39) và NH4 + (18) trong chế độ ion hóa tích cực và-ion hoá Cl (35) trong chế độ tiêu cực
Electrospray ionisation is known as a "soft" ionisation method as the sample is ionised by
the addition or removal of a proton, with very little extra energy remaining to cause fragmentation
of the sample ions. ion hoá Electrospray được biết đến như một phương pháp "mềm" ion hóa như mẫu
được ion hóa bằng cách thêm hoặc loại bỏ các proton, với rất ít thêm năng lượng còn lại để gây ra sự phân
mảnh của các ion mẫu
Samples (M) with molecular weights greater than ca. 1200 Da give rise to multiply charged
molecular-related ions such as (M+nH)n+ in positive ionisation mode and (M-nH)n- in negative
ionisation mode. Proteins have many suitable sites for protonation as all of the backbone amide

m/z = (MW + nH+)/n
where m/z = the mass-to-charge ratio marked on the abscissa of the spectrum; nơi m / z = khối
lượng đến tỷ lệ phí được đánh dấu trên đường ngang của quang phổ
MW = the molecular mass of the sample khối lượng phân tử của mẫu
n = the integer number of charges on the ions là số nguyên của các khoản phí trên các ion
H = the mass of a proton = 1.008 Da. khối lượng của proton
If the number of charges on an ion is known, then it is simply a matter of reading the m/z
value from the spectrum and solving the above equation to determine the molecular weight of the
sample. Usually the number of charges is not known, but can be calculated if the assumption is
made that any two adjacent members in the series of multiply charged ions differ by one charge.
Nếu số lượng các khoản phí trên một ion được biết đến, sau đó nó chỉ đơn giản là vấn đề đọc m / z giá trị từ
quang phổ và giải quyết các phương trình trên để xác định trọng lượng phân tử của mẫu. Thông thường số
tiền là không biết đến, nhưng có thể được tính toán, nếu giả thiết được thực hiện rằng bất kỳ hai thành viên
liền kề trong chuỗi các ion nhân tính khác nhau của một phí
For example, if the ions appearing at m/z 1431.6 in the lysozyme spectrum have "n"
charges, then the ions at m/z 1301.4 will have "n+1" charges, and the above equation can be written
again for these two ions: Ví dụ, nếu các ion xuất hiện tại m / z 1431,6 trong quang phổ lysozyme có "n"
phí, sau đó các ion tại m / z 1301,4 sẽ có "n +1" phí, và các phương trình trên có thể được viết lại cho hai
các ion
1431.6 = (MW + nH
+
)/n and 1301.4 = [MW + (n+1)H
+
] /(n+1)
These simultaneous equations can be rearranged to exclude the MW term: Những phương
trình này đồng thời có thể được sắp xếp lại để loại trừ các hạn MW
n(1431.6) - nH
+
= (n+1)1301.4 - (n+1)H
+

the mass spectrometer. This is of great help for multi-component mixture analysis where the m/z
spectrum may well contain several overlapping series of multiply charged ions, with each
component exhibiting completely different charge states. Điều này có vẻ dài dòng nhưng may mắn thay
khối lượng phân tử của mẫu có thể được tính toán tự động, hoặc ít nhất là bán tự động, bởi các phần mềm
xử lý liên quan đến việc phổ khối lượng. Điều này giúp ích rất nhiều cho việc phân tích hỗn hợp nhiều thành
phần, nơi m / z quang phổ cũng có thể chứa một số chuỗi chồng chéo của các ion nhân tính, với mỗi thành
phần tham gia triển lãm quốc gia chịu trách nhiệm hoàn toàn khác nhau
Using electrospray or nanospray ionisation, a mass accuracy of within 0.01% of the
molecular mass should be achievable, which in this case represents +/- 1.4 Da. Sử dụng electrospray
hoặc nanospray ion hoá, độ chính xác khối lượng của trong vòng 0,01% khối lượng phân tử nên được đạt
được, mà trong trường hợp này đại diện cho + / - 1,4 Da
In order to clarify electrospray/nanospray data, molecular mass profiles can be generated
from the m/z spectra of high molecular mass, multiply charged samples. To achieve this, all the
components are transposed onto a true molecular mass (or zero charge state) profile from which
molecular masses can be read directly without any amendments or calculations. Để làm rõ dữ liệu
electrospray nanospray /, hồ sơ khối lượng phân tử có thể được tạo ra từ m phổ z / khối lượng phân tử cao,
nhân mẫu tính phí. Để đạt được điều này, tất cả các thành phần được hoán lên một khối lượng phân tử
đúng (hoặc không tính phí nhà nước) thông tin mà từ đó chúng phân tử có thể được đọc trực tiếp mà không
có bất kỳ sửa đổi hoặc tính toán
The m/z spectrum of lysozyme has been converted to a molecular mass profile using
Maximum Entropy processing and the data are shown. The mass profile is dominated by a
component of molecular mass 14,305.7 Da, with a series of minor peaks at higher mass, which is
usually indicative of salt adducting e.g. Na (M+23), K (M+39), H2SO4 or H3PO4 (M+98). The
molecular masses can be read easily and unambiguously, and a good idea of the purity of the
protein is obtained on inspection of the molecular mass profile. M Các / z quang phổ của lysozyme đã
được chuyển đổi thành một hồ sơ khối lượng phân tử bằng cách sử dụng tối đa Entropy chế biến và các dữ
liệu được hiển thị. Các thông tin đại chúng được thống trị bởi một thành phần của phân tử lượng 14,305.7
Đa, với một loạt các đỉnh núi nhỏ ở khối lượng cao hơn, mà thường chỉ mang tính ví dụ như muối adducting
Na (M 23), K (M 39), H2SO4 hoặc H3PO4 (M 98). Các khối lượng phân tử có thể được đọc dễ dàng và rõ
ràng, và một ý tưởng tốt đẹp của sự tinh khiết của protein thu được về kiểm tra hồ sơ khối lượng phân tử

about sample ionisation. The sample is pre-mixed with a highly absorbing matrix compound for
the most consistent and reliable results, and a low concentration of sample to matrix works best.
The matrix transforms the laser energy into excitation energy for the sample, which leads to
sputtering of analyte and matrix ions from the surface of the mixture. In this way energy transfer is
efficient and also the analyte molecules are spared excessive direct energy that may otherwise cause
decomposition. Most commercially available MALDI mass spectrometers now have a pulsed
nitrogen laser of wavelength 337 nm.
Matrix assisted laser desorption ionisation (MALDI)
The sample to be analysed is dissolved in an appropriate volatile solvent, usually with a
trace of trifluoroacetic acid if positive ionisation is being used, at a concentration of ca. 10
pmol/�L and an aliquot (1-2 �L) of this removed and mixed with an equal volume of a solution
containing a vast excess of a matrix. A range of compounds is suitable for use as matrices:
sinapinic acid is a common one for protein analysis while alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid
is often used for peptide analysis. An aliquot (1-2 �L) of the final solution is applied to the sample
target which is allowed to dry prior to insertion into the high vacuum of the mass spectrometer. The
laser is fired, the energy arriving at the sample/matrix surface optimised, and data accumulated until
a m/z spectrum of reasonable intensity has been amassed. The time-of-flight analyser separates ions
according to their mass(m)-to-charge(z) (m/z) ratios by measuring the time it takes for ions to
travel through a field free region known as the flight, or drift, tube. The heavier ions are slower than
the lighter ones.
The m/z scale of the mass spectrometer is calibrated with a known sample that can either
be analysed independently (external calibration) or pre-mixed with the sample and matrix (internal
calibration).
Simplified schematic of MALDI-TOF mass spectrometry (linear mode)
MALDI is also a "soft" ionisation method and so results predominantly in the generation of
singly charged molecular-related ions regardless of the molecular mass, hence the spectra are
relatively easy to interpret. Fragmentation of the sample ions does not usually occur.
In positive ionisation mode the protonated molecular ions (M+H
+
) are usually the

2
-
and alcohols R-OH = R-O- as in saccharides or
oligonucleotides
8. Tandem mass spectrometry (MS-MS): Structural and sequence
information from mass spectrometry.
8.1 Tandem mass spectrometry
Tandem mass spectrometry (MS-MS) is used to produce structural information about a
compound by fragmenting specific sample ions inside the mass spectrometer and identifying the
resulting fragment ions. This information can then be pieced together to generate structural
information regarding the intact molecule. Tandem mass spectrometry also enables specific
compounds to be detected in complex mixtures on account of their specific and characteristic
fragmentation patterns.
A tandem mass spectrometer is a mass spectrometer that has more than one analyser, in
practice usually two. The two analysers are separated by a collision cell into which an inert gas (e.g.
argon, xenon) is admitted to collide with the selected sample ions and bring about their
fragmentation. The analysers can be of the same or of different types, the most common
combinations being:
• quadrupole - quadrupole
• magnetic sector - quadrupole
• magnetic sector - magnetic sector
• quadrupole - time-of-flight.
Fragmentation experiments can also be performed on certain single analyser mass
spectrometers such as ion trap and time-of-flight instruments, the latter type using a post-source
decay experiment to effect the fragmentation of sample ions.
8.2 Tandem mass spectrometry analyses.
The basic modes of data acquisition for tandem mass spectrometry experiments are as
follows:
Product or daughter ion scanning:
the first analyser is used to select user-specified sample ions arising from a particular

through the first analyser and user-selected specific fragments arising from these ions are measured
by the second analyser. The compound under scrutiny must be known and have been well-
characterised previously before this type of experiment is undertaken. This methodology is used to
confirm unambiguously the presence of a compound in a matrix e.g. drug testing with blood or
urine samples. It is not only a highly specific method but also has very high sensitivity.
8.3 Peptide Sequencing by Tandem Mass Spectrometry.
The most common usage of MS-MS in biochemical areas is the product or daughter ion
scanning experiment which is particularly successful for peptide and nucleotide sequencing.
Peptide sequencing: H
2
N-CH(R')-CO-NH-CH(R")-CO
2
H
Peptides fragment in a reasonably well-documented manner (P. Roepstorrf, J. Fohlmann,
Biomed. Mass Spectrom., 1984, 11, 601; R. S. Johnson, K. Biemann, Biomed. Environ. Mass
Spectrom., 1989, 18, 945). The protonated molecules fragment along the peptide backbone and
also show some side-chain fragmentation with certain instruments (Four-Sector Tandem Mass
Spectrometry of Peptides, A. E. Ashcroft, P. J. Derrick in "Mass Spectrometry of Peptides" ed. D.
M. Desiderio, CRC Press, Florida, 1990).
There are three different types of bonds that can fragment along the amino acid backbone:
the NH-CH, CH-CO, and CO-NH bonds. Each bond breakage gives rise to two species, one
neutral and the other one charged, and only the charged species is monitored by the mass
spectrometer. The charge can stay on either of the two fragments depending on the chemistry and
relative proton affinity of the two species. Hence there are six possible fragment ions for each
amino acid residue and these are labelled as in the diagram, with the a, b, and c" ions having the
charge retained on the N-terminal fragment, and the x, y", and z ions having the charge retained
on the C-terminal fragment. The most common cleavage sites are at the CO-NH bonds which give
rise to the b and/or the y" ions. The mass difference between two adjacent b ions, or y"; ions, is
indicative of a particular amino acid residue (see Table of amino acid residues at the end of this
document).

(E) residue in the peptide.
Peptide sequencing by tandem mass spectrometry - an MS-MS daughter or product ion
spectrum.
A protein identification study would proceed as follows:
• a. The protein under investigation would be analysed by mass spectrometry to generate a
molecular mass to within an accuracy of 0.01%.
• b. The protein would then be digested with a suitable enzyme. Trypsin is useful for mass
spectrometric studies because each proteolytic fragment contains a basic arginine (R) or
lysine (K) amino acid residue, and thus is eminently suitable for positive ionisation mass
spectrometric analysis. The digest mixture is analysed - without prior separation or clean-up
- by mass spectrometry to produce a rather complex spectrum from which the molecular
weights of all of the proteolytic fragments can be read. This spectrum, with its molecular
weight information, is called a peptide map. (If the protein already exists on a database,
then the peptide map is often sufficient to confirm the protein.)
For these experiments the mass spectrometer would be operated in the "MS" mode,
whereby the sample is sprayed and ionised from the nanospray needle and the ions pass
through the sampling cone, skimmer lenses, Rf hexapole focusing system, and the first
(quadrupole) analyser. The quadrupole in this instance is not used as an analyser, merely as
a lens to focus the ion beam into the second (time-of-flight) analyser which separates the
ions according to their mass-to-charge ratio.
Q-TOF mass spectrometer operating in MS (upper) and MS/MS mode (lower) modes.
• c. With the digest mixture still spraying into the mass spectrometer, the Q-Tof mass
spectrometer is switched into "MS/MS" mode. The protonated molecular ions of each of
the digest fragments can be independently selected and transmitted through the quadrupole
analyser, which is now used as an analyser to transmit solely the ions of interest into the
collision cell which lies inbetween the first and second analysers. An inert gas such as argon
is introduced into the collision cell and the sample ions are bombarded by the collision gas
molecules which cause them to fragment. The optimum collision cell conditions vary from
peptide to peptide and must be optimised for each one. The fragment (or daughter or
product) ions are then analysed by the second (time-of-flight) analyser. In this way an

The proteomics procedure usually involves excising individual spots from a 2-D gel and
independently enzymatically digesting the protein(s) contained within each spot, before analysing
the digest mixture by mass spectrometer in the manner outlined above. Electrospray ionisation or
MALDI could be used at this step.
The initial MS spectrum determining the molecular masses of all of the components in the
digest mixture can often provide sufficient information to search a database using just several of
the molecular weights from this peptide map.
If the database search is not fruitful, either because the protein has not been catalogued, is
previously uncharacterised, or the data are not accurate or comprehensive enough to distinguish
between several entries in the database, then further information is required.
This can be achieved by sample clean-up and then MS/MS studies to determine the amino
acid sequences of the individual proteolytic peptides contained in the digest mixture, with which
further database searching can be carried out.
8.4 Oligonucleotide sequencing by Tandem Mass Spectrometry.
Oligonucleotide sequencing: P-S(B)-P-S(B)-P-S(B)
Oligonucleotide sequencing can also be achieved by tandem mass spectrometry although
it is not so well documented. However fragmentation patterns have been established and reported
(S. Pomerantz, J. A. Kowalak, J. A. McClosky, J. Amer. Soc. Mass Spectrom., 1993, 4, 204). The
experimental principle is similar to that of peptide sequencing, in that individual species are mass
measured in MS mode of instrument operation, and then their molecular-related ions selected by
the first (quadrupole) analyser to be transmitted into the collision cell where they undergo
fragmentation after bombardment with a collision gas. The fragments are analysed by the second
(time-of-flight) analyser to produce an MS/MS product, or daughter, ion spectrum showing all
the fragment ions that arise directly from the chosen parent or precursor ions.
Negative electrospray ionisation is often the preferred ionisation method. The optimisation
of the fragmentation conditions varies from component to component and diligence must be taken
to ensure the best conditions are employed.
Data processing and interpretation is again of paramount importance for accurate, reliable
results and hence sequence information.
9. General reading