Luận văn thạc sĩ
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới người hướng dẫn khoa học tận tâm của
em – TS. Hoàng Thị Kim Dung – Phó Viện trưởng Viện Công nghệ Hóa học − Viện
Khoa học Công nghệ Việt Nam. Cô đã hướng dẫn rất nhiệt tình, động viên tinh thần
trong những thời khắc khó khăn, là một tấm gương trong công việc cũng như đời
thường.
Xin thể hiện sự biết ơn đến tất cả quý Thầy Cô khoa Hóa − Trường Đại học
Cần Thơ, quý Thầy Cô Viện Công nghệ Hóa học − Viện Khoa học Công nghệ Việt
Nam, vì đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báo trong suốt thời gian học tập.
Vì sự hỗ trợ nhiệt tình và tạo điều kiện tốt nhất trong việc hoàn thành luận văn,
em cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Trần Ngọc Quyển, Th.s. Trịnh Thị Thanh Huyền,
KS. Lý Tú Uyên, KS. Nguyễn Hoàng cùng các anh chị Phòng Hoá Hữu Cơ & Polymer
− Viện Công nghệ Hóa học − Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam.
Ngoài ra, em không thể thể hiện sự biết ơn của em đến những người anh, người
chị, người bạn khóa 16 và 17 lớp cao học hóa Hữu cơ – Đại học Cần Thơ đã giúp đỡ
em trong suốt quá trình học vừa qua.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các quý Thầy Cô trong hội đồng bảo vệ đã
đọc và đưa ra những nhận xét quý báu giúp em hoàn chỉnh cuốn luận văn này.
Cuối cùng, sẽ là thiếu sót to lớn nếu không nhắc đến gia đình em. Đặc biệt là ba
mẹ - người đã luôn theo sát, hỗ trợ em từng phút từng giây trong suốt thời gian qua và
cả sau này!
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2012
Huỳnh Thị Kim Chi
Huỳnh Thị Kim Chi 1
Luận văn thạc sĩ
TÓM TẮT
Diosmin là một loại flavone tự nhiên có tác dụng làm bền thành mạch máu,
chữa suy tĩnh mạch, bệnh trĩ, tiểu đường, ung thư. Trong nghiên cứu này, diosmin
được bán tổng hợp từ hesperidin – là một loại flavanone phổ biến trong họ citrus –
bằng tác nhân iodine, sodium hydroxide trong dung môi pyridine cho hiệu suất cao

lần
lượt là 85.34 và 73.89 µg/mL), các mẫu khác đều có hoạt tính yếu.
ABSTRACT
Diosmin is a natural flavone having durable effect on blood vessels, varicose
veins, hemorrhoids, diabetes, and cancer. In this study, diosmin was semi synthesized
from hesperidin - a popular flavanone in the citrus family - with iodine and sodium
hydroxide agents in pyridine solvent for high efficiency, yield: 76%. Diosmin was
hydrolysed in H
2
SO
4
/CH
3
COOH/H
2
O mixture forming its aglycone that was diosmetin
(H=87%). Three diosmetin derivatives were semi synthesized, including
3
′
,5,7−triacetoxy−4
′
−methoxyflavone (DTA), 3
′
,4
′
,5,7−tetramethoxyflavone (DTM),
3
′
,5,7−triallyloxy−4
′

ngừa và chữa trị các bệnh suy tĩnh mạch – tiêu biểu là bệnh trĩ.
Bước đầu chúng tôi thủy phân ra diosmetin để tiến hành tổng hợp một vài dẫn
xuất của diosmin sau này, xét nghiệm tính kháng oxy hóa, gây độc trên tế bào của các
hợp chất tìm được. Từ đó làm nền tảng để thực hiện những bước tổng hợp các dẫn
xuất khác tiếp theo trong những nghiên cứu sâu hơn.
Chính vì những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu
bán tổng hợp và xác định hoạt tính kháng oxy hóa của diosmin và dẫn xuất”.
Huỳnh Thị Kim Chi 4
Luận văn thạc sĩ
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Huỳnh Thị Kim Chi 5
Luận văn thạc sĩ
1.1 Flavonoid
1.1.1 Phân bố
Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Hơn một nửa
rau quả thường dùng có chứa flavonoid. Cho đến nay đã có khoảng 4000 chất đã được
xác định cấu trúc. Chỉ riêng 2 nhóm flavone và flavonol với nhóm thế là OH hoặc
OCH
3
thì theo lý thuyết có thể gặp 38627 chất. Phần lớn các chất flavonoid có màu
vàng. Tuy nhiên, một số có màu xanh, tím, đỏ, một số khác không có màu.
Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid
nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon.
1.1.2 Cấu trúc hóa học
Flavonoid là những chất màu thực vật, có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenyl
propane nghĩa là 2 vòng benzene A và B nối với nhau qua một dây có 3 carbon, hay
nói cách khác là cấu tạo khung kiểu C6 – C3 –C6. Cấu trúc là một vòng kín hoặc hở.
Cách đánh số tuỳ theo dây C
3
đóng hay hở, nếu dây C

O
1
O
2'
3'
4'
5'
A
B
1
1'
6'
Mạch hở Mạch kín
Thường flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm –OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân
A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc
dạng glycoside. Các đường thường gặp nhất là đường D- glucose, kế đó là D-
galactose, L- rhamnose, L-arabinose, D-apipse và acid uronic.[4]
Trong đa số trường hợp thì mạch 3 carbon đóng vòng với vòng A và tạo nên dị
vòng C có chứa oxy. Dị vòng C có thể là dihyroxypyrane, γ- pyrone, dihyro γ- pyrone.
Huỳnh Thị Kim Chi 6
Luận văn thạc sĩ
O
O O
O O
Dihydropyran -pyroneDihydro γ
-pyroneγ
Tại các vòng có đính một hoặc nhiều nhóm hydroxy tự do hoặc đã thay thế một
phần. vì vậy về bản chất chúng là các polyphenol có tính acid.[3,4]
Các polyphenol có thể phản ứng lẫn nhau qua các nhóm hydroxyl để tạo thành
các phân tử phức tạp hơn hoặc có thể liên kết với các hợp chất khác trong cây như các

tự do như OH
●
, ROO
●
gây ra các bệnh như ung thư, lão hoá….
Flavonoid tạo phức với các ion kim loại mà những kim loại này là xúc tác cho
các phản ứng oxy hoá. Thành phần màng tế bào có các lipid dễ bị peroxide hoá sinh ra
sản phẩm làm rối loạn trao đổi chất và huỷ hoại tế bào.
Flavonoid cùng với các acid ascorbic tham gia quá trình hoạt động của enzyme
oxy hoá- khử. Flavonoid còn ức chế tác động của hyaluronidase (enzyme này làm tăng
tính thấm của mao mạch). Khi hyaluronidase thừa sẽ gây hiện tượng xuất huyết dưới
da hay còn gọi thiếu vitamin P. Thí nghiệm cho thấy flavonoid có nhóm OH ở 3 , 4 thìꞌ ꞌ
nâng cao tính bền vững thành mạch.
6. Vai trò kháng ox y hoá [19,20]
Flavonoid có đặc tính sinh học mạnh: kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng
viêm…Trong các nghiên cứu in vitro, hoạt tính của flavonoid được khảo sát bằng cách
cho phản ứng với các chất tương ứng, thường là các gốc tự do như ABTS, DPPH,
AAPH, O
●
,
●
OOH,
●
OH….trong các môi trường khác nhau.
Tác dụng kháng oxy hoá của flavonoid là ngăn sự hình thành gốc tự do, làm
sạch gốc tự do và điều chỉnh khả năng kháng oxy hoá của cơ thể. Flavonoid ngăn cản
các enzyme tạo thành gốc tự do phản ứng. Trong môi trường có ion kim loại đồng, sắt
có thể phản ứng oxy hoá khử với H
2
O

O
O
OH
OCH
3
O
OH
HO
O
HO
O
OH
HO
HO
H
3
C
O
OCCH
3
O
O
OCCH
3
OCH
3
O
OCCH
3
H

3
CO)
2
O
O
OH
O
O
OH
OCH
3
O
OH
HO
O
HO
O
OH
HO
HO
H
3
C
NBS
CHCl
3
O
O
O
O

O
O
OCCH
3
OCH
3
O
OCCH
3
H
3
CCO
O
H
3
CCO
O
OCCH
3
H
3
CCO
H
3
CCO
H
3
C
O
O

H
3
C
SeO
2
isoamyl alcohol
o Bằng tác nhân iodine(29)
Hesperidin được đem phản ứng với iodine trong dung môi pyridine trong 9 –
10 giờ. Hỗn hợp sau phản ứng được đem xử lý lần lượt với alcohol, natri
thiosulfate và NaOH. Diosmin thô được kết tinh trong dung dịch DMF.
O
OH
O
O
OH
OCH
3
O
OH
HO
O
HO
O
OH
HO
HO
H
3
C
O

hesperidin acetate trong tetrahydrofuran với 2-carboxy ethyl triphenyl phosphonium
bromide theo sau đó là sự xà phòng hóa với kali butoxide. Sáng chế không nêu rõ hiệu
suất toàn phần cũng như độ sạch của diosmin.
o Theo sáng chế FR2760015 (59)
Khử hydrogen của hesperidin với postassium iodide trong DMSO với sự có mặt
H
2
SO
4
đặc để tạo ra sản phẩm diosmin với hiệu suất 73%.
o Bán tổng hợp Linarin, Acacetin, dẫn xuất 6-Iodoapigenin từ diosmin
[22]

Linarin là hoạt chất chính của một số cây thuốc như Buddleia cordata của
Mexico và Chrysanthemum zawadskii var. latilobum của Hàn Quốc. Gần đây,
linarin đã được nhận ra có trong thảo dược Valeriana officinalis, và lần đầu tiên
được mô tả là có hoạt tính an thần và gây ngủ. Dẫn xuất 6-Iodoapigenin được biết
đến là trung gian quan trọng cho việc dẫn đến một số biflavonoids với hai đơn vị
apigenin kết nối thông qua ít nhất một vị trí thứ 6 chẳng hạn như robustaflavone,
một chất ức chế virus viêm gan B (HBV). Tổng hợp linarin hoặc dẫn xuất 6-
Iodoapigenin từ diosmin yêu cầu loại bỏ các nhóm 3′-hydroxyl trong một chuỗi
hai bước khử loại oxy deoxygenation.
o Các acid và ester của diosmetin
[
2
4]
Tác giả đã tổng hợp dẫn xuất
7-carboxymethoxy-5-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxy-2-propylphenyl)-4H-1-be
nzo-pyran-4-one. Nghiên cứu dược tính cho thấy các hợp chất acid và ester của
diosmetin có thể được sử dụng như thuốc chữa bệnh trong điều trị suy tĩnh mạch

10
9
8
4
3
2
O
1
OH
O
O
1'
6'
5'
4'
3'
2'
OH
OCH
3
1''
O
5''
4''
3''
2''
OH
HO
6''
O

người tham gia. Hỗn hợp flavonoid này cũng có hiệu quả trong giai đoạn điều trị suy
tĩnh mạch mạn tính nghiêm trọng, bao gồm cả loét tĩnh mạch và làm chậm đi quá trình
suy tĩnh mạch. Trong một thí nghiệm ngẫu nhiên để so sánh khả năng điều trị loét tĩnh
mạch bằng hỗn hợp 900 mg diosmin cộng với 100 mg hesperidin so với việc điều trị
không dùng hỗn hợp flavonoid trên đã được tiến hành. Kết quả có 47% bệnh nhân
trong nhóm điều trị bằng bằng hỗn hợp diosmin và hesperidin đã được chữa khỏi hoàn
toàn vết loét so với nhóm không dùng hỗn hợp là 28% ở các vết loét có đường kính
dưới 10 cm.
8. Chữa b ệnh t rĩ( 36-3 8 )
Một số nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh diosmin có hiệu quả trong điều trị
các triệu chứng cấp tính và mãn tính của bệnh trĩ. Một nghiên cứu trong đó 120 bệnh
nhân được kiểm soát bằng giả dược (hỗn hợp 90% diosmin và 10% hesperidin) với
liều 500 mg mỗi ngày trong vòng hai tháng, đã kiểm soát tốt cũng như cải thiện được
các triệu chứng ngứa, đau đớn, chảy nước, phù, ban đỏ và xuất huyết. Đối với những
người đang mang thai, việc sử dụng diosmin trong điều trị bệnh trĩ không ảnh hưởng
Huỳnh Thị Kim Chi 13
Luận văn thạc sĩ
xấu đến thai kỳ, sự phát triển đến thai nhi, cân nặng cũng như sự phát triển của trẻ sau
này. Với những người bị bệnh trĩ cấp tính đang cho con bú cũng như đang mang thai,
việc điều trị được thực hiện tám tuần trước khi sinh và bốn tuần sau khi sinh. Hơn một
nửa số phụ nữ tham gia nghiên cứu đã giảm các triệu chứng từ ngày thứ tư. Diosmin
không gây đột biến cũng như không có bất kỳ ảnh hưởng đáng kể nào đến chức năng
sinh sản.
9. Chữa sưng phù do rối loạn hệ bạch huyết ( 39-4 1 )
Diosmin hoạt động trên hệ thống bạch huyết bằng cách tăng lưu lượng bạch
huyết. Hỗn hợp flavonoid có chứa diosmin đã được sử dụng để điều trị chứng phù chi
trên thứ cấp do rối loạn hệ bạch huyết. Kết quả cho thấy đã cải thiện được các triệu
chứng và khối lượng chi, khối lượng của chân tay bị sưng giảm trung bình 6.8%.
Ngoài ra, các thông số đánh giá chức năng bạch huyết được cải thiện đáng kể.
Diosmin còn cải thiện đáng kể các vết bỏng và sưng giập phổi.

tiết niệu đã được tiến hành trên những con chuột đực. Khi cho chúng ăn chế độ ăn có
chứa riêng rẽ hoặc kết hợp cả hai loại flavonoid nói trên (90% diosmin + 10%
hesperidin) đều có hiệu quả trong việc ức chế ung thư bàng quang và ức chế sự tăng
sinh của tế bào ung thư.
1.3 Dẫn xuất của diosmin
a) Tổng hợp diosmetin (ký hiệu DT)
o Cấu tạo
Công thức phân tử: C
16
H
12
O
6
Khối lượng phân tử: 300.26 g/mol
Công thức cấu tạo
O
OH
HO
O
OH
OCH
3
Huỳnh Thị Kim Chi 15
Luận văn thạc sĩ
Cấu trúc hóa học của DT
o Tính chất vật lý
Diosmetin dạng bột, màu vàng nhạt, tan nhiều trong acetone, methanol
T
nc
=258−260

O
OH
OCH
3
Diosmin
Diosmetin
H
2
SO
4
/CHOOH/H
2
O
12. Tổng hợp 3
′
,5,7 − triacetoxy − 4
′
− methoxyflavone (ký hiệu DTA)
o Cấu tạo
Công thức phân tử: C
22
H
18
O
9
Khối lượng phân tử: 426,37 g/mol
Công thức cấu tạo
O
OCCH
3

nhân trên C của nhóm cacbonyl)
O
OH
HO
O
OH
OCH
3
CH
3
COONa
O
OCCH
3
H
3
CCO
O
OCCH
3
OCH
3
O
O
O
(CH
3
CO)
2
O

o Tính chất vật lý
3
′
,4
′
,5,7−tetramethoxyflavone dạng tinh thể hình kim, màu vàng ánh xanh,
tan nhiều trong acetone, T
nc
= 192−193
°
C.
o Phản ứng tổng hợp
Phản ứng được thực hiện bằng phương pháp tổng hợp Williamson.
Diosmetin được tiến hành ether hoá trong môi trường K
2
CO
3
, acetone với tác nhân
dimethyl sulfoxide
O
OH
HO
O
OH
OCH
3
K
2
CO
3

o Cấu tạo
Công thức phân tử: C
25
H
24
O
6
Khối lượng phân tử: 420.45 g/mol
Công thức cấu tạo
Huỳnh Thị Kim Chi 18
Luận văn thạc sĩ
O
OCH
2
H
2
CO
O
OCH
2
OCH
3
CH CH
2
CH CH
2
HCH
2
C
Cấu trúc hoá học của DTAl

Acetone, t
0
+
O
OCH
2
H
2
CO
O
OCH
2
OCH
3
CH
2
CH CH
2
Br
CH CH
2
CH CH
2
HCH
2
C
3
+
3HBr
Diosmetin

của các gốc tự do. Những hệ thống này có thể chia thành 2 nhóm là enzyme và không
enzyme. Những chất chống oxy hóa enzyme bao gồm: superoxid dismutase xúc tác
quá trình chuyển O
2
•−
thành H
2
O
2
và H
2
O; catalase chuyển H
2
O
2
thành H
2
O và O
2
;
glutathion peroxidase chuyển H
2
O
2
thành H
2
O. Những chất chống oxy hóa không
enzyme bao gồm: các vitamin tan trong lipid như vitamin E và vitamin A hay tiền
vitamin A (beta−caroten), vitamin C tan trong nước và GSH. Vitamin E được xem như
chất chống oxy hóa ngắt mạch chính yếu trong cơ thể.

Trong thực nghiệm, hoạt tính kháng oxy hóa được đo bằng khả năng bắt gốc tự
do của phản ứng giữa phân tử chất kháng oxy hóa với các gốc tự do hoạt động. Dựa
vào cơ chế của phản ứng oxy hóa người ta đã đưa ra nhiều phương pháp đo khác nhau.
+ Đối với phản ứng theo cơ chế chuyển proton (Hydrogen Atom Tranfer),
người ta thường sử dụng các phương pháp sau:
- ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity): phương pháp dựa vào khả năng
hấp thụ các gốc tự do của oxygen.
- TRAP (Total−Trapping Antioxidant Parameter): phương pháp đo hoạt tính
kháng oxy hóa tổng cộng.
- LDL oxidation (Low Density Lipoprotein oxidation): phương pháp dựa vào sự
oxy hóa của lipoprotein tỷ trọng thấp.
- TOSC (Total Oxidant Scavenging Capacity): phương pháp đo khả năng làm
sạch sự oxy hóa tổng cộng.
+ Các phương pháp đối với cơ chế chuyển electron (Single Electron Tranfer):
- FRAC (Ferric Reducing Antioxidant Power): phương pháp khử sắt.
- TEAC (Trolox equivalent antioxidant activity): phương pháp đo hoạt tính
kháng oxy hóa đương lượng Trolox.
- DPPH (2,2-diphenyl−1−picrylhydrazyl): phương pháp đo khả năng bắt gốc tự
do DPPH. Gốc tự do DPPH (1,1−diphenyl−2−picrylhydrazyl) là gốc tự do bền
do có hiệu ứng liên hợp trong toàn phân tử, cho màu tím trong ethanol và có độ
hấp thu cực đại tại 517 nm.
Huỳnh Thị Kim Chi 21
Luận văn thạc sĩ
Đồ thị 1 biểu diễn màu của phương pháp DPPH
Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng và áp dụng cho từng loại chất oxy
hóa. Thông thường, người ta thường dựa vào các điều kiện như: khả năng phòng thí
nghiệm, tính khả thi trong các hệ thống sinh học, mức độ đơn giản của phương pháp,
cơ chế phản ứng, loại chất kháng oxy hóa, thời gian, … để chọn phương pháp nghiên
cứu hoạt tính phù hợp.
a) Tìm hiểu về DPPH

+
R
Luận văn thạc sĩ
các nhà khoa học nhận thấy rằng methanol và ethanol là 2 dung môi tốt nhất và không
cần điều chỉnh pH trong dung môi methanol hay ethanol đang dùng.
16. Đo độ hấp thu
52,53,54,5
5
Giá trị các bước sóng hấp thu cực đại khi tiến hành đo mẫu theo mỗi tác giả có
sự khác nhau, nhưng trên thực tế kiểm nghiệm thì đỉnh hấp thu cực đại nằm ở bước
sóng khoảng 515−520 nm.
17.Thời gian phản ứng
52,53,54,5
5
Thời gian phản ứng phụ thuộc vào hàm lượng tác chất đem phản ứng. Theo kết
quả khảo sát trên nhiều tác chất khác nhau, thời gian tốt nhất là 30 phút sau khi phản
ứng đã thực hiện xong.
18.Kết quả tính toán
52,53,54,5
5
Để khảo sát khả năng kháng oxy hóa, người ta thường dùng thuật ngữ: ″Phần
trăm ức chế Q″. Q được định nghĩa như sau:
Q=((A
0
−A
c
)/A
0
)×100%
Trong đó: A

Sử dụng phương pháp Sulforhodamin B (SRB) là một
phương pháp nhuộm màu đơn giản và nhạy để xác định độc
tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện
âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương
của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng
protein tổng của tế bào.
Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó SRB
liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng. Mật độ
quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào.
Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu đối chứng phản ánh độc tính tế bào của chất thử.
19.Xử lý kết quả
- Sau khi có giá trị mật độ quang ở bước sóng 492 nm và 620 nm (ký hiệu là OD
492
và
OD
620
)
- Tính giá trị OD = OD
492
- OD
620
(1)
- Tính OD
492
(hoặc OD
620
) = OD
tb
- OD
trắng

2
H
5
OH
O
O
O
O
O
Sulforhodamin B
Luận văn thạc sĩ
- OD
trắng
: giá trị OD của giếng trắng
- OD
TN
: giá trị OD của mẫu thử tính từ công thức (1) và (2)
- OD
C
: giá trị OD của mẫu chứng (control) tính từ công thức (1) và (2)
Ghi chú: Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sử dụng hàm STDEV trong phần
mềm tính toán Excel của Microsoft Office để xử lý số liệu, tính toán giá trị trung bình
và độ lệch chuẩn giữa các lần thí nghiệm lặp lại.
Kết quả trình bày: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn
Huỳnh Thị Kim Chi 25

Trích đoạn Thử nghiệm khả năng gây độc tế bào

---