BỘ Y TẾ
BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH
CỦA 2 CHẾ PHẨM THUỐC CHỨA
ENZYM
Chủ nhiệm đề tài: TS. ĐOÀN CAO SƠN
Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
Cấp quản lý: Bộ Y tế
Thời gian thực hiện: Từ tháng 06/2008 đến tháng 06/2010
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 450 triệu đồng
Trong đó: kinh phí nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ: 450 triệu đồng 8131


BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ 1. Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT
TÍNH CỦA 2 CHẾ PHẨM THUỐC CHỨA ENZYM

2. Chủ nhiệm đề tài: TS. ĐOÀN CAO SƠN
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc TƯ, Bộ Y tế
48 Hai Bà Trưng, Hà Nội.
4. Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y tế
5. Thư ký đề tài: Hà Thị Minh Châu
6. Danh sách những người thực hiện chính:
1. ThS Bùi Th
ị Hòa
2. DS. Hà Thị Minh Châu
3. ThS. Nguyễn Đăng Lâm
4. DS. Lê Thị Thu Hiền
5. TS. Trần Thị Hồng Anh
6. ThS. Lục Thị Vân
7. DS. Nguyễn Thị Hồng Yến
8. TS. Nguyễn Thị Kim Hương
9. DS. Trần Thị Thanh Huế

7. Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 06/2008 đến tháng 06/2010

MỤC LỤC

PHẦN A. TÓM TẮT CÁC KẾT QUẢ CỦA ĐỀ TÀI 1

3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
3.1. Hóa chất, chất chuẩn, mẫu nghiên cứu 26
3.1.1. Chất chuẩn 26

3.1.2. Dung môi, hóa chất: 26
3.1.3. Mẫu dùng để nghiên cứu xây dựng và thẩm định các quy trình 27
3.2. Thiết bị và dụng cụ 27
3.3. Phương pháp 28
3.3.1. Bromelain 28
3.3.2. Trypsin 28
3.3.3. Streptokinase 29
3.3.4. Streptodornase 29
4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30
4.1. Xây dựng và thẩm định quy trình xác định hoạt tính enzym của chế phẩm
thuốc chứa bromelain và trypsin 30
4.1.1. Xây dựng quy trình xác định hoạt tính của bromelain và trypsin 30
4.1.2. Thẩm định phươn g pháp xác định hoạt tính enzym trong chế phẩm
thuốc chứa bromelain và trypsin 34

4.2. Xây dựng và thẩm định quy trình xác định hoạt tính enzym của chế phẩm
thuốc chứa streptokinase và streptodornase 43
4.2.1. Xây dựng quy trình xác định hoạt tính của streptokinase và
streptodornase 43

4.2.2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng để xác định hoạt tính enzym
trong chế phẩm thuốc chứa streptokinase và streptodornase 50

4.3. Áp dụng các quy trình đã xây dựng để kiểm tra chất lượng của một số chế
phẩm trên thị trường 67
4.3.1. Kiểm tra chất lượng một số chế phẩm chứa bromelain và trypsin 67

Bảng 14: Kết quả khảo sát độ
tuyến tính của phương pháp định lượng streptokinase
bằng phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose 52
Bảng 15: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng streptokinase bằng
phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose 53
Bảng 16: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Streptokinase bằng
phương pháp đo đường kính vòng ly giải fibrin trong agarose 54
Bảng 17: Kết quả khảo sát kho
ảng tuyến tính của phương pháp định lượng
Streptokinase bằng phương pháp đo thời gian ly giải khối đông 55
Bảng 18: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng Streptokinase
bằng phương pháp đo thời gian ly giải khối đông 56

Bảng 19: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Streptokinase bằng
phương pháp đo thời gian ly giải khối đông 57
Bảng 20: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Streptokinase bằng
phương pháp đo thời gian ly giải khối đông 58
Bảng 21: Kết quả định lượng Streptokinase của 1 số chế phẩm trên thị trường 59
Bảng 22: Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng streptodornase 60
Bảng 23: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn trong thử nghiệm khảo sát
độ lặp lại của phương pháp định lượng streptodornase 61
Bảng 24: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng streptodornase 62
Bảng 25: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn trong thử
nghiệm khảo sát
độ đúng của phương pháp định lượng streptodornase 63
Bảng 26: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng streptodornase 64
Bảng 27: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn 1 trong thử nghiệm khảo
sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng streptodornase 65
Bảng 28: Thời gian chảy trong nhớt kế của dung dịch chuẩn 2 trong thử nghiệm khảo
sát tính đặ


Hình 9: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và hệ số giảm độ nhớt trong
định lượng streptodornase 60

Hình 10: Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn độ giảm độ nhớt theo thời gian của dung
dịch chuẩn trong thử nghiệm khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng
streptodornase 61

Hình 11: Đường tuyến tính biểu diễn giảm độ nhớt theo thời gian của dung dịch
chuẩn trong thử nghiệm khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng
streptodornase 63

Hình 12: Đường tuyến tính biểu diễn giảm độ nhớt theo thời gian của dung dịch chuẩn
2 trong thử nghiệm khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng
streptodornase 66
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT KDa : Kilo Dalton
SK : Streptokinase
Arg : Arginin
Val : Valin
Asp : Asparagin
Lys : Lysin
Leu : Leucin
Plgn : Plasminogen
Pm : Plasmin

- Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của các enzym: Bromelain,
Trypsin, Streptokinase và Streptodornase trong chế phẩm hỗn hợp chứa 2 enzym
Bromelain, Trypsin và chế phẩm hỗn hợp Streptokinase, Streptodornase.
- Áp dụng phương pháp xác đinh hoạt tính của các enzym Bromelain, Trypsin,
Streptokinase và Streptodornase để kiểm tra chất lượng một số thuốc lưu hành trên
thị trường và thẩm định, xét duyệt tiêu chuẩn.
2. Phương pháp đã được sử dụng để nghiên cứu:
Đề tài Khoa học - Công nghệ “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hoạt
tính của 2 chế phẩm thuốc chứa enzym” là nghiên cứu đầu tiên được thực hiện một
cách có hệ thống để thiết lập các quy trình xác định hoạt tính của 4 enzym trong các
chế phẩm chứa hỗn hợp các enzym. Những kết quả nghiên cứu của đề tài có ý nghĩa
thực tiễn cao. Các quy trình xác định hoạt tính được thiết lập trong đề tài này đ
ã
được thẩm định chu đáo để chứng minh về sự phù hợp, độ tin cậy khi áp dụng xác
định hoạt tính từng thành phần enzyme trong chế phẩm thuốc chứa hỗn hợp 2
enzym, góp phần nâng cao khả năng kỹ thuật của hệ thống kiểm nghiệm giám sát
chất lượng thuốc.
Các phương pháp định lượng được xây dựng hướng tới phù hợp về mặt kỹ thuật
với
điều kiện trang thiết bị hiện tại của Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương và các
cơ sở thuộc hệ thống kiểm nghiệm thuốc nói chung. Trong một số trường hợp, do
chưa có phương pháp phù hợp, sau quá trình khảo sát sơ bộ, nhóm nghiên cứu đã
phải tiến hành cải tiến các điều kiện phân tích cho phù hợp với đối tượng mẫu thuốc
cần kiểm tra cũ
ng như điều kiện trang thiết bị hiện có.
Cụ thể, trong số 4 phương pháp xác định hoạt tính của 4 enzym thì chỉ có 2
phương pháp xác định hoạt tính của 2 enzym là Streptokinase (BP và CP) và
Trypsin (USP) là có sẵn trong các dược điển ở chuyên luận thuộc về các nguyên
liệu. Còn phương pháp xác định hoạt tính của Bromelain chưa có trong dược điển


thuốc trung ương
- Đã thiết lập báo cáo kết quả xác định hoạt tính của enzym Bromelain và
Trypsin của 09 chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này.

3
- Đã thiết lập báo cáo kết quả xác định hoạt tính của enzym Streptokinase và
Streptodornase của 09 chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym này.
Đã hoàn thiện được nội dung 4 bài báo khoa học, trong đó:
1/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Bromelain trong chế phẩm hỗn
hợp chứa Bromelain và trypsin. (Đã được đăng tạp chí Kiểm nghiệm số 2/2010).
2/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính enzym Streptokinase trong chế
phẩm hỗn hợp chứa Streptokinase và Streptodornase bằng phươ
ng pháp đo vòng ly
giải. (Đã được đăng tạp chí Kiểm nghiệm số 3/2010).
2 bài báo còn lại đã được chuẩn bị hoàn tất về nội dung, nhóm nghiên cứu sẽ gửi
đăng vào tháng 10/2010, cụ thể gồm các bài báo sau đây:
3/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Trypsin trong chế phẩm hỗn hợp
chứa Bromelain và trypsin.
4/ Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính Streptodornase trong chế phẩm
hỗn hợp chứa Streptokinase và Streptodornase.
4. Kết luận rút ra từ nghiên cứu:
- 4 quy trình định lượng xác định hoạt tính của 4 enzym Bromelain, Trypsin,
Streptokinase và Streptodornase trong 2 chế phẩm chứa hỗn hợp 2 enzym đã được
xây dựng, thẩm định dựa trên đối tượng nghiên cứu là các sản phẩm đang lưu hành
trên thị trường Việt Nam. Những quy trình này đã được chứng minh tính khả thi
trong điều kiện cơ sở vật chất của nước ta, trên đúng đối tượng áp dụng là các chế
phẩm chứa h
ỗn hợp 2 enzym, do đó đây là những giải pháp kỹ thuật có ý nghĩa ứng
dụng thực tiễn cao trong kiểm tra giám sát chất lượng thuốc chứa các hoạt chất
enzym tại Việt Nam.

xác định hoạt tính của streptokinase.
d) Xây dựng phương pháp xác định hoạt tính của enzyme Streptodornase trong chế
phẩm hỗn hợp chứa 2 enzyme Streptokinase và streptodornase:
- Đã xây dựng được cách xử lý mẫu thử và nồng độ dung dịch thử phù hợp
với phương pháp đo thời gian giảm độ nhớt của dung dịch cơ chất AND.
- Đã khảo sát sự ảnh hưởng bởi sự có mặt của enzym streptokinase đến
phương pháp xác đị
nh hoạt tính của streptodornase trong chế phẩm chứa hỗn hợp 2
enzyme này. Kết quả streptokinase không ảnh hưởng đến phương pháp xác định
hoạt tính của streptodornase trên cơ chất ADN.

5
5.Về cải tiến kỹ thuật:
- Cách xác định điểm dừng của phản ứng tiêu fibrin thực nghiệm (trong phương
pháp xác định hoạt tính Streptokinase):
Theo dược diển Anh 2003: phương pháp xác định điểm dừng quan sát bằng mắt,
sử dụng đồng hồ bấm giây. Trên thực tế điểm dừng rất khó quan sát.
Theo dược diển Mỹ (chuyên luận ly giải fibrin của Alteplase bằng cách xác định
bọt khí) thì cũng rất khó giam giữ bọt khí đồng đều trong các ố
ng nghiệm, hơn nữa trong
quá trình tạo bọt khí có ảnh hưởng lớn đến sự tạo fibrin nên kết quả không ổn định.
Vì vậy, nhóm nghiên cứu đã cải tiến cách xác định điểm ly giải hoàn toàn fibrin
bằng quan sát sự rơi cận đáy của viên bi chuẩn cho phép xác định chính xác điểm
dừng có độ đúng cao và dễ quan sát.
- Phương pháp xác định hoạt tính Streptodornase: Sử dụng nhớt kế Oswald với
mao quản thích h
ợp thay vì thiết bị xác định độ nhớt bằng điện cực Platin có gắn
bơm chân không. Vì thiết bị này chưa có tại Việt Nam và rất đắt tiền, còn nhớt kế
Oswald hiện có tại Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương.
6. Những đóng góp khác:

• Thực hiện các mục tiêu đề ra nhưng không hoàn chỉnh
• Chỉ thực hiện được mộ
t số mục tiêu đề ra
• Những mục tiêu không thực hiện được (ghi rõ)
c. Các sản phẩn tạo ra so với dự kiến trong bản đề cương:
• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm đã dự kiến trong đề cương
• Chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu như đã ghi trong đề cương
• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng ch
ất lượng có sản phẩm chưa đạt
• Tạo ra đầy đủ các sản phẩm nhưng tất cả các sản phẩm đều chưa đạt
chất lượng.
• Tạo ra được một số sản phẩm đạt chất lượng
• Những sản phẩm chưa thực hiện được (ghi rõ)
d. Đánh giá việc sử dụng kinh phí:
Tổng kinh phí thực hiện để
tài: 450 triệu đồng.
Trong đó Kinh phí sự nghiệp khoa học: 450 triệu đồng.
Kinh phí từ nguồn khác: 0 triệu đồng.
Trang thiết bị đã được đầu tư từ nguồn kinh phí của đề tài (chi phí những trang thiết
bị có giá trị trên 3000 USD): Không
Toàn bộ kinh phí đã được thanh quyết toán
Chưa thanh quyết toán xong: Không
Kinh phí tồn đọng: Không
X
X
X


của chúng như trong điều trị kháng viêm, chống phù nề trong ngọai khoa, trong điều
trị nhồi máu cơ tim, viêm tắc mạnh do huyết khối, hỗ trợ trong điều trị ung thư, sử
dụng phối hợp nhằm làm tăng hiệu quả kháng khuẩn của thuốc kháng sinh. Chính
nhờ các hiệ
u quả điều trị như vậy, nhiều chế phẩm thuốc chứa enzym đã được cấp
số đăng ký cho phép lưu hành tại Việt nam.
Trước đây trên thị trường Việt Nam chỉ có các chế phẩm sử dụng đơn thành
phần streptokinase trong điều trị và chuyên luận streptokinase đã được đưa vào
Dược thư quốc gia. Hiện nay, để tăng hiệu quả điều tr
ị, các chế phẩm thuốc chứa
đồng thời 2 enzym streptokinase và streptodornase đã được nhập vào nước ta trong
những năm gần đây để điều trị chống viêm nói chung và đặc biệt trong hỗ trợ
điều trị nhồi máu cơ tim, viêm tắc huyết khối. Chế phẩm hỗn hợp trypsin và
bromelain được sử dụng để hỗ trợ tiêu hóa, hỗ trợ điều trị ung thư

8
Về phương pháp kiểm nghiệm các enzym này, trong các dược điển mới chỉ
có Dược điển Anh quy định chuyên luận nguyên liệu Streptokinase, chưa có
chuyên luận của streptodornase nguyên liệu và các dạng chế phẩm, đặc biệt là chế
phẩm phối hợp gồm streptokinase và streptodornase.
Đối với enzym bromelain và trypsin, trong Dược điển Anh và Dược điển Mỹ
mới có chuyên luận nguyên liệu Trypsin, chưa có chuyên luận về chế phẩm.
Các tiêu chuẩn ch
ất lượng của các chế phẩm hiện có trên thị trường vẫn chưa
được thẩm định, đánh giá một cách đầy đủ. Đặc biệt là tiêu chuẩn của chế phẩm hỗn
hợp Streptokinase và streptodornase do các nhà sản xuất cung cấp vẫn chưa thực
hiện được với điều kiện của các cơ sở kiểm nghiệm trong nước do không có trang
thiết bị chuyên dụng.
Từ các lý do trên, việc
đánh giá chất lượng của các chế phẩm này hiện nay

định phương pháp xác định hoạt tính của chế phẩm
kết hợp 2 enzym streptokinase và streptodornase.
3. Áp dụng các phương pháp để kiểm tra chất lượng một số chế phẩm tương
tự lưu hành trên thị trường.

2. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
2.1. Enzym bromelain
2.1.1. Cấu trúc và tính chất của enzym bromelain
Enzym bromelain lần đầu tiên được phát hiện bởi nhà hóa học người
Venezuela Viente Marcane vào năm 1891 từ nước ép của quả dứa [18]. Năm 1982,
Chitenden, cộng tác với Joslin và Meara đã đi sâu nghiên cứu đầy đủ hơn và gọi
dịch chiết xuất đó là Bromelain. Sau đó, thuật ngữ Bromelain được dùng để chỉ các
enzym protease từ các thân và quả của họ dứa Bromeliaseae. Bromelain được chỉ
định là thuốc hỗ trợ
điều trị một số bệnh vào năm 1957. Những nghiên cứu về
Bromelain lần đầu tiên được tiến hành ở Hawai, nhưng hiện nay, các nước châu Á, châu
Âu và Châu Mỹ la tinh quan tâm đến nghiên cứu Bromelain nhiều hơn, đặc biệt là ở
Đức, Bromelain được sử dụng rộng rãi, đứng thứ 13 trong số các thảo dược.
Năm 1964 Murachi và cộng sự đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzym
Bromelain, kết quả như sau [1]:
. Tr
ọng lượng phân tử: 33200 - 33500 Dalton
. Hằng số lắng: 2,73 S
. Tỷ trọng: 1,346
. Điểm đẳng điện pI: 9,55

10
Bromelain là enzym thuộc nhóm enzyme thiol (Cystein) protease, có khả
năng phân cắt các liên kết peptid nội phân tử protein thành các đoạn nhỏ. Thành
phần hóa học của Bromelain là một glycoprotein. Mỗi phân tử có chứa 1 chuỗi


Hình 1: Sơ đồ cơ chế xúc tác của enzym Bromelain

Cũng giống như các loại chất sinh học khác, Bromelain cũng bị ảnh hưởng
bởi các yếu tố như nhiệt độ, pH, ion kim loại Ở điều kiện bảo quản 4
0
C, hoạt tính
sinh học của Bromelain không bị giảm trong khoảng 6 tháng, nhưng nếu ở 55
0
C, pH
6,0 thì hoạt tính có thể bị giảm tới 50% trong vòng 20 phút. Biên độ pH của
Bromelain khá rộng từ 3-10, nhưng pH tối ưu thường nằm trong khoảng 5-9. Các
ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của Bromelain là do thường gắn vào trung
tâm hoạt động của enzym. Bromelain bị ức chế bởi các ion hoặc những hợp chất có
ái lực mạnh hơn nhóm -SH như iodoacetat, methyl bromid, clo acetophenol, Hg
2+
,
H
2
O
2
. Trong khi đó, một số ion kim loại như Zn
2+
, Fe
2+
, Ag
+
, lại làm ổn định cấu
trúc phân tử của Bromelain.
Hiện nay, bromelain được sản xuất bằng cách tinh chế từ hỗn hợp chiết xuất

nhưng chưa được nghiên cứu lâm sàng trên phạm vi lớn để đánh giá tính hiệu quả.
. Trong điều trị ung thư:
Bromelain và nhóm enzym protease cũng được dùng như là thuốc hỗ trợ đ
iều
trị ung thư trong 1 số nghiên cứu lâm sàng trên trên bệnh nhân ung thư: Bromelain
tác dụng như một yếu tố điều hòa miễn dịch bằng cách làm tăng khả năng gây độc
tế bào của các tế bào đơn nhân để kháng lại các tế bào ung thư của bệnh nhân và
bằng cách kích thích tổng hợp các cytokin như yếu tố gây hoại tử khối u (Tumor

13
necrosis factor-a), interleukin -1β, interleukin-6 và Interleukin-8. Một số nghiên cứu
trên động vật thí nghiệm đã thu được kết quả khả quan về hiệu quả ngăn ngừa các
tế bào ung thư di căn khi phối hợp bromelain với dược chất nghiên cứu có hoạt tính
diệt tế bào ung thư [18].
2.1.3. Các phương pháp xác định hoạt tính của enzym bromelain
Hoạt tính của enzym Bromelain được xác định dựa trên khả năng thủy phân
các cơ chất khác nhau, cụ thể như
sau:
. Thủy phân cơ chất là casein: tạo ra sản phẩm là tyrosin. Định lượng tyrosin
bằng phương pháp quang phổ UV-VIS. Hoạt tính được xác định theo lượng tyrosin:
1 đơn vị bromelain là lượng enzym có khả năng thủy phân casein để giải phóng 1
mcg tyrosin trong 1 phút trong điều kiện nhất định [3, 4].
. Thủy phân cơ chất là gelatin: tạo ra sản phẩm là acid amin. Định lượng acid
amin bằng phương pháp chuẩn độ acid kiềm [7].
. Thủy phân cơ chất Nα- carbobenzoxy-L-lysin p-nitrophenyl ester: tạo ra
sản phẩm p-nitrophenol, làm thay đổi giá trị độ hấp thụ quang của dung dịch theo
thời gian. Hoạt tính của bromelain được xác định dựa theo lượng p-nitrophenol tạo
thành.
. Thủy phân các protein có trong hỗn dịch sữa làm đông vón hỗn dịch sữa.
Hoạt tính của bromelain được xác định bằng cách so sánh thời gian đông vón sữa

Trypsin cắt chuỗi peptid tại vị trí có acid amin lysin hoặc arginin ở phía gốc
carboxyl.
Trypsin là enzym thuộc nhóm serin protease. Nhóm serin protease gồm
những enzym có chứa nhóm -OH của gốc serin trong trung tâm hoạt động, có vai
trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này gồm 2 nhóm
nhỏ là chymotrypsin và subtilisin. Nhóm subtilisin gồm 2 loại enzyme vi khuẩn là
subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN. Các serin protease thườ
ng hoạt động mạnh ở
vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng [21].
Trypsin có chứa trung tâm hoạt động gồm bộ ba các acid amin là histadin-57,
aspartat-102 và serin-195. Bộ ba acid amin này nằm sát gần nhau và đóng vai trò
cần thiết trong hoạt tính phân hủy protein của các enzym protease do hình thành 1
“rơ le” tích điện để tạo ra vị trí hoạt động là serin ái nhân bằng cách thay đổi mật độ

15
điện tử của serin. Gốc acid amin aspartat (Asp 189) định vị trong trung tâm xúc tác
của trypsin làm ổn định gốc lysin và gốc arginin tích điện dương, do vậy nó có vai
trò trong tính đặc hiệu của enzym, có nghĩa là trypsin cắt protein ở đầu C tại vị trí acid
amin lysin và arginin. Toàn bộ các phản ứng được tóm tắt qua 5 bước như sau [ 22]:
. Bước 1: Cơ chất polypeptid gắn lên bề mặt của enzym sao cho liên kết bị cắt nằm
vào vị trí hoạt động của enzym bằng cách nguyên t
ử carbon của gốc carbonyl định
vị gần với gốc serin ái nhân.
. Bước 2: Gốc – OH của serin tấn công vào nguyên tử carbon và nitơ của gốc
histidin nhận –H từ -OH của serin và cặp điện tử từ liên kết đôi –C=O di chuyển về
phía nguyên tử oxy.
. Bước 3: Liên kết giữa Nitơ và carbon của mạch peptid bị bẻ gãy. Các điện tử hóa
trị của liên kết này di chuyển để tấn công vào nguyên tử -H củ
a histidin làm gãy
mối liên kết. Các điện tử đã chuyển dịch về phía nguyên tử oxy trong gốc carbonyl