P

NG
H
P
HÁ
P
S
ỐTR
Ư
H
IÊN
C
P
XÁ
C
Ố
CH
Ấ
V
KHÓA
L

Ư
ỜNG Đ
L
Ụ

L
H
ÂN
C
T
ỐT N
G

H
À NỘI
TẾ
C
DƯỢ
C
ZX

Ấ
N TÚ
Y
DỰ
N
À
M
L
L
ẬP
Đ
C
ÂY
G

Ừ
Ĩ
N
G
M
ỘT
Ừ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
WY  ZX
LỤC TUẤN TÚ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG
PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT
SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ
VỎ THÂN CÂY GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
2. DS. Phạm Lê Minh
Nơi thực hiện:
1. Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ
phẩm Hà Nội

Hà nội, tháng 05 năm 2013.

Lục Tuấn Tú

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1.TỔNG QUAN VỀ CÂY GẠO 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật 2
1.1.2. Tính vị và công năng của cây Gạo 2
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 3
1.2.TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VỎ THÂN CÂY GẠO 3
 Hoạt động antiangiogenic của Lupeol 4
 Tác dụng hạ huyết áp 4
 Tác dụng chống viêm 4
 Tác dụng bảo vệ gan 4
 Tác dụng ức chế sự hình thành các tế bào tĩnh mạch trung tâm rốn của con
người ……………………………………………………………………………4
 Tác dụng kháng khuẩn, kháng n
ấm 5
1.3.CÔNG DỤNG CỦA VỎ THÂN CÂY GẠO 5
1.4.THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỎ THÂN CÂY GẠO 5
1.4.1. Công thức hoá học, tính chất vật lý, tác dụng dược lý của một số chất phân
lập từ vỏ thân cây Gạo 6
1.5.MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 12
1.5.1. Khái niệm sắc ký lỏng hiệu năng cao 12



3.5.3. Độ lặp lại 37
3.5.4. Khoảng nồng độ tuyến tính 37
3.5.5. Độ đúng 41
3.5.6. Giới hạn phát hiện LOD và giớ
i hạn định lượng LOQ 41
3.6. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG VỎ THÂN CÂY GẠO42
3.7.BÀN LUẬN 42
3.7.1. Về phương pháp xử lý mẫu 42
3.7.2. Về khảo sát điều kiện sắc ký HPLC 43
3.7.3. Về kết quả định lượng các chất trong vỏ thân cây Gạo 43
3.7.4. Về thẩm đị
nh phương pháp định lượng 43
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45
KẾT LUẬN 45
ĐỀ XUẤT 46

TÀI LIỆU THAM KHÁO
PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
C:
Nồng độ (µg/mL)
ESI:
Ion hóa bằng phun điện tử (Electronspray ionization)
EtOH:
Ethanol

:
Thời gian lưu
UV-VIS:
Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet visible) 

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1. Độ ẩm bột dược liệu
27
Bảng 3.2. Một số thông số thể hiện sự phù hợp của hệ HPLC đã lựa chọn 36
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại với các chất phân tích 37
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tuyến tính với epicatechin 38
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tuyến tính với catechin 38
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tuyến tính với daucosterol 39
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát tuyến tính với Lupeol 39
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát tuyến tính với Stigmasterol 40
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tuyến tính với friedelin 40
Bàng 3.10. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 6 chất 41
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát LOD và LOQ (µg/mL) 41
Bảng 3.12. Kết quả xác định hàm lượng từng chất trong mẫu vỏ thân cây Gạo
nghiên cứu
42
Bảng phụ lục. Kết quả khảo sát độ đúng của 6 chất trong vỏ thân cây Gạo.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Gạo (Bombax malabaricum DC.) là cây gỗ cao đến 15m, có hoa màu đỏ
tươi, được biết đến như là một cây thuốc dân gian tại các nước Pakistan, Ấn Độ,
Trung Quốc, Việt Nam và châu Phi. Theo kinh nghiệm dân gian, nhiều bộ phận của
cây như vỏ thân, hoa và nhựa được sử dụng để trị các bệnh như viêm loét dạ dày,
viêm loét ngoài da, thấp khớp, bó gãy xương, kiết lỵ.
Từ vỏ thân cây Gạo, nhóm tác giả Hồ Thị Thanh Huyề
n và cộng sự đã
nghiên cứu với mẫu thu hái tại Hà Nội, các tác giả đã phân lập được một số thành
phần như epicatechin [11], catechin, momor-cerebroside I [12], lupeol, stigmasterol
[13], friedelin và daucosterol.
Ngày nay, trên thế giới xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn
thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo dược ngày càng tăng. Ở Việt Nam, với lợi thế
về địa hình và khí hậu đã tạo ra nguồn tài nguyên cây cỏ vô cùng phong phú cũ
ng
như nguồn dược liệu dồi dào cùng với tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc từ lâu đời.
Tuy nhiên nhiều loài cây được sử dụng rộng rãi theo kinh nghiệm dân gian mà chưa
có hoặc có rất ít nghiên cứu có giá trị khoa học. Cần có các nghiên cứu xác định
hàm lượng các hợp chất đã tìm thấy trong dược liệu để đánh giá đúng tiềm năng của
nguồn dược liệu và góp phần tiêu chuẩn hóa nguyên liệu trong quá trình hiệ
n đại
hóa các thuốc có nguồn gốc dược liệu. Do đó, đề tài “Nghiên cứu xây dựng
phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ vỏ thân cây
Gạo” đã được thực hiện nhằm mục tiêu:
1. Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất đã
được phân lập từ vỏ thân cây Gạo bằng phương pháp HPLC.
2. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để sơ bộ xác định hàm lượng
epicatechin, catechin, daucosterol, lupeol, stigmasterol và friedelin có trong một
mẫu vỏ thân cây Gạo thu hái được.


- Rễ có vị đắng, tính mát, có tác dụng kích thích, bổ, cũng có tác dụng gây
nôn và giảm đau [17], ngoài ra còn có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, thu liễm, chỉ
huyết, tán kết, chỉ thống. Ở Indonesia, nước ép rễ có tác dụng hạ sốt [3].
- 3 -

- Vỏ từ 15 – 16g, có thể sắc và ngậm chữa đau răng [15]. Vỏ còn được dùng
trị thấp khớp, đau giập gãy xương, dùng cầm máu trong các chứng băng huyết (phối
hợp với rễ non và hạt cây tươi), liều dùng 15 – 30g [5], dùng đắp chữa tàn nhang,
mụn trứng cá, các rối loạn sắc tố da [10].
- Lá Gạo được dùng rất tốt cho đái dắt, phát ban, chữa thiếu máu, chữa lỵ
[10].
- Hạt bông Gạo làm tăng tiết sữa ở phụ nữ sau khi sinh [17].
- Nhựa gôm chích từ thân cây Gạo được dùng chữa lậu, kiết lỵ, cầm máu,
rong kinh, kích dục [3].
- Rễ Gạo ép lấy nước chữa sốt, chữa kiết lỵ, chữa đau dạ dày mạn tính [3],
chữa đau thượng vị, viêm hạch bạch huyết dạng lao và làm thuốc lợi tiểu. Ở Ấn Độ,
người ta dùng rễ làm thuốc kích dục cho trường hợp bất lực, liều dùng 30 – 50g
[17].
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến
Toàn cây được sử dụng cho các mục đích khác nhau:
- Vỏ thân: thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa xuân [2], [18], [19] nhưng
cũng có tài liệu [6] cho rằng tốt nhất vào mùa hè. Vỏ thân mang về cạo bỏ vỏ thô
bên ngoài, rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô sắc uống, hoặc dùng tươi giã nát để đắp
ngoài [15], [4].
-
Rễ: thu hái vào mùa xuân hay mùa thu, rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô [15],
[4].
- Hoa: hái vào mùa xuân, ép lấy nước (dùng tươi) hoặc phơi khô, tán thành
bột để uống [15], [4], [18], [19].
- Gôm, gỗ, nhựa, hạt, quả, bông: cũng được thu hái, chế biến phù hợp với

dụng giảm nhẹ tổn thương gan gây ra bởi CCl4. Tác dụng giảm mức độ hoại tử tế
bào, giảm thoái hóa cũng được ghi nhận. Dịch chiết methanol của một số bộ phận
của cây, cao lỏng 1g/mL cũng được chứng minh là có tác dụng làm giảm men gan,
giảm sự suy thoái và hoại tử tế bào gan thông qua thử nghiệm gây độc tế bào gan
bằng CCl4.
 Tác dụng ức chế sự hình thành các tế bào tĩnh mạch trung tâm rốn của con
người
Do sự hình thành mạch quá nhiều cũng là một tiến trình bệnh lý thuộc bệnh
viêm khớp, thấp khớp nên Nguyễn Hải Nam cùng các nhà khoa học Hàn Quốc đã
- 5 -

tiến hành nghiên cứu tác dụng ức chế sự hình thành các tế bào tĩnh mạch trung tâm
rốn của một số cây thuốc thu hái tại Việt Nam. Trong số 58 cây nghiên cứu thì có 7
cây có tác dụng ức chế trong đó có cây Bombax malabaricum DC. [43].
 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Theo [28], dịch chiết nước, dịch chiết ethanol, dịch chiết ether của bột vỏ
thân được chứng minh là có tác dụng kháng khuẩn, với chất đối chiếu ofloxacin.
Mẫu nghiên cứu có tác d
ụng trên các chủng vi khuẩn như: Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Klebsiella
aerogenes, Neisseria gonorrhoae. Các dịch chiết cũng có tác dụng kháng nấm, với
chất đối chiếu fluconazole, chủng nấm thử là Candida albicans.
1.3. CÔNG DỤNG CỦA VỎ THÂN CÂY GẠO
Vỏ thân cây Gạo dùng tươi chữa gãy xương, sai khớp, viêm khớp và một số
bệnh khác liên quan tới cơ xương khớp. Đồng bào ở Tây Nguyên dùng vỏ Gạo và
vỏ cây đa quả to, phơi khô, thái nhỏ, sắc uống chữa bệnh đậu mùa. Nước sắc đặc
của vỏ Gạo được ngậm chữa đau răng [15], [4], [9], [18], [19]. Vỏ thân còn dùng để
cầm máu trong chứng băng huyết (phối hợp với rễ non và hạt cây tươi) [6], [7]. Vỏ
Gạo sao vàng sắc uống làm thuốc an thần, lợi tiểu với liều 15-20g/ngày. Vỏ khô sắc
uống 10-20g/ngày, dùng đồng thời giã đắp để chữa quai bị. Nước sắc v

12,13,13a, 13b-hexadecahydrocyclopenta [a]chrysene-9-ol
- Tổng hợp: Năm 2009 Surendra và Corey đã báo cáo một con đường để
tổng hợp Lupeol từ (1E,5E)-8-[(2S)-3,3-dimethyloxiran-2-yl]-2,6-dimethylocta-1,5-
dienyl acetate [38].
- Công thức phân tử: C
30
H
50
O
- Khối lượng phân tử: 426,72 g/mol
- Điểm nóng chảy: 212
o
C
- Độ tan: tan tốt trong MeOH, ether, benzene
- λ
max
: 350nm
- 7 -

• Tác dụng dược lý
- Năm 2003, Young-Jea You và cộng sự tiến hành sàng lọc một số dược
liệu thu hái tại Việt Nam có tác dụng antiangiogenic cho thấy dịch chiết methanol
của vỏ thân cây Gạo (cụ thể là lupeol) có tác động antiangiogenic trên dòng tế bào
thuộc màng trong ống dây rốn (HUVEC) [31], [43].
- Cũng theo [41], [43], [23], lupeol còn có tác dụng giảm nhẹ tổn thương
gan gây ra bởi CCl4. Tác dụng giảm mức độ hoại tử tế bào, giảm thoái hóa cũ
ng
được ghi nhận. Ngoài ra, lupeol còn có tác dụng dãn mạch, hạ huyết áp.
- Một số nghiên cứu khác cũng chứng minh lupeol có tác dụng chống viêm
[42], [21], [20], [28], [23] và tác dụng chống oxy hoá, có thể ứng dụng trong điều trị

- Theo Katsuyuki Tanabe và cộng sự tại Đại học Kyoto, Nhật bản, đã
chứng minh được rằng epicatechin có tác dụng hạn chế tổn thương thận do tác dụng
bảo vệ tế bào ty thể của thận [39].
- Ngoài ra, trong nghiên cứu [34], Parmvir Bahia và cộng sự đã đưa ra rằng
epicatechin có tác dụng kích thích các yếu tố đáp ứng ERK thông qua AMP vòng để
điều chỉnh GluR2 trong tế
bào thần kinh vỏ não, qua đó có tác dụng cải thiện dẫn
truyền thần kinh, cải thiện trí nhớ.
- Cải thiện các chức năng về mạch máu [35]. Tháng 4 năm 2005, Hagen
Schroeter và cộng sự đưa ra rằng, Epicatechin và chất chuyển hoá của nó là
epicatechin-7-O-glucuronide đều có tác dụng lên cải thiện mạch máu tại động mạch
chủ trên thỏ. Và cũng chứng minh được rằng thực phẩm giàu flavanol (Epicatechin)
phát huy lợi ích trên sức kh
ỏe tim mạch làm giảm rối loạn chức năng nội mô, là một
nguy cơ quan trọng liên quan trong tiên lượng xơ vữa động mạch [35].
1.4.1.3. Catechin

• Nguồn gốc
Là đồng phân quang học của Epicatechin. Năm 2012, Hồ Thị Thanh Huyền
cũng đã phân lập được catechin từ vỏ thân cây Gạo [12].
• Tính chất vật lý
- Tên khoa học: (2R, 3S)-2-(3, 4-dihydroxyphenyl)-3, 4-dihydro-1H-
chromene-3, 5, 7-triol
- Công thức phân tử: C
15
H
14
O
6


1.4.1.4. Daucosterol

• Nguồn gốc:
Năm 2012, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự cũng đã phân lập được
Daucosterol từ vỏ thân cây Gạo [12].
• Tính chất vật lý
- Tên khoa học: (3R, 4S, 5S, 6R)-2-[[(3S, 8S, 9S, 10R,13R, 14S)-17-[(2R,
5R)-5-ethyl-6-methylheptan-2-yl]-10, 13-dimethyl-2, 3, 4, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15,
- 10 -

16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl]oxy]-6-(hydroxymethyl)
oxane-3,4,5-triol
- Công thức phân tử: C
35
H
60
O
6

- Khối lượng phân tử: 576,847 g/mol
- Nhiệt độ nóng chảy: 284-286°C
- Độ tan: Tan tốt trong MeOH
• Tác dụng dược lý
- Theo [26], tác dụng dược lý được biết tới của daucosterol đó là điều hoà
miễn dịch cơ thể, thông qua làm tăng hoạt tính của tế bào CD4 và Th1 tại chuột qua
đó làm giảm sinh trưởng của tế bào nấm men Candida albicans. Trong nghiên cứu
này, Lee JH và cộng sự tại đại học Dongduk Women đã đưa ra kết quả daucosterol
giúp bảo vệ tế bào chuột bởi nấm men Candida.
1.4.1.5. Stigmasterol


ng hợp progesterol [30].
Progesterol là một hormon quan trọng trong cơ thể, progesterol có thể dùng một
mình để tránh thai và điều trị nhiều loại bệnh, bao gồm xuất huyết tử cung bất
thường, vô kinh, lạc nội mạc tử cung, ung thư vú, thận, ăn mất ngon và sụt cân do
AIDS. Do đó, việc tổng hợp ra Progesterol mang tính thực tiễn rất cao.
- Nguyên liệu để tổng hợp cortison [27]. Cortison cũng là một hormon có
tác dụng giảm đau, dùng trong các bệnh lý mi
ễn dịch. Cùng với việc tổng hợp ra
Progesterol, tổng hợp cortison từ Stigmasterol cũng có rất nhiều ứng dụng trong
thực tế.
1.4.1.6. Friedelin

• Nguồn gốc
Năm 2012, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập được từ vỏ thân cây
Gạo, ngoài ra friedelin còn được tìm thấy trong lá cây Azima tetracantha L. [22]. - 12 -

• Tính chất vật lý
- Tên khoa học: (4R, 4aS, 6aS, 6bR, 8aR, 12aR, 12bS, 14aS, 14bS) - 4, 4a, 6b,
8a, 11, 11, 12b, 14a-octamethylicosahydropicen-3(2H)-one
- Công thức phân tử: C
30
H
50
O
- Khối lượng phân tử: 426,72g/mol
- Nhiệt độ nóng chảy: 262-265
o

1.5.2. Các thông số đặc trưng [1]
 Hệ số phân bố K
Hệ số phân bố K của chất phân tích đặc trưng cho tốc độ di chuyển của chất
đó qua pha tĩnh và được xác định bằng:
K =

: Nồng độ chất tan trong pha tĩnh.
: Nồng độ chất tan trong pha động
Nếu
= thì quá trình sắc ký sẽ không tách được hai chất A và B ra khỏi
nhau.
càng nhiều thì khả năng tách hai chất A và B trong quá trình sắc ký
càng lớn.
 Thời gian lưu
(phút)
Là thời gian từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến khi xuất hiện đỉnh của
pic (thời gian lưu đặc trưng cho một chất). So sánh thời gian lưu của mẫu thử và
mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện sẽ định tính được chất đó.

K
’
: Hệ số dung lượng
Trong một phép phân tích, nếu
nhỏ quá thì sự tách kém, còn quá lớn
(
>20 phút) thì pic bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài
 Hệ số dung lượng K
’

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong

= hoặc =
Trong đó:
, : thời gian lưu của 2 pic liền kề của 2 chất tan A và B (phút).
, : độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B (phút).
, : độ rộng đáy pic ở nửa chiều cao pic của chất A và B (phút).
Trong thực tế nếu các pic cân đối (Gauss) thì độ phân giải tối thiểu để 2 pic
có độ lớn bằng nhau tách ra khỏi nhau là R=1,0.
 Hệ số bất đối
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, được tính theo công thức:
AF = - 15 - Trong đó:
: chiều rộng pic được đo ở 1/20 chiều cao pic.
a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía
trước của pic ở 1/20 chiều cao pic.
Trong phép định lượng yêu cầu: 0,9
AF 2.
 Hệ số chọn lọc

Hệ số chọn lọc
đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỉ đối của hai chất A và B

Theo qui ước:
< nên < 1.
Thường chọn 1,05
2. Nếu quá lớn, thời gian phân tích sẽ dài.