BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
VŨ ĐỨC HOÀN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH
MACROLID TRONG NƯỚC THẢI BẰNG
SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI 2015BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
VŨ ĐỨC HOÀN

Tôi cũng xin gửi cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa phân
tích và Độc chất, Bộ môn Vật lý – Hóa lý – Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Công
nghệ Dược phẩm Quốc gia đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong quá
trình thực hiện khóa luận.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và những người luôn động viên,
tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này.
Hà Nội, ngày 11 tháng 5 năm 2015
Sinh viên VŨ ĐỨC HOÀN MỤC LỤC
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2
1.1.1. Tổng quan về nhóm Macrolid 2
1.1.2. Tổng quan về Azithromycin 5
1.1.3. Tổng quan về Clarithromycin 6
1.1.4. Tình trạng đề kháng của vi khuẩn 7
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 9
1.2.1. Thiết bị khối phổ 10
1.2.2. Một số kỹ thuật ghi phổ 12
1.2.3. Một số ưu điểm của sắc ký lỏng khối phổ 13
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC MACROLID 13

CLARI
DAD
EPA
IS
HPLC
LC - MS/MS

MS
t
R
S
pic
MeOH
LOD
LOQ
LQC
MQC
HQC
SPE
R(%)
SD
RSD
Tiếng Anh
Azithromycin
Clarithromycin
Diode array detector
Environmental Protection Agency
Internal standard
High performance liquid chromatography
High performance liquid chromatography

Nồng độ định lượng trung bình
Nồng độ định lượng cao
Chiết pha rắn
Hiệu suất thu hồi
Độ lệch chuẩn
Độ lệch chuẩn tương đối
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số kháng sinh nhóm Macrolid 4
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát điều kiện ion hóa 23
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát điều kiện bắn phá 23
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại hệ thống 27
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và đường chuẩn 30
Bảng 3.5. Kết quả độ lặp lại ở nồng độ LQC 32
Bảng 3.6 Kết quả độ lặp lại ở nồng độ MQC 32
Bảng 3.7. Kết quả độ lặp lại ở nồng độ HQC 33
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng 35
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ thu hồi. 35

DANH MỤC CÁC HÌNH


chứng minh được mối liên hệ giữa nồng độ dư lượng kháng sinh trong môi trường với
khả năng đề kháng lại kháng sinh của vi khuẩn.
Trong những năm gần đây thì tại Việt Nam, số lượng và chủng loại kháng sinh
được sản xuất ngày càng nhiều, trong đó nhóm kháng sinh macrolid là một trong những
nhóm có số lượng sản xuất và sử dụng rất lớn [2]. Vì vậy trong quá trình sản xuất và sử
dụng nhóm kháng sinh này thì vấn đề kiểm soát dư lượng kháng sinh thải ra môi trường
cần phải được quan tâm đúng mức. Điều này đòi hỏi phải xây dựng được một phương
pháp định lượng có độ tin cậy để làm công cụ đánh giá. Xuất phát từ những yêu cầu trên
chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng một số
kháng sinh macrolid trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ” đề tài được thực
hiện với hai mục tiêu:
1. Lựa chọn các điều kiện và xây dựng qui trình định lượng đồng thời hai kháng sinh
Clarithromycin và Azithromycin trong nước thải bằng phương pháp LC-MS/MS.
2. Thẩm định phương pháp phân tích. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
1.1.1. Tổng quan về nhóm macrolid
Erythromycin là kháng sinh đầu tiên thuộc nhóm macrolid được dùng rộng rãi nhất,
bắt đầu sử dụng trên lâm sàng từ nǎm 1952. Cho tới những nǎm 1990, erythromycin và
một macrolid dùng không thường xuyên là troleandomycin là 2 đại diện của nhóm này.
Nǎm 1991, azithromycin và clarithromycin được tổng hợp và đưa ra thị trường, nǎm
1995 dirithromycin có mặt trên thị trường. Các thuốc mới xuất hiện này có tiến bộ rõ rệt
so với erythromycin mặc dù giá đắt hơn [19].
1.1.1.1. Cấu trúc nhóm macrolid
Các macrolid là những kháng sinh có cấu trúc heterosia mà phần genin là một vòng

 Dạng base không thân nước, dễ tan trong nhiều dung môi hữu cơ, thuận lợi khi
chiết xuất macrolid từ môi trường nuôi cấy vi sinh như chiết một alkaloid. Muối với các
acid tan trong nước nhưng dung dịch không bền, dễ kết tủa lại dạng base.
 Tất cả các chế phẩm macrolid đều là bột màu trắng, vị rất đắng.
 Vòng lacton lớn dễ bị mở trong môi trường pH, kiềm hoặc acid.
4  Macrolid tạo màu với một số thuốc thử: Acid HCl, H
2
SO
4
đậm đặc, xanthydrol,
p-dimethylamino benzaldehydyd. Những phản ứng màu này được định tính, nhận biết
sơ bộ macrolid [3],[4].
Bảng 1.1: Một số kháng sinh nhóm macrolid
Tên
Năm phát hiện
Chủng sinh kháng sinh
Nhóm kháng khuẩn Erythromycin
1952
Str.erythreus
Oleandomycin
1954
Str.antibioticus
Azithromycin
1980

Str.nodosus

5 1.1.1.3. Phổ tác dụng
 Vi khuẩn Gram (+): Tụ cầu, phế cầu, liên cầu, trực khuẩn than, bạch hầu.
 Vi khuẩn Gram (-): Lậu cầu, màng não cầu.
 Một số vi khuẩn yếm khí, Mycoplasma, Rickettsiae, Chlamydiae…
 Không nhạy cảm với phần lớn vi khuẩn gram (-), do kháng sinh khó thâm nhập
vào nội bào vi khuẩn.
 Với phổ tác dụng trên, kết hợp đặc tính phân bố, macrolid chỉ dùng để uống điều
trị vi khuẩn gram (+), vi khuẩn yếm khí ở các cơ quan sâu trong cơ thể [3].
1.1.2. Tổng quan về Azithromycin
1.1.2.1. Công thức cấu tạo

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của Azithromycin.

Công thức phân tử: C
38
H
72
N
2
O
12

Khối lượng phân tử: 748,98



H
69
NO
13

 Khối lượng phân tử: 747,953
 Tên khoa học: (3R, 4S, 5S, 6R, 7R, 9R, 11S, 12R, 13S, 14S)-6-
{[(2S,3R,4S,6R)-4-(dimethylamino)-3-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy} -
7 14-ethyl-12,13-dihydroxy-4-{[(2R,4S,5S,6S)-5-hydroxy -4-methoxy-4,6-
dimethyloxan-2-yl]oxy}-7-methoxy-3,5,7,9,11,13-hexamethyl-1-
oxacyclotetradecane-2,10-dione [3],[4].
1.1.3.2. Tính chất hóa lí
 Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Không tan trong nước, tan trong aceton
và methylene clorid, khó tan trong methanol.
 Góc quay cực từ -94
o
đến -102
O
, tính theo chế phẩm đã làm khô [3],[4].
1.1.4. Tình trạng đề kháng của vi khuẩn
Kháng sinh là những chất có nguồn gốc sinh học, tổng hợp hoặc bán tổng hợp mà
ngay ở nồng độ thấp đã có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật một cách đặc
hiệu.Việc khám phá và phát triển các kháng sinh đã tạo ra các thế hệ vũ khí hữu hiệu
giúp con người chống lại vi khuẩn. Tuy nhiên, việc nghiên cứu phát triển kháng sinh mới
đang có xu hướng giảm theo thời gian: 1936 phát minh ra các sulfonamid, 1940 phát
minh ra penicilin, 1949: tetracyclin, 1949: chloramphenicol, 1950: aminoglycosid, 1952:
macrolid, 1958: glycopeptid, 1962: streptogramin và quinolon, 1999: oxazolidinon và

lệ kháng xấp xỉ trên 60%. Tỷ lệ kháng imipenem năm 2009 là 35%, tăng gần gấp đôi so
với tỷ lệ này năm 2006 (18,4%). Tổng hợp các nghiên cứu trong những năm gần đây cho
thấy:
 Ở Việt Nam, các chủng Streptococcus pneumoniae - một trong những nguyên
nhân thường gặp nhất gây nhiễm khuẩn hô hấp - kháng penicillin (71.4%) và kháng
erythromycin (92.1%) - có tỉ lệ phổ biến cao nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám
sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP) năm 2000-2001.
 75% các chủng pneumococci kháng với ba hoặc trên ba loại kháng sinh.
 57% Haemophilus influenzae (một căn nguyên vi khuẩn phổ biến khác) kháng
với ampicillin.
9  Các vi khuẩn gram âm đa số là kháng kháng sinh (enterobacteriaceae): hơn 25%
số chủng phân lập tại một bệnh viện kháng với kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 (theo
nghiên cứu năm 2000-2001). Theo báo cáo của một nghiên cứu khác năm 2009 cho thấy,
42% các chủng vi khuẩn gram âm kháng với ceftazidime, 63% kháng với gentamicin và
74% kháng với acid nalidixic tại cả bệnh viện và trong cộng đồng.
 Xu hướng gia tăng của tình trạng kháng kháng sinh cũng thể hiện rõ rệt. Những
năm 1990, tại thành phố Hồ Chí Minh, chỉ có 8% các chủng pneumococcus kháng với
penicillin. Đến năm 1999-2000, tỉ lệ này đã tăng lên 56%. Xu hướng tương tự cũng được
báo cáo tại các tỉnh phía bắc Việt Nam [2],[7].
Hiện nay vẫn chưa có một nghiên cứu đánh giá căn bản, toàn diện về nguyên nhân
của tình trạng kháng thuốc và những biện pháp hữu hiệu để kiểm soát tình hình. Một số
nhóm nguyên nhân hàng đầu được cho là:
 Lạm dụng sử dụng kháng sinh, thiếu kiến thức về sử dụng kháng sinh hợp lý
 Thiếu cơ chế kiểm soát lượng kháng sinh tồn dư thải ra môi trường từ các nguồn:
nước thải bệnh viện, nước thải từ các nhà máy sản xuất dược phẩm và thú y. Nguồn chất
thải này chứa một lượng đáng kể kháng sinh lâu ngày không bị phân hủy sẽ làm tăng khả
năng chống chịu của vi khuẩn, gây đột biến gen tạo ra các chủng kháng thuốc.

đi đến bộ phận phát hiện.
 Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại
thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
 Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)
11
Hình 1.4. Cấu tạo thiết bị khối phổ
Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ phải
đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa
hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Nguyên nhân là do quá trình phân tích với đầu
dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái
khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một
lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng. Để
khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một kỹ thuật trung gian gọi là giao diện. Rất
nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùm tia hạt, bắn phá nguyên tử
nhanh dòng liên tục … đã được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thập
nhiên 80 nhờ kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization –
API) mới tạo ra bước đột phá thật sự cho phương pháp LC-MS/MS
Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong
buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho LC-MS
như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (Continuous Flow- Fast Atom
Bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (Thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp.
Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc
của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ
thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những
ion con tùy theo yêu cầu phân tích. Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API
trong LC-MS:
 Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization – ESI).
dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân
mảnh khi đã biết ion mẹ.
 SRM (Selected Reaction Monitoring) v MRM (Multiple Reaction Monitoring)
Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ thuật
ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.
 SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion
sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.
 MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các
ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn
SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó
tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều)
ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện [1],[6],[11].
1.2.3. Một số ưu điểm của sắc ký lỏng khối phổ
Đặc tính nổi bật của LC-MS là tính chọn lọc và độ nhạy cao. Vì vậy mà khối phổ
thường được sử dụng để xác định lượng siêu vết trong mẫu có thành phần phức tạp như
định tính, định lượng thuốc và các dạng chuyển hóa trong dịch sinh học, độc chất học,
định lượng dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo quản, chất cấm trong các mẫu thực phẩm,
mỹ phẩm, dược liệu, thủy hải sản và môi trường. Ngoài ra phương pháp khối phổ còn có
thể được sử dụng để xác định mức độ tinh khiết của chất chuẩn hoặc mẫu chuẩn cần
phân tích.
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC MACROLID
Nghiên cứu của Taninaka C

và cộng sự (2000) xác định nồng độ của erythromycin
(EM), Roxithromycin (RXM), và azithromycin (AZM) trong huyết tương chuột bằng
HPLC với phát hiện amperometric sử dụng clarithromycin (CLARI) là một chất chuẩn
nội. Mỗi loại thuốc được chiết xuất từ 150 microl mẫu huyết tương tăng vọt với chất
chuẩn nội dưới môi trường kiềm với tert-butyl methyl ether. Điện thế thiết lập cho

azithromycin và chất chuẩn nội.Độ chính xác trong ngày và giữa các ngày nằm trong
khoảng từ 4,8% đến 8,6% và 6,4% đến 10,7% (RSD). Phương pháp thành lập đã được
15 áp dụng thành công để nghiên cứu tương đương sinh học của 2 công thức azithromycin
cho 24 tình nguyện viên khỏe mạnh [13].

16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Mẫu trắng: mẫu nước thải không chứa kháng sinh nghiên cứu lấy tại bể nước
thải thứ cấp của Xí nghiệp dược phẩm TW2.
- Các kháng sinh clarithromycin và azithromycin.
2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
2.2.1. Hoá chất – thuốc thử - chất chuẩn
Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu:
 Các chất chuẩn:
- Clarithromycin: Chuẩn quốc gia, hàm lượng 97,31%. Nguồn gốc: Viện kiểm
nghiệm thuốc Trung ương
- Azithromycin: Chuẩn quốc gia, hàm lượng 98,62 %. Nguồn gốc: Viện kiểm
nghiệm thuốc Trung ương
- Ciprofloxacin 13C3: hàm lượng 93,47 %. Nguồn gốc: Cambridge Laboratories (
Mỹ)
 Thuốc thử, dung môi sử dụng trong nghiên cứu:
- Methanol, Acid formic, Acetonitril, Na
2
EDTA (Merck-Đức).

Na
2
EDTA.
2.3.1.2. Phương pháp chiết tách kháng sinh macrolid từ nước thải
Do mẫu có tính chất phức tạp và lượng chất phân tích trong mẫu (nếu có) rất nhỏ,
lựa chọn phương pháp chiết pha rắn. Để tìm được quy trình tối ưu chiết tách và làm giàu
mẫu với các kháng sinh macrolid nghiên cứu:
- Loại cột chiết sử dụng: Cột chiết pha rắn OASIS HLB Cartridge 200 mg, 6ml(Mỹ)
- Hoạt hóa cột với các dung môi: 10 ml MeOH, 5 ml H
2
O và 5ml H
2
O pH = 2,0
(acid hóa nước bằng HCl 10%) theo thứ tự để chuyển pha rắn sang trạng thái có thể lưu
giữ chất phân tích trong mẫu.
- Nạp mẫu bằng cách cho 100ml dung dịch mẫu qua cột với tốc độ dòng 5 -10 ml
phút.