BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRẦN THỊ THANH HUẾ
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
DƯ LƯỢNG CEFIXIM CÓ TRONG NƯỚC THẢI
TỪ CƠ SƠ SẢN XUẤT DƯỢC BẰNG HPLC
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRẦN THỊ THANH HUẾ
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
DƯ LƯỢNG CEFIXIM CÓ TRONG NƯỚC THẢI
TỪ CƠ SƠ SẢN XUẤT DƯỢC BẰNG HPLC
HÀ NỘI - 2013
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS
Nguyễn Thị Kiều Anh và TS. Đoàn Cao Sơn, là những người thầy đã trực tiếp
hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành tốt luận văn này.
Đặc biệt, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám đốc Viện
kiểm nghiệm thuốc Trung ương và TS. Nguyễn Thị Kim Hương – Trưởng khoa
Dược lý, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung
ương cùng tập thể cán bộ trong khoa đã
tạo điều kiện và giúp đỡ cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể
các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin c
ảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên,
khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Hà Nội, ngày 20 tháng 8 năm 2013
Học viên
Trần Thị Thanh Huế
2.2.2. Thiết bị - dụng cụ 20
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.3.1. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu
21
2.3.2. Xây dựng điều kiện sắc ký
21
2.3.3. Đánh giá phương pháp 21
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu 23
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
24
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 24
3.1.1. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 24
3.1.2. Khảo sát quy trình phân tích 33
3.1.3. Quy trình phân tích 37
3.2. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 38
3.2.1. Độ thích hợp của hệ thống 38
3.2.2. Tính chọn lọc của phương pháp 39
3.2.3. Độ tuyến tính 43
3.2.4. Độ đúng và độ chính xác của phương pháp 45
3.2.6. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 49
3.2.6. Khảo sát độ ổn định 50
3.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH XÂY DỰNG ĐƯỢC ĐỂ XÁC ĐỊNH DƯ
LƯỢNG CEFIXIM CÓ T
RONG NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC 51
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
54
píc
Diện tích pic
S
i
Diện tích pic của chuẩn nội
TB Trung
bình
CFM Cefixim
CRF Clorof
orm
DEE Diethyl
ether
CHX Cyclohe
xan
LLOQ Giới hạn định lượng dưới
ULOQ Giới hạn định lượng tr
ên
MeOH Methanol
mg Milligram
ml Mililit
PA Tinh
khiết phân tích (Pure analysis)
SĐK Số đăng kí
USP 32 Dược điển Mỹ 32 (The United States Pharmacopoeia)
UV - VIS
Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (Ultraviolet and visible
absorption Spectrophotometry)
t độ ổn định trong quá trình bảo quản mẫu 50
Bảng 3.12. Kết quả khảo sá
t độ ổn định trong giai đoạn chờ tiêm mẫu 51
Bảng 3.13. Kết quả phân tích mẫu nước thải công ty CP dược Medipla
ntex .52
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Công thức chung của cephalosporin
3
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của cefixim
6
Hình 2.1. Hóa chất, thuốc thử, chất c
huẩn, thiết bị, dụng cụ 20
Hình 3.1. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn dung môi xử lý mẫu 25
Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn lượng dung m
ôi xử lý mẫu 27
Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát quá trình xử lý mẫu với diethyl ether
Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu LOD
49
Hình 3.16. Sắc ký đồ phâ
n tích mẫu nước thải Công ty CP dược Mediplantex
53
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tình trạng kháng thuốc kháng sinh đang là một thảm họa mà con người
phải đối mặt. Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới, chỉ tính riêng năm 2010,
tình trạng vi khuẩn Klebsiella Pneumoniae kháng thuốc đã gây ra 25.000 ca tử
vong tại châu Âu. Hiện nay, ngay cả những thuốc kháng sinh thế hệ mới nhất,
chỉ dùng trong nhiễm khuẩn bệnh viện cũng đã có hiện tượng bị kháng, bằng
chứng mới đây nhất là sự lây lan của chủng vi khuẩn kháng carbapenem (ndm-1)
ở hơn 16 quốc gia trên thế giới. Tổng Giám đốc Tổ chức y tế thế giới, bà
Magaret Chan đã đưa ra lời cảnh báo về khả năng con người quay trở lại thời kỳ
trước khi thuốc kháng sinh được ra đời nếu không có một hành động toàn cầu
giải quyết vấn đề kháng thuốc đang ngày càng trầm trọng này [32,33].
Để giải quyết vấn đề kháng thuốc kháng sinh, các nghiên cứu trước đây
chỉ tập trung chú ý đến nguyên nhân do việc sử dụng thuốc không hợp lý. Ngày
nay, các nhà khoa học đã phát hiện được một nguyên nhân cũng không kém
phần quan trọng khác: đó là sự tồn dư của kháng sinh và các chất chuyển hóa của
chúng trong môi trường vì chỉ cần một dư lượng nhỏ kháng sinh thải ra môi
trường nhưng sẽ được tích lũy dần dần vào các vi khuẩn gây bệnh, giúp chúng
phát triển những gen kháng thuốc. Cũng vì lý do đó, từ những năm cuối thập kỉ
90 của thế kỷ 20, hướng nghiên cứu về dư lượng thuốc kháng sinh và những chất
chuyển hoá cũng như tác động của chúng trong môi trường được ra đời. Hiện
nay, hướng nghiên cứu này đang được quan tâm tại các nước phát triển như Mỹ,
Đức, Thuỵ Sỹ, Australia… Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các
kháng sinh và chất chuyển hoá của chúng trong môi trường nước đã trở nên phổ
có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược trong nước.
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN
1.1.1. Lịch sử ra đời, nguồn gốc
Năm
1945, Giuseppe Brotzu từ nguồn nước biển tại Cagliari (Italia) đã
phân lập được chủng nấm Cephalosporium acremonium. Dịch lọc môi trường
nuôi cấy nấm này có tác dụng ức chế sự phát triển của tụ cầu vàng
Staphylococcus aureus và có tác dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn do tụ cầu vàng
và bệnh thương hàn ở người. Từ năm 1948 đến năm 1956, Abraham và Neuton
(Anh) từ m
ôi trường nuôi cấy này (nay được gọi là Acremonium chrysogenum)
đã chiết được một hỗn hợp kháng sinh cephalosporin P
1
, cephalosporin C và
penicillin N. Năm 1971, từ chủng Norcardia, Nagarazan chiết xuất được
cephamycin cũng có cấu trúc gần với cephalosporin C.
Có nhiều cepha
3
Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic
(A7AC), mang cấu trúc
3
-cephem,
3
mới đủ liên hợp điện tử với vòng β –
lactam để hợp chất có tác dụng sinh học.
Trong A7AC, các carbon bất đối C
(6)
và C
(7)
đều có cấu hình R, và hầu
như là nguyên nhân làm cho các cephalosporin có tính hữu tuyền khá mạnh [7].
* Phân loại và phổ tác dụng
Hiện nay, cepha
losporin được phân loại thành 4 thế hệ dựa trên phổ tác
dụng. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) mạnh
hơn, nhưng trên Gram (-) yếu hơn thế hệ sau và ngược lại. Phổ chung của các thế
hệ cephalosporin được giới thiệu tại Bảng 1.1 [10].
Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các cephalosporin
Nhóm Tên đại diện Phổ tác dụng
Thế hệ I Cephalexin - Phổ tác dụng trung bình, tác dụng trên các vi khuẩn Gram
(+) như tụ cầu, liên cầu, phế cầu (trừ liên cầu kháng
methicillin).
Cephalothi
n
Cephazolin
1.1.3. Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu
Trong khuôn khổ của đề tài chúng tôi xin giới thiệu đặc tính của một số
cephalosporin được liên quan nghiên cứu trong đề tài tại Bảng 1.2
[6,7,10,15,26,29,35].
Bảng 1.2. Đặc tính của các cephalosporin liên quan nghiên cứu
Tên chất
Thế
hệ
Công thức phân tử Tính chất vật lí
1. Cefadroxil
monohydrat
I C
16
H
17
N
3
O
5
S.H
2
O - Bột màu trắng hoặc gần như trắng.
- K
hó tan trong nước, rất khó tan
trong ethanol 96%.
- Độ tan trong nước: 0,
339 g/l.
- pK
5
S
2
- Bột trắng hoặc hơi vàng.
- Tan trong dung dịch đệm phosphat
0,1M (pH = 7), ít tan trong nước,
trong alcol và diethylether.
- Độ tan trong nước: 8,87.10
-2
g/l.
- pK
a1
= 1,74; pK
a2
= 7,45
4. Cefoperazon III C
25
H
26
N
9
NaO
8
S
2
- Bột trắng hoặc hơi vàng.
- Dễ tan trong nước, tan trong
methanol, hơi tan trong ethanol
96%.
- Độ tan trong nước: 0,286 g/l.
O
+ Khối lượng phân tử: 507,5
+Tên khoa học: (6R, 7R)- 7- [[(Z)- 2- (2- aminothiazol- 4- yl)- 2- [(carboxy
methoxy) imino] acetyl] amino]- 3- ethenyl- 8- oxo- 5- thia- 1-azabicyclo [4.2.0]
oct- 2- en- 2- carboxylic trihydrat [6,15,29].
1.2.2. Tính chất lý hóa
Bột trắng hoặc gần như trắng, hơi hút ẩm. Ít tan trong nước, aceton,
glycerin, tan trong methanol, propylen glycol, hơi tan trong ethanol, thực tế
không tan trong ether, ethyl acetat và hexan, hầu như không tan trong dung dịch
sorbitol 70% và octanol. Dung dịch chứa 0,7 mg cefixim trong 1 ml nước có pH
từ 2,6 đến 4,1 [6,15,29].
Độ tan tr
ong nước: 0,104 g/l.
Hằng số pK
a1
= 3,45; pK
a2
= 2,92 [35].
1.2.3. Dược lý
Cef
ixim (CFM) là một kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, được dùng theo
đường uống.
6
CFM có độ bền vững cao với sự thủy phân của β- lactamase mã hóa bởi
gen nằm trên plasmid và chromosom. CFM có tác dụng cả in vitro và trên lâm
sàng với hầu hết các chủng của các vi khuẩn sau đây:
7
- Trong một nghiên cứu khác của Mahesh Attimarad và Anroop B Nair
năm 2011, CFM và Ofloxacin được định lượng đồng thời bằng phương pháp đạo
hàm và đạo hàm tỷ đối bậc nhất. Với phương pháp phổ đạo hàm bậc nhất, nhóm
nghiên cứu đã tìm ra bước sóng thích hợp cho định lượng CFM là 318,6 nm và
nồng độ định lượng trong khoảng từ 2-20 µg/ml [25].
1.2.5.2. Nghiên cứu định lượng cefixim bằng phương pháp HPLC
Mẫu: nguyên liệu, viên nén, hỗn dịch
- Cột: C
18
(0,125 m x 4 mm, 5 µm)
- Pha động: ACN : dung dịch tetra
butylamoni hydroxyd 0,4 M pH = 6,5
(chỉnh pH bằng dung dịch H
3
PO
4
1,5 M) (1:3)
- Detector: UV λ = 254 nm
- Tốc độ dòng: điều chỉnh c
ho thời gian lưu của cefixim khoảng 10 phút
[6,15,29].
Cũng theo một nghiên cứu khác của K. Azhagesh Raj và cộng sự năm
2010, CFM và Cefuroxim axetil trong dạng thuốc bán thành phẩm và thành
phẩm được định lượng đồng thời bằng phương pháp HPLC pha đảo với cột C-18
của Merck (100 x 4,6 mm, 5 µm). Pha động sử dụng methanol: nước (90:10).
18
(150 mm x 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ cột
50°C
o Pha động: ACN : methanol (50:50): dung dịch trifloroacetic (19:81), tốc
độ dòng 2 ml/phút
o Detector: UV λ = 285 nm
Emirhan Nemutlu và cộng sự [18]: mẫu huyết tương và nước ối
- Chiết pha rắn cột polymeric sorbent (Strata X)
- Điều kiện sắc ký:
o Cột Xterra C
18
(250 x 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 32°C
o Pha động: dung dịch đệm phosphat 40 mM pH = 3,2 và MeOH, gradient,
tốc độ dòng 0,85 ml/phút
o Detector: DAD λ = 285 nm
Joy A. McAteer và cộng sự [23]: mẫu huyết tương, định lượng đồng thời 5
cephalosporin dùng đường uống là cefixim, cephalexin, cefaclor,
cephradin, cefadroxil
- Tủa prote
in bằng ACN
- Điều kiện sắc ký:
o Cột
Altex Ultrasphere C
8
(150 x 4,6 mm, 5 µm)
o Pha động: MeOH : dung dịch đệm phosphat 12,5 mmol/l pH 2,6 = 20:80,
tốc độ dòng 2 ml/phút
o Detector: UV λ = 254 nm
Mẫu: nước bề mặt, nước ngầm, nước uống
Các quy trình định lượng CFM trong chế phẩm và huyết tương không thể áp
dụng cho định lượng CFM trong nước thải nhà máy. Trên thế giới, chúng tôi mới
chỉ tìm thấy một nghiên cứu định lượng CFM trong nước thải bệnh viện [
27].
Nghiên cứu này sử dụng phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS, xử lý mẫu
bằng chiết pha rắn. Phương pháp này cho độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện
thấp. Tuy nhiên, hệ thống LC-MS/MS và chiết pha rắn giá thành cao, hiện nay
chưa phổ biến tại Việt Nam. Trong khi đó, hệ thống HPLC-DAD và chiết lỏng -
lỏng khá thông dụng, dễ kiếm, dễ áp dụng tại Việt Nam. Vì vậy chúng tôi xây
10
dựng quy trình phân tích CFM trong nước thải nhà máy với hệ thống HPLC với
detector DAD.
1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.4.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năn
g cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của
sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của
pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố,
trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [2].
1.4.2. Nguyên tắc
Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động. Pha này là một chất lỏng
được cho qua cột chứa các hạt pha tĩnh một cách liên tục. Các chất tan là thành
phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc
vào hệ số phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển
khác nhau các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho
phân tích định tính và định lượn
M
: nồng độ mol của chất tan trong pha động.
K càng lớn, sự di chuyển của các chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu
các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách
diễn ra càng dễ dàng hơn.
* Thời gian lưu t
R
[2]
Thời gian lưu t
R
là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất
phân tích đến detector. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu
của mỗi chất là hằng định. Vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định
tính các chất.
Thời gia
n lưu phụ thuộc vào các yếu tố:
- Bản chất của pha tĩnh
- Bản chất,
thành phần, tốc độ của pha động
- Cấu tạo và bản chất phâ
n tử của chất tan
- Trong một số trường hợp c
òn phụ thuộc vào pH pha động.
* Hệ số dung lượng k’ [2]
k’ = = K.
12
W
t
W
t
N
RR
Trong đó:
W
1/2
là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh,
W
là độ rộng đáy pic.
* Độ phân giải [2
]
- Độ phân giải đánh giá khả năng tách hai chất trên sắc ký đồ cho 2 pic liền
kề.
AB
RARB
B
: Độ rộng của pic đo ở các đáy pic của chất A và chất B.
W
1/2A
, W
1/2B
: Độ rộng của pic đo ở nửa chiều cao các pic của chất
A và chất B.
Các giá trị t
RA
, t
RB
,W
A
, W
B
, W
1/2A
, W
1/2B
phải tính theo cùng đơn vị.
- Yêu cầu R
S
> 1, giá trị tối ưu R
S
= 1,5.
1.4.5. Ứng dụng của HPLC
* Định tính:
- Sự giống nha
huẩn hóa diện tích.
Trong đó phương pháp dùng c
huẩn nội là phương pháp hay được sử dụng
khi nền mẫu phức tạp, phải qua quá trình xử lý mẫu. Phương pháp này có nhiều
ưu điểm làm giảm thiểu sai số qua các quá trình khác nhau. Đây cũng là phương
pháp được sử dụng trong nghiên cứu này. Sau đây chúng tôi xin trình bày chi tiết
về phương pháp chuẩn nội dùng trong định lượng bằng HPLC.
* Phương pháp dùng chuẩn nội [1,2
]
Nguyê
n tắc: Người ta chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân tích
và trong dung dịch chuẩn đối chiếu. Tỷ số diện tích pic của chất phân tích và
chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn.
Hai yêu cầu đối với chuẩn nội là
:
- Pic của chất c
huẩn nội phải tách khỏi pic các thành phần khác (R
S
> 1,25).
- Pic của chất c
huẩn nội phải gần với pic của chất phân tích.
Ưu điểm:
Phương pháp này đáng tin cậy nhất (sai số cực tiểu khoảng 0,5 –
1,0%). Sai số do quá trình tiêm mẫu cũng được loại bỏ.
1.5. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU DƯ LƯỢNG KHÁNG
SINH CÓ TRONG NƯỚC Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI
Nghiên cứu của Dương Hồng Anh và cộng sự (2006) đã xây dựng được
phương pháp phân tíc
h sự có mặt của các kháng sinh họ Floquinolon trong nước
thải bệnh viện. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn dùng cột
nguồn nước tự nhiên tại châu Âu và Mỹ. Trong đó, điều kiện phân tích
Amoxicillin như sau: máy HPLC Agilent 1200 với 2 detector là UV-VIS và
huỳnh quang, cột C18 Phenomenex, pha động dung dịch đệm phosphat 10 mM
pH 3,0: methanol (85:15), tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; bước sóng phát hiện 230
nm. Các phương pháp này đã được ứng dụng để nghiên cứu quá trình quang
chuyển hoá của các hợp chất trê
n [20].
Nghiên cứu của Vishal Diwan và cộng sự năm 2010 đã xây dựng và đánh
giá dư lượng của 7 kháng sinh: amoxicillin, ceftriaxon, amikacin, ofloxacin,
ciprofloxacin, norfloxacin và levofloxacin trong nước thải tại một bệnh viện ở
Ujjain, Ấn Độ. Nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn và phương pháp
HPLC-MS/MS. Kết quả đã xây dựng được phương pháp với LOD từ 0,01 đến
16
Copyright: Tài liệu đại học ©