BỘYTẾ
TRƯÒTVG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
• • • •
NGUYỄN THỊ NGUYÊN
NGHIÊN CÚtJ XÂY DựNG PHƯƠNG
PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT số
• • •
CHẤT PHÂN LẬP TỪ HOA CÂY GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ
• • •
Giáo viên hưÓTig dẫn:
PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
Noi thực hiện:
Bộ môn Hóa Phân Tích
Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm
và Mỹ phẩm Hà Nội
HÀ NÔI - 2013
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài ''Nghiên cứu xây dựng
phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ hoa cây Gạo”,
tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình, chu đáo của các thầy cô, bạn bè và
gia đình. Nhờ có sự giúp đỡ quý báu đó đã giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn
chân thành tới PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu, người thầy đã trực tiếp hướng
dẫn, tạo điều kiện thuận lợi, dành nhiều thời gian và công sức giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện luận văn.
Đồng thời, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Thái An - Bộ
môn Dược Liệu, NCS. Hồ Thị Thanh Huyền và DS. Phạm Lê Minh đã luôn quan
tâm, động viên, giúp đỡ, cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Tnrờng Đại học Dược Hà
Nội, các thầy cô giáo trực tiếp tham gia giảng dạy, các anh chị kỹ thuật viên đã

1.2.2. Ergosterol peroxid 6
1.2.2.1. Nguồn gốc 6
1.2.2.2. Tính chất 6
1.2.2.3. Tác dụng 7
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC 7
1.3.1. Nguyên tắc của quá trình sắc ký 7
1.3.2. Các thông số đặc trưng trong HPLC 9
1.3.3. ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm dược liệu 12
1.3.3.1. Định tính dược liệu
12
1.3.3.2. Định lượng 12
1.4. VÀI NÉT VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỒ (LC-MS)

14
1.4.1. Khối phổ 14
1.4.1.1. Nguồn ion (lon source)
14
1.4.1.2. Thiết bị phân tích khối phổ (Mass Analyzer) 15
1.4.1.3. Detector 15
1.4.2. Một số kỹ thuật LC-MS 16
1.4.3. ứng dụng của phân tích khối phổ trong định tính các chất

16
PHẦN II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PÍĨƯƠNG PHÁP NGHIÊN C Ú tJ

17
2.1. ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIỂT B Ị 17
2.1.1. Đối tượng 17
2.1.2. Hóa chất và thiết b ị 17
2.1.2.1. Hóa chất 17

3.5. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 29
3.5.1. Khảo sát sự phù họp của hệ thống sắc ký

29
3.5.2. Khảo sát tính đặc hiệu 30
3.5.3. Khảo sát độ lặp lại 31
3.5.4. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
31
3.5.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 33
3.5.6. Khảo sát độ đúng 34
3.6. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÊ ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG
HOA GẠO 35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36
KỂTLƯẬN 36
ĐỀ XUẤT 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT
Chữ viết tắt
Chữ đầy đủ
1 ALT
Alanine transaminase
2
AST
Aspartate transaminase
3 DDVN
Dược điển Việt Nam
4
DPPH

Tín hiệu/nhiễu đưỏng nền (Signal/Noise)
17 SD
Độ lệch chuân (Standard Deviation)
18 STT
So thứ tự
19 TNF
Tumour necrosis factor
20
tR
Thời gian lưu
21
UV-VIS
Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet visible)
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Ký hiệu
Tên bảng
Trang
1
Bảng 3.1
Ket quả xác định độ ẩm bột hoa Gạo
24
2
Bảng 3.2
Ket quả khảo sát tính thích họp
29
3
Bảng 3.3
Ket quả khảo sát độ lặp lại
31

Công thức cấu tạo của aurantiamid acetat
5
3 Hình 1.3
Hình ảnh tinh thê aurantiamid acetat
5
4 Hình 1.4
Công thức cấu tạo của ergosterol peroxid
6
5
Hình 1.5
Hình ảnh tinh thế ergosterol peroxid
7
6 Hình 1.6
Mô hình cẩu tạo máy HPLC
8
7 Hình 1.7
Sơ đồ bộ tứ cực chập ba
15
8 Hình 3.1
Sắc ký đồ hỗn họp chất nghiên cứu aurantiamid acetat và
ergosterol peroxỉd
26
9
Hình 3.2
Sắc ký đồ của mẫu thử chuẩn bị tử hoa Gạo
26
10
Hình 3.3
Sắc kỷ đồ của auratiamid acetat phân lập từ hoa cây Gạo
27

trồng nhiều không chỉ đế lấy bóng mát mà còn là nguồn dược liệu quý sẵn có. Theo
kinh nghiệm dân gian, người dân đã quen thu hái nhiều bộ phận khác nhau từ cây
Gạo để phòng và chữa bệnh, trong đó hoa Gạo được sử dụng cho người thiếu máu
nhược sắc, rong kinh, đa kinh, chảy máu dạ dày, mất máu sau mổ, giúp ăn ngủ tốt,
tăng cân [4], [5], [9].
Trên thế giới, nhiều nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu hóa thực vật cũng
như thử tác dụng sinh học của hoa Gạo và cho kết quả rất đáng ngạc nhiên về tiềm
năng chữa các bệnh “thời đại” như tác dụng bảo vệ tim mạch [40], hạ huyết áp [33],
bảo vệ gan [30] ở Việt Nam, NCS. Hồ Thị Thanh Huyền là người đầu tiên nghiên
cứu toàn diện về hoa cũng như tất cả các bộ phận của cây Gạo, đã nhận biết, chiết
xuất và phân lập được một số thành phần từ hoa Gạo là aurantiamid acetat,
ergosterol peroxid. Tuy nhiên, hiện nay chưa có tài liệu nào trên thế giới cũng như
tại Việt Nam công bố hàm lượng các thành phần hoạt chất trong hoa Gạo.
Đe làm rõ hơn về hàm lượng các họfp chất phân lập được có trong hoa Gạo, đề
tài '"Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân
lập được từ hoa cây Gạo'' đã được thực hiện với mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thẩm định quy trình định tính và định lượng đồng thời
aurantiamid acetat và ergosterol peroxid trong hoa Gạo bằng phương pháp HPLC
để góp phần vào việc tiêu chuẩn hóa chất lượng vị thuốc hoa Gạo.
2. ưng dụng phươiig pháp đê sơ bộ xác định hàm lưọng aumntiamid acetat và
ergosterol peroxid trong một mẫu hoa Gạo thu hái được.
- 2 -
Hĩnh 1.1. Hình ảnh cây Gạo
PHẦN I - TỎNG QUAN
1.1. TÓNG QUAN VỀ CÂY GẠO
1.1.1. Đặc điểm thực vật
- Cây Gạo còn gọi là Gòn rừng, Gạo
rừng, Mộc miên thụ, Mạy mìn, Mạy nghịu,
Bông Gạo, Anh hùng thụ, Hồng miên, cổ
bối [8], [13],

như làm bông, nệm, gối.
1.1.4. Thành phần hóa học của hoa Gạo
- Trong hoa Gạo chứa nhiều acid amin, đường, pectin, saponin, flavonoid, tanin,
nhiều nguyên tố vi lượng [4], Theo [13] nụ hoa và đài (tính theo dược liệu tươi)
chứa protein thô theo thứ tự lần lượt là 1,38 mg% và 1,56 mg%, carbohydrat 1L95
mg% và 13,87 mg%, chất vô cơ 1,09 mg% và 1,00 mg%, Ca 92,25 mg% và 95
mg%, p 49 mg% và 41 mg%, Mg 54 mg% và 24,64 mg%.
- Từ dịch chiết methanol của hoa khô B.malaharicum, một số tác giả ở Trường
Đại học Dược Hà Nội đã phân lập được hai chất là aurantiamid acetat và ergosterol
peroxid [7].
1.1.5. Tác dụng sinh học của hoa Gạo
Kết quả của nhiều công trình nghiên cứu cho thấy hoa Gạo có nhiều tác dụng
dược lý quan trọng:
• Tác dụng chống oxy hóa
Năm 2009, bằng phương pháp dùng DPPH, peroxynitrit; Vieira và các cộng sự
đã chứng minh tác dụng chống oxy hóa của cắn methanol chiết xuất từ hoa Gạo
[41].
Năm 2011, cũng bằng phương pháp dùng DPPH, các nhà khoa học khác cũng
chỉ ra tác dụng chống oxy hóa của cắn hoa Gạo với một số hệ dung môi khác nhau
như nước, ethanol 50%, aceton 80%, n-hexan. Các kết quả nghiên cứu còn chỉ ra
rằng các cắn chiết xuất được có khả năng chống oxy hóa vượt trội hơn acid ascorbic
hay gallic [18], [42],
- 4 -
• Tác dụng bảo vệ gan
Năm 2010, Ravi V. chứng minh được cắn methanol của hoa Gạo có tác dụng cải
thiện sự nhiễm độc gan gây ra bởi các thuốc kháng lao [30],
Theo [32], cắn thu được khi chiết xuất hoa Gạo bằng methanol 70% có tác dụng
làm giảm nồng độ men gan do paracetamol gây ra trên chuột. Với liều 250 mg/kg
và 500 mg/kg trọng lượng cơ thể, mức độ giảm ALT là 26,4% và 27,8%, mức độ
giảm AST là 13,7% và 17,0%.

[39], hoặc từ vỏ cây Pỉerreodendron kerstingii, một loài thực vật thuộc họ
Simaroubaceae [35],
- Năm 2012, lần đầu tiên ở Việt Nam, một số tác giả trường Đại học Dược Hà
Nội đã phân lập được aurantiamid acetat từ hoa cây Gạo [7].
L2.L2. Tính chất
- Công thức hóa học: C2 7H28N2 O4 (M = 444).
H
Hình 1.2. Công thức cẩu tạo của aurantiamid acetat
- Tên khoa học: N-benzoyl-1-phenylalanyl-l-pheylalaninol acetate.
- Tính chất vật lý: [36]
Aurantiamid acetat là chất bột màu trắng, tinh thể
không màu, hình kim, tan tốt trong methanol, aceton,
ethyl acetat.
Nhiệt độ nóng chảy 185°C-186°C.
{C(\d ~ 63,1 . Hình 1.3. Hình ảnh tinh thể
Imax(EtOH): 206 and 227 nm. aurantiamid acetat
- 6 -
1.2.1.3. Tác dụng
- Theo Jean De Dieu Tamokou và cộng sự, aurantiamid acetat có tác dụng kháng
khuẩn, tăng tác dụng của kháng sinh, ức chế sự phát triển của một số nấm và vi
khuân như
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Salmonella typhi,
Candida albicans và Candida tropicaỉis [38], tác dụng oxi hóa và kháng khuẩn này
cũng được nhiều nghiên cứu khác đề cập tới [39].
- Theo [26], aurantiamid acetat ức chế sản xuất TNF-a và IL-2 nên có tác dụng
chống viêm, giảm tình trạng viêm trong các bệnh như viêm khớp dạng thấp, vảy
nến, lupus ban đỏ hệ thống Với liều 10 mg/kg, aurantiamid acetat có tác dụng
chống viêm trên mô hình gây viêm khóp ở chuột [20], điều này phù họp với kết quả
nghiên cứu chống viêm trong hoa Gạo đã được trình bày ở trên.
1.2.2. Ergosterol peroxid

phát triển của vi khuẩn Escherichia coli. Staphylococcus aureus, sau khi so sánh các
ống nghiệm đã được ủ ở 36°c trong vòng 18 giờ của nồng độ khác nhau của chất
này với sự phát triển của chủng vi sinh vật, sự tăng trưởng của vi sinh vật bị giảm
đáng kể [15].
=> Những tác dụng trên cũng giải thích phần nào tác dụng sinh học của hoa Gạo
đã trình bày ở phần 1.1.5.
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC [1], [3], [6], [11], [12], [23],
1.3.1. Nguyên tắc của quá trình sắc ký [1], [3], [6], [11], [12], [23],
Khái niệm HPLC
HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cở sở của sự phân tách các chất trên một
pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao.
- 8 -
sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy vào loại
pha tĩnh sử dụng.
Nguyên tẳc
Mầu phân tích được hòa tan trong pha động. Pha tĩnh được cố định trong cột
hay trên bề mặt chất rắn. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột
theo pha động vói tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động
và chất tan. Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích
với hai pha dẫn đển sự tách, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành các
dải, làm cở sở cho phân tích định tính và định lượng, sự tách này đạt được là do quá
trình phân bố, hấp phụ, trao đổi ion
Các chất sau khi được rửa giải ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện
gọi là detector. Tùy theo bản chất của các chất mà sử dụng detector thích hợp.
Detector hay được sử dụng nhất là detector uv. Đường cong rửa giải sau một quá
trình sắc ký được gọi là sắc ký đồ, có chức năng đánh giá quá trình rửa giải trong
cột có tốt hay không.
Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao như hình 1.6 bao gồm:
1-Bình chứa dung môi pha động.
2-BỘ phận khử khí.

*> Thời gian chết (ím)
Là thời gian cần thiết để rửa giải một chất không bị lưu giữ.
*t* Thời gian lưu hiệu chỉnh (I’r)
Là hiệu số giữa thòd gian lưu và thời gian chết.
t ’ R — ĨR -
- 10-
c. Hệ số dung lượng k ’(Capacity factor)
Là đại lượng đặc tmng cho tốc độ di chuyển của một chất qua cột.
ýt'= _Ị_rJz1ềl
Qm
trong đó; Qs, Qm là lượng chất tan trong pha tĩnh, pha động.
Vs,Vm là thể tích pha tĩnh, pha động.
- Neu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và khả năng tách kém.
- Nếu k’ lớn thì pic bị doãng, độ nhạy kém.
- Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 1< k’< 8 là tốt hơn cả.
d. Hệ số chọn lọc ịa) (Selective factor)
Là đại lượng đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất.
^ ~^m
A O r ) A ~ ^ M
Qui ước: B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên a > 1.
a càng lớn, khả năng tách càng cao, 2;iá trị tối ưu là 1,5-2.
e. Độ phân giải (Rs) (Resolution)
Là đại lượng đăc trưng cho mức độ tách của hai chất ra khỏi nhau trên cùng một
điều kiện sắc ký;
~ ^ RA ) _ ~^Rạ )
trong đó:
+ ÍRA írb: thời gian lưu của 2 pic liền kề của 2 chất tan A và B (phút).
+ Wa, Wb: độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B (phút).
+ Wi/2A, Wi/2b’. độ rộng đáy pic ở nửa chiều cao pic của chất A và B (phút).
+ Các giá trị ÍRA, tRB Wa, Wb Wi/2 a, W]/2b phải tính theo cùng một đơn vị.

1.3.3. ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm dưọ’c liệu
13.3.1. Định tính dược liệu [1], [2], [6]
Dựa vào sắc ký đồ của dung dich thử và dung dịch chuẩn
- So sánh thời gian lưu, kết quả định tính sẽ dưcmg tính khi thời gian lưu ÍR của
các đỉnh quan tâm trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu đối chiểu phủ họp với nhau
khi tiến hành HPLC phân tích trong cùng điều kiện.
- Nếu chỉ dựa vào thời gian lưu để khằng định kết quả dưofng tính, nên tiến hành
sắc ký trên ít nhất hai điều kiện khác nhau.
- So sánh phổ (chồng phổ) UV-VIS của chất thử với chất chuẩn trên detector
DAD.
- Ngoài ra có thể kết nối HPLC - phổ IR hoặc HPLC - MS định tính dựa vào
nhóm chức (IR) hoặc số khối (MS).
- Để kết luận dương tính, kết quả phân tích HPLC của một dược liệu phải cho
thấy nó chứa các hoạt chất hay chất đánh dấu trong thành phần, khi so sánh với kết
quả HPLC trong cùng điều kiện thực nghiệm của các chất chuẩn hoạt chất hay các
chất đánh dấu tương ứng.
13.3.2. Định lượng [2]
- Tất cả các phương pháp định lượng bằng HPLC đều dựa trên nguyên tắc: nồng
độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
- Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng trong sắc ký là;
• Phương pháp chuẩn ngoại.
• Phương pháp chuẩn nội.
• Phương pháp thêm chuẩn.
• Phưong pháp chuẩn hóa diện tích.
- Trong khuôn khổ của luận văn này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp
chuẩn ngoại.
Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều
được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic
- 1 3 -
của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của

phân tích khối phổ, phương pháp được hiểu là hỗn họp chất phân tích sau khi tách
ra khỏi cột sẽ đi qua một đường truyền đến đầu dò khối phổ. Cột sắc ký lỏng cho
phép tách chất cần quan tâm, khối phổ cho phép tách ion cần quan tâm và cho biết
phân tử lượng của chất phân tích. Một hệ thống LC- MS sẽ phân mảnh ion mẹ thành
các ion con và tách các ion con để định danh và định lượng.
- Một hệ LC- MS cơ bản gồm: hệ thống bơm sắc ký lỏng, bộ phận tiêm mẫu, cột
sắc ký, đầu dò khối phổ.
1.4.1. Khối phổ
- Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của
các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng
và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích
của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành này được tách theo
tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân
tử của hợp chất.
- Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị
phân tích và detector. Trước hết, các mẫu được ion hóa trong nguồn ion, sau đó đưa
vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín hiệu thu được sẽ
chuyển vào máy tính để xử lý và lưu trữ.
1.4.1.1. Nguồn ion (lon source)
- Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển
thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử.
- Một số kĩ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như;
+ lon hóa phun điện tử (electrospray ionization - ESI).
+ lon hóa hóa học ở áp suất Idií quyển (atmospheric-pressure chemical ionization -
APCI).
+ lon hóa bắn phá nguyên tử nhanh (fast-atom bombardment - FAB).
- 15 -
I.4.I.2. Thiết bị phân tích khối phổ (Mass Analyzer)
Tách các ion theo tỷ số m/z. Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của
từ trường, điện trường để đi đến detector. Có thể phân bộ phân tích khối thành 4

cách sử dụng năng lượng bẻ gãy, tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở chế độ
phân tích MS lần 2. Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ
nhạy do làm giảm nhiễu đường nền rất đáng kể.
Trong nghiên cứu này, tôi sử dụng kỹ thuật MS/MS để định tính aurantiamid
acetat và ergosterol peroxid có trong hoa cây Gạo.
1.4.3. ứng dụng của phân tích khối phổ trong định tính các chất
- Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử (M
+1)'^, (M+2)’^. Đây là đặc trưng quan trọng của hợp chất hóa học. Bên cạnh đó, xem
xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của chúng cùng với khối lượng của vài
mảnh ion có thể xác định được công thức nguyên của chất phân tích.
- Trong phân tích Dược, thường sử dụng kết nối GC-MS hoặc LC-MS. Có thể so
sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ nghiên cứu với chất
đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu.
- 1 7 -
PHÀN II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ
2.1.1. Đối tượng
Mầu nghiên cứu là hoa của cây Gạo (được làm khô tự nhiên) thu hái tại Hương
Sơn (Mỹ Đức, Hà Nội) và đã được TS. Trần Huy Thái (Viện sinh thái và tài nguyên
sinh học) giám định tên khoa học là: Bombax malabaricum DC, họ Gạo.
(Bombacaceae).
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
- Dung môi loại dùng cho HPLC (Merck, Đức); Methanol, Acetonitril.
- Nước cất hai lần được lọc qua máy lọc.
- Các hợp chất đã phân lập được từ hoa Gạo là aurantiamid acetat và ergosterol
peroxid đã được tinh chế và nhận dạng cấu trúc bằng các phương pháp phổ MS và
NMR.
2.1.2.2. Thiết bị