BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHAN THỊ THANH MAI
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT
PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
PHAN THỊ THANH MAI
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT
PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ
những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi tận tình
trong quá trình học tập, nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2014
Phan Thị Thanh Mai
MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CỎ SEO GÀ 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật 2
1.1.2. Thành phần hóa học 2
1.1.3. Tác dụng dược lý 4
1.1.4. Công dụng 5
1.2. MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ 5
1.2.1. Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid 5
1.2.2. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid 6
1.2.3. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-
D-glucopyranosid] 7
1.2.4. 3,4-dihydroxybenzandehyd 8
1.2.5. Kaempferitrin 9
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 11
1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao 11
3.4.2. Độ lặp lại của phương pháp 35
3.4.3. Khoảng nồng độ tuyến tính 37
3.4.4. Độ đúng 41
3.4.5. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 44
3.5. SƠ BỘ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CỎ
SEO GÀ 45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47
KẾT LUẬN 47
ĐỀ XUẤT 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
AEPM: Dịch chiết Cỏ seo gà (aqueous extracts of P.multifida Poiret)
DAD: Detector mảng diod (Diod Array Detector)
DMSO: Dimethyl sulfoxid
HDL – Cholesterol: Lipoprotein tỷ trọng cao mang Cholesterol (High Density
Lipoprotein Cholesterol)
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid
Chromatographic)
HPLC – MS: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High-Performance
Liquid Chromatographic – Mass Spectrometry)
IR: Quang phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)
LDL – Cholesterol: Lipoprotein tỷ trọng thấp mang Cholesterol (Low Density
Lipoprotein Cholesterol)
LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Qualification)
NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)
RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM15
37
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM9
37
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM3
38
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM12
38
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM18
39
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM15
40
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM9
40
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng với PM3
41
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ đúng với PM12
42
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ đúng với PM18
42
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng với PM15
43
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ đúng với PM9
43
Bảng 3.20. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 5 hợp chất phân
tích
44
Bảng 3.21. Kết quả khảo sát LOD và LOQ (g/mL)
44
Bảng 3.22. Kết quả xác định nồng độ chất phân tích trong các dung
30
Hình 3.9. SKĐ của hợp chất PM15 phân lập được từ Cỏ seo gà
31
Hình 3.10. SKĐ của hợp chất PM9 phân lập được từ Cỏ seo gà
31
Hình 3.11. Kết quả so sánh phổ DAD của pic tương ứng với thời gian
lưu của chuẩn và thử PM3
32
Hình 3.12. Kết quả chồng phổ DAD của pic một số chất nghiên cứu
trên sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn và của mẫu thử
32
Hình 3.13. SKĐ của mẫu trắng
34
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, trên thế giới, nhu cầu về dược liệu, thuốc y học cổ truyền và hoạt
chất chiết xuất từ dược liệu có xu hướng ngày càng tăng, nhất là ở các nước đang
phát triển. Nền y học cổ truyền của nước ta có một lịch sử phát triển lâu đời và
phong phú. Từ xa xưa ông cha ta đã biết sử dụng nguồn dược liệu quý để phòng
bệnh và chữa bệnh. Trải qua hàng ngàn năm lịch sử, từ những kinh nghiệm do nhu
cầu của thực tiễn, số lượng cây, con được đưa vào làm thuốc ngày càng tăng.
Cỏ seo gà, còn được gọi là Phượng vĩ, Phượng vĩ thảo, Cỏ luồng có tên khoa
học là Pteris multifida Poir., họ Seo gà (Pteridaceae). Theo y học cổ truyền, Seo gà
có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính lạnh, có tác dụng thanh nhiệt, lương huyết, lợi thấp,
chỉ lỵ được dùng chữa kiết lỵ mạn tính, lỵ trực khuẩn, viêm ruột, viêm đường tiết
gân lá rõ, có hai loại: lá không sinh sản ngắn, màu lục nhạt hơi vàng, các thùy to
nhỏ không đều mọc đối nhau, mép hơi khía răng, có đầu tròn, riêng thùy tận cùng
thuôn dài thành mũi nhọn; lá sinh sản dài, màu đen sẫm gồm các thùy hình dải
thuôn uốn éo, mọc đối, đầu nhọn hoắt, mép lá gập lại mang túi bào tử dày đặc ở
trong; cuống lá rất dài, màu nâu nhạt ở gốc, hơi vàng ở phía trên [3].
Bào tử hình bốn cạnh, hơi tròn, màu vàng nhạt, có nhiều u sần nhỏ [3].
Mùa sinh sản: tháng 5 – 10 [3].
Cỏ seo gà mọc phổ biến ở miền Bắc và miền Trung nước ta, thường gặp nhất
ở trên những vách đá, vách đất, xung quanh thành giếng, ven đường đi, những nơi
thoáng ẩm và mát. Còn thấy mọc cả ở Trung Quốc, Nhật Bản [5].
Bộ phận dùng làm thuốc của cây là thân rễ và lá [5].
1.1.2. Thành phần hóa học
Năm 1996, từ Pteris multifida Poir. (Polypodiaceae), Woerdenbag HJ và cộng
sự đã phân lập bằng sắc ký cột silica gel thu được 2 hợp chất diterpen là: entkauran-
2β, 16α-diol và ent-kaur-16-en-2β, 15α-diol. Cả 2 chất này đều có tác dụng gây độc
với tế bào u báng Ehrlich [37].
Năm 2006, Hao-Bin Hu, Xu-Dong Zheng và Hong Cao đã phân lập được 2
hợp chất xanthon glycosid mới là 1-hydroxy-4,7-dimethoxy-8-(3-methyl-2-
butenyl)-6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-[β-D-glucopyranosyl-(13)]-β-
3
Dglucopyranosylxanthon và 1,3-dihydroxy-7-methoxy-8-(3-methyl-2-butenyl)-6-O-
α-L-rhamnopyranosyl-(12)-[β-D-glucopyranosyl-(13)]-β-D-
glucopyranosylxanthon cùng với 6 hợp chất khác là quercetin,
dehydrogoniothalamin, vanillin, dihydroechioidinin, saucerneol D, licoagrochalcon
D [20].
Năm 2008, Xu-dong Zheng, Hao-bin Hu, Huai-sheng Hu đã phân lập được
hợp chất neolignan glycosid mới là Multifidosid A: rel-(7S,8S)-Δ7'-2,9'-Dihydroxy-
5'-methoxy-7,3'-dioxy-8,4'-neolignan-4-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-
glucopyranosid và 4 chất khác là scaphopetalon, (−)-isolariciresinol 3α-O-β-
và multifidosid B được chứng minh có tác dụng ức chế đáng kể đối với tế bào
HepG2 (ung thư biểu mô tế bào gan) và K562 (ung thư máu). Từ kết quả của nghiên
cứu này, có thể sử dụng Pteris multifida như thuốc dân gian để điều trị ung thư [38].
Harinantenaina L, Matsunami K, Otsuka H. (2009) nghiên cứu in vitro đưa ra
kết luận: dịch chiết P. multifida Poiret có tác dụng chống oxy hóa thể hiện ở khả
năng thu dọn các gốc tự do như: anion superoxid, 2,2'-azinobis (3
ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid); tạo phức chelat với các ion kim loại chuyển
tiếp (Fe
2+
, Cu
2+
); chống lại sự kích thích của FeCl
2
/H
2
O
2
lên quá trình peroxyd
hóa acid linoleic, phá vỡ phản ứng dây chuyền của sự peroxyd hóa lipid nên có tác
dụng chống peroxyd hóa lipid [21].
Năm 2010, Wang TC, Lin CC, Lee HI, Yang C, Yang CC đã phát hiện Cỏ seo
gà có tác dụng làm hạ lipid máu trên chuột ăn chế độ giàu cholesterol: giảm
triglycerid, LDL-Cholesterol và tỷ lệ LDL-Cholesterol/HDL-Cholesterol huyết
tương, giảm cholesterol, triglycerid gan; đồng thời có tác dụng tăng đào thải lipid và
các sản phẩm chuyển hóa qua đường tiêu hóa [35].
Theo Kuang-Ping Lan và cộng sự (2011), dịch chiết P. multifida Poiret
(AEPM) có tác dụng thu dọn các gốc tự do α-diphenyl-β-picrylhydrazyl, hydroxyl,
Fe
2+
và khả năng khử mạnh. Các chất chống oxy hóa trong AEPM bao gồm acid
6
Công thức phân tử: C
12
H
16
O
8
(M = 288,26 g/mol) [12].
1.2.1.1 Tính chất vật lý
Dầu màu nâu sẫm [30], IR ν
max
KBr
: 3350, 1650, 1620, 1260, 890, 705 cm
-1
[30],
[α]
D
= -50,0
o
(c = 0.36, CH
3
OH–H
2
O (5 giọt), 5 ml) [29].
1.2.1.2. Nguồn gốc
Theo [30], từ 10 kg lá Abies koreana (Pinaceae) phân lập được 54,6 mg
Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid.
Năm 2013, Djimtombaye BJ và cộng sự đã phân lập được Maltol-3-O-β-D-
glucopyranosid từ toàn cây Astragalus halicacabus [9].
7
1.2.2.2. Nguồn gốc
Năm 1997, Mohamed Sharaf và cộng sự đã chiết xuất và phân lập được
Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid từ một số loài
thuộc chi Cleome: Cleome amplyocarpa Barr. and Murb., C. brachycarpa Vahl., C.
chrysantha Decne., C. droserifolia (Forssk.) Del. [27].
Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid còn được
tìm thấy ở trong cây Chenopodium murale [10].
Năm 2007, từ 8,1 kg toàn bộ cây tươi Sword Brake fern (Pteris ensiformis
Burm.) phân lập được 30,0 mg Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-
glucopyranosid với hàm lượng 2,62 ± 0,02 mg/g khối lượng cắn [43].
1.2.2.3. Tác dụng dược lý
Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid có tác dụng
thu dọn các gốc cation tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và ABTS
.
+
(ABTS là 2,2
’
-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic acid) [43].
1.2.2.4. Phương pháp định lượng
HPLC với cột TSK-GEL ODS-80TM (4,6mm×250 mm); pha động: methanol
và nước với tỷ lệ methanol ban đầu là 20%, tăng tuyến tính đến 40% trong 20 phút
và tăng đến 60% trong 5 phút; tốc độ dòng: 1 mL/phút; bước sóng 297 nm [43].
1.2.3. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β-
D-glucopyranosid]
Tên khoa học: Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-
.+
(ABTS là 2,2
’
-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic
acid) [43].
1.2.3.4. Phương pháp định lượng
HPLC với cột TSK-GEL ODS-80TM (4,6mm× 250 mm); pha động: Methanol
và nước với tỷ lệ methanol ban đầu là 20%, tăng tuyến tính đến 40% trong 20 phút
và tăng đến 60% trong 5 phút; tốc độ dòng: 1 mL/phút; bước sóng 297 nm [43].
1.2.4. 3,4-dihydroxybenzandehyd
OH
OH
H
O
1
2
3
4
5
6
Tên khoa học: 3,4-dihydroxybenzandehyde.
Công thức phân tử: C
7
H
6
O
3
(M = 138,12 g/mol).
1.2.4.1. Tính chất vật lý
O
2
.
3,4-dihydroxybenzandehyd có tác dụng thu dọn gốc DPPH (1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl), hydroxyl, ROS nội bào. Nó cũng tạo phức chelat với Fe
2+
[11].
1.2.5. Kaempferitrin
Tên khoa học: Kaempferol-3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside.
Công thức phân tử: C
27
H
30
O
14
(M = 578,53 g/mol) [13].
1.2.5.1. Tính chất vật lý:
Tinh thể hình kim sáng bóng màu vàng nhạt [19].
Tan trong ethanol hoặc DMSO, t
o
nc
: 201-203
o
C [13].
10
1.2.5.2. Nguồn gốc
Kaempferitrin được chiết xuất từ lá Hedyotis verticillata [6].
Năm 2006, Kaempferitrin được chiết xuất từ Celastrus orbiculatus, C.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng dưới áp suất cao. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân
bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với
pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các
yếu tố đó. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được ghi
lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu thành SKĐ với các thông tin về pic của
chất phân tích.
Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc ký
khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc
ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [1].
1.3.2. Máy HPLC
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động,
bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ tiêm mẫu để đưa mẫu vào
pha động, cột sắc ký, detector, máy tính hay máy phân tích hoặc máy ghi. Thải
Hình 1.1. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC.
Hệ thống cấp
dung môi
Bơm
Bộ phận
Hệ số k
’
mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích qua cột. Hệ số k
’
còn được
gọi là hệ số phân bố khối lượng giữa hai pha:
'
S S S
RM
M M M M
C V V
tt
kK
C V V t
Trong đó: V
S
: thể tích pha tĩnh
V
M
: thể tích pha động
C
S
: nồng độ pha tĩnh
C
M
Trong đó: R
S
: độ phân giải
13
(t
R
)
A
, (t
R
)
B
: thời gian lưu chất A, B
W
A
, W
B
: lần lượt là độ rộng pic A, B ở các đáy pic
W
1/2A
, W
1/2B
: lần lượt là độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
R
S
Trong đó : W là chiều rộng pic ở đáy pic
W
1/2
là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic
1.3.4. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC
1.3.4.1. Định tính [1]
Người ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau:
So sánh thời gian lưu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời gian lưu
của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký.
So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã thêm
chuẩn đối chiếu.
So sánh phổ (chồng phổ) UV-VIS của chất thử với chất chuẩn trên detector DAD
(có hệ số match 0,995).
Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm chức
(IR) hoặc số khối (MS).
1.3.4.2. Định lượng [2]
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng
độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký:
14
Phương pháp chuẩn ngoại
Phương pháp chuẩn nội
Phương pháp thêm chuẩn
Phương pháp chuẩn hóa diện tích
Trong khuôn khổ của khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp
chuẩn ngoại.
Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều
được tiến hành trong cùng điều kiện. So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu
Chuẩn hóa nhiều điểm
Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến
hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm
chuẩn. Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H)
pic với nồng độ của chất chuẩn (C). Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để
tính toán nồng độ của chất cần xác định. Có thể tính theo 2 cách:
Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy
ra được nồng độ của nó.
15
Xây dựng đường hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều
cao) pic với nồng độ chất cần xác định.
S = a C + b
S: Diện tích pic
a: Độ dốc của đường chuẩn
b: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung
C: Nồng độ của chất thử
Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ chất thử:
Sb
C
a
Chú ý: Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu thử phải nằm trong đoạn
tuyến tính của đường chuẩn.
1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector)
Detector mảng diod (DAD) là một loại detector hấp thụ UV – VIS, được dùng
phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV – VIS (trong khoảng 190
– 800 nm) của các chất phân tích. Tế bào đo ở trong detector là một ống hình trụ
Copyright: Tài liệu đại học ©