P

NG
H
P
HÁ
P
S
ỐTR
Ư
H
IÊN
C
P
XÁ
C
Ố
CH
Ấ
KHÓA
L

Ư
ỜNG Đ
KIỀU
C
ỨU

ỐT N
G

H
À NỘI
TẾ
C
DƯỢ
C
ZX

ÍCH H
U
Y
DỰ
N
À
M
L
L
ẬP
Đ
Y
GẠ
O
G
HIỆP
D
- 2013
C

G
M
ỘT
Ừ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
WY  ZX
KIỀU THỊ BÍCH HUỆ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG
PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT
SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ
LÁ CÂY GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
Nơi thực hiện:
1. Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ
phẩm Hà Nội
2. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất Đại
học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2013

ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN………………………………………….………
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY GẠO……………………………………………
1.1.1. Đặc điểm thực vật……………………………………….…………
1.1.2. Tính vị và công năng của cây Gạo…………………………………
1.1.3. Bộ phận sử dụng…………………………………………………
1.1.4. Thành phần hóa học………………………………………………
1.2. TỔNG QUAN VỀ LÁ CÂY GẠO………………………………………….
1.2.1. Daucosterol………………………………………………………
1.2.2. Stigmasterol………………………………………………………
1.2.3. Mangiferin…………………………………………………… …
1.2.4. Lupeol……………………………………………………………
1.2.5. Taraxeryl acetat…………………………………………………….
1.2.6. Taraxerol…………………………………………………….……
1.2.7. 7α-hydroxysitosterol………………………………………… …
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO (HPLC)……………………………………………………
1.3.1. Nguyên tắc của HPLC……………………………………………
1.3.2. Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký………………………
1
2
2
2
2
3
3
4
4
5
6

3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ………………………………………
3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CỨU….
12
14
14
14
16
17
18
18
18
18
18
19
19
19
20
21
21
23
24
24
24
24
24
27
3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT TRÊN SẮC KÝ ĐỒ………………………
3.5. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT
TRONG LÁ CÂY GẠO BẰNG HPLC……………………………………
3.5.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký…………………… ….

46
46

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ESI:
ion hóa bằng phun điện từ (Electronspray ionization)
GC-MS:
Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas chromatography–mass spectrometry)
HO-1:
Heme oxygenase – 1
HPLC:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HUVEC:
Tế bào thuộc màng trong ống dây rốn (Human umbilical vein
endothelial cell)
LC-MS:
Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography – Mass
Spectrometry)
LOD:
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ:
Giới hạn định lượng (Limit of Qualification)
MeCN:
Acetonitril
MeOH:
Methanol
MS:

Hình 3.2. SKĐ của dịch chiết toàn phần lá cây Gạo…………………………
26
Hình 3.3. SKĐ của hợp chất mangiferin phân lập được từ lá Gạo ……………
27
Hình 3.4. SKĐ của hợp chất daucosterol phân lập được từ lá Gạo……………
28
Hình 3.5. SKĐ của hợp chất 7α-hydroxysitosterol phân lập được từ lá Gạo….
28
Hình 3.6. SKĐ của hợp chất lupeol phân lập được từ lá Gạo…………………
28
Hình 3.7. SKĐ của hợp chất taraxeryl acetat phân lập được từ lá Gạo…… …
29
Hình 3.8. SKĐ của hợp chất stigmasterol phân lập được từ lá Gạo…………
29
Hình 3.9. SKĐ của hợp chất taraxerol phân lập được từ lá Gạo………………
29
Hình 3.10. Phổ khối lượng ứng với pic của mangiferin trên
SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……………………

30
Hình 3.11. Phổ khối lượng ứng với pic của daucosterol trên
SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……………… ……

30
Hình 3.12. Phổ khối lượng ứng với pic của 7α-hydroxysitosterol trên
SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……………… …….

31
Hình 3.13. Phổ khối lượng ứng với pic của lupeol trên
SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……………… …….


36
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của lupeol……………
36
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của taraxeryl acetat….
37
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của stigmasterol……
38
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của taraxerol………
38
Bảng 3.11. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 7 hợp chất………………
39
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng với mangiferin………………………….
39
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng với daucosterol…………………………
40
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng với 7α-hydroxysitosterol………………
40
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng với lupeol………………………………
40
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ đúng với taraxeryl acetat……………………
41
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ đúng với stigmasterol………………………
41
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng với taraxerol……………………………
41
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát LOD và LOQ (µg/ml) ………………………….
42
Bảng 3.20. Kết quả xác định hàm lượng từng chất trong
mẫu dược liệu nghiên cứu…………………………………………


-
hydroxysitosterol, daucosterol, mangiferin, lupeol, stigmasterol,
taraxerol và taraxeryl acetat có trong một mẫu lá cây Gạo thu hái được.

- 2 -

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY GẠO
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Tên khoa học: Bombax malabaricum DC., họ Gạo (Bombacaceae).
Tên đồng nghĩa: Bombax ceiba L., Gossampinus malabarica (DC.) Merr.,
Salmalia malabarica (DC.) Schott et Endl, Bombax heptaphylla Cavl.
Tên khác: Gòn rừng, Mộc miên thụ, Mạy mìn, Mạy nghịu (Tày).
Cây gỗ to, cao tới 15m hay hơn. Thân có gai hình chùy và có bạnh vè ở gốc.
Cành mọc ngang với những gai hình nón; cành non dày, không gai. Lá mọc so le,
kép chân vịt, gồm 5-7 lá chét, hình mác hoặc hình trứng, gốc thuôn, đầu nhọn, dài
9-15 cm, rộng 4-5 cm, hai mặt nhẵn, mép nguyên, cuống chung dài hơn phiến lá,
dài từ 20-25cm.
Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm, màu đỏ, nở trước khi cây ra lá từ
tháng 1 tới tháng 3, cuống hoa ngắn, nhỏ, khỏe. Hoa to, đều, lưỡng tính. Đài dầy,
hình chuông, có 5 răng tù và ngắn màu nâu xám, bao bọc lấy nụ hoa, khi hoa nở thì
rách ra thành 3-5 mảng không đều. Tràng 5 cánh nạc, rời nhau, mặt ngoài phủ lông
nhung. Nhị rất nhiều hợp thành 5 bó hoặc 6 bó (không thành ống), ngắn hơn cánh
hoa, bó nằm trong 2 cuống cánh khác nhau. Bầu thượng 5 ô, một vòi mang 5 đầu
nhụy, bầu hình nón, có lông màu trắng nhạt. Mùa hoa tháng 2 – 3, mùa quả tháng 5
– 7 [6], [7], [11], [15], [20].
1.1.2. Tính vị và công năng của cây Gạo
- Hoa Gạo có vị ngọt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, tiêu viêm,
thu liễm [5].

được Shamimin và Mangiferin [23], [44].
Trong khóa luận dược sỹ của Trần Thị Điểm Anh, đã kiểm tra định tính các
chất trong vỏ thân và kết quả cho thấy thành phần có courmarin, flavonoid, alkaloid,
saponin [3]. Mặt khác, một số nhà khoa học trên thế giới đã phân lập được các chất
Lupeol, Shamimicin từ vỏ thân cây Gạo [25], [45].
Theo Võ Văn Chi, hạt Gạo chứa chất béo, tinh dầu [6].
- 4 -

Trong tài liệu “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, nhựa gôm cây Gạo
có chứa acid catechutanic [15].
Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập và xác định được cấu trúc các
thành phần hóa học của cây Gạo là: Lupeol, Friedenin, Epicatechin, Sphingerin,
Daucosterol, Stigmasterol, Mangiferin, Taraxeryl acetat, Taraxerol, 7α-
hydroxysitosterol, Ergosterol peroxide, Aurantiamid acetat, Octadeca-9,12-dienoic.
1.2. TỔNG QUAN VỀ LÁ CÂY GẠO
Năm 1999, Faizi S. và Ali M. đã phân lập được shamimin – một flavonol C-
glycoside mới có dạng bột màu vàng nhạt từ dịch chiết ethanol của lá B.malabarium
DC. có cấu trúc 2-(2,4,5-trihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-6-C-
glucopyranosylosy-4H-1-benzopyran-4-ori) [28].
Năm 2011 và 2012, từ dịch chiết methanol của lá khô B.malabaricum DC.,
NCS. Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập được 7 chất là Daucosterol,
Stigmasterol, Mangiferin, Lupeol, Taraxeryl acetat, Taraxerol, 7α-
hydroxysitosterol.
1.2.1. Daucosterol
1.2.1.1. Nguồn gốc
Năm 2012, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập được Daucosterol
từ vỏ thân và lá cây gạo [12].
Theo [40], từ 492,2g dược liệu khô cây Arctotis arctotoides có thể phân lập
được 120mg Daucosterol.
Theo [53], Daucosterol còn có trong rễ, thân, lá cây Plumbago zeylanica L.

việc làm tăng hoạt tính của tế bào CD4 và Th1 tại chuột, qua đó làm giảm sinh
trưởng của tế bào nấm men Candida albicans.
1.2.2. Stigmasterol
1.2.2.1. Nguồn gốc
Stigmasterol được tìm thấy trong vỏ thân và lá cây Gạo [13], ngoài ra
Stigmasterol còn được tìm thấy trong đậu nành bằng phương pháp HPLC [35].
Theo [41], từ 492,2g dược liệu khô cây Arctotis arctotoides có thể phân lập
được 30mg Stigmasterol.
Theo [49], nghiên cứu đã phân lập được 65mg Stigmasterol từ 10g lá cây
Rubus suavissimus, họ Rosoideae.
- 6 -

1.2.2.2. Tính chất
- Công thức phân tử: C
29
H
48
O (M = 412,69 g/mol).

- Tên khoa học: (24S)-24-ethylcholesta-5,22-dien-3β-ol.
- Tính chất vật lý: Chất bột kết tinh màu trắng, t°
nc
= 170°C, tan trong các
dung môi hữu cơ thông thường, rất dễ tan trong benzen, ethyl ether, ethanol, không
tan trong nước, λmax = 257 nm, [α]
D
22
= −51°C (C = 2, cloroform) [24].
1.2.2.3. Tác dụng và công dụng
- Theo Richard E và cộng sự [43], Phytosterols có tác dụng làm giảm

nhẹ [4]; hơi tan trong hỗn hợp aceton – nước (1 : 1), tan trong cồn metylic, cồn
etylic, thực tế không tan trong nước lạnh, cloroform [9]; t°
nc
= 258 - 261°C; phổ tử
ngoại của dung dịch chế phẩm 0,001% trong methanol, trong khoảng 220 – 400 nm
phải có hấp thụ cực đại ở các bước sóng 241±2 nm, 258±2nm, 316±2 nm, 366±2
nm [4].
1.2.3.3. Tác dụng và công dụng
- Mangiferin có tác dụng kháng virus đối với nhóm Herpes, cho hiệu lực ức
chế trên giai đoạn đầu quá trình tái sinh virus Herpes [51].
- Mangiferin có tác dụng kích thích miễn dịch trên cả 2 loại miễn dịch thể
dịch và miễn dịch tế bào [10].
- Ngoài ra, những nghiên cứu mới đây còn cho thấy mangiferin có tác dụng
hạ đường huyết do làm tăng độ nhạy cảm của mô tế bào đích với insulin và ức chế
thoái giáng tế bào glycogen ở gan [47].
1.2.4. Lupeol
1.2.4.1. Nguồn gốc
- Lupeol được tìm thấy trong các loại rau như bắp cải trắng, hạt tiêu, cà
chua; trong trái cây như ô liu, quả sung, xoài và trong cây thuốc như Bombax ceiba,
Tamarindus indica, Sebastiania adenophora… với hàm lượng rất khác nhau: quả ô
liu chứa 3µg/g quả, lá lô hội chứa 2803µg/g lá khô… [39].
- Năm 2012, Phùng Thị Hồng đã phân lập được lupeol từ vỏ thân cây Gạo
- 8 -

với hàm lượng khoảng 20mg trong 700g vỏ thân khô [13].
1.2.4.2. Tính chất
- Công thức phân tử: C
30
H
50

- Tên khoa học: D-Friedoolean-14-en-3β-yl acetate.
- Tính chất vật lý: t°
nc
= 303-305°C; [α]
D
= +10,5° (C = 1,8, cloroform)
[54].
1.2.5.3. Tác dụng và công dụng
- Tác dụng điều trị ung thư dạ dày do làm chậm quá trình phát triển của tế
bào ung thư dạ dày AGS [52].
1.2.6. Taraxerol
1.2.6.1. Nguồn gốc
- Ngoài xuất hiện trong lá cây Gạo, Taraxerol còn được tìm thấy trong vỏ
cây Cupania dentata (họ Sapindaceae) với 52,2 mg khi tiến hành chiết và phân lập
982g dược liệu khô [30].
1.2.6.2. Tính chất
- Công thức phân tử: C
30
H
50
O (M = 426,72 g/mol).

- Tên khoa học: D-Friedoolean-14-en-3-ol.
- Tính chất vật lý: tinh thể màu trắng, tan trong benzene, chloroform, ether;
ít tan trong rượu; t°
nc
= 279 - 280°C; [α]
D
= +2,9 (C = 0,490, cloroform) [30].
- 10 -

chung và 7α-hydroxysitosterol nói riêng đều được đánh giá là hiệu quả trên Heme
oxygenase – 1 (HO-1) – một enzym được xem như là có tác dụng ngăn cản sự ly
giải heme thành carbon monoxid và sắt tự do, giúp tăng sự tác động của HO-1 trên
dòng tế bào HepG2.
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Nguyên tắc của HPLC
HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột
chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của
chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và
- 11 -

pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố trên. Các
chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được ghi lại nhờ máy ghi
và bộ phận xử lý số liệu thành SKĐ với các thông tin về pic của chất phân tích. Quá
trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng
biệt được tách ra trên sắc đồ.
Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc
ký khác nhau: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ,
sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học. Trong đó sắc ký lỏng phân bố được
sử dụng rộng rãi nhất hiện nay [1], [16].
1.3.2. Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký [1]
1.3.2.1. Thời gian lưu (t
R
)
Thời gian lưu t
R
là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất
phân tích đến detector. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của
mỗi chất là hằng định, vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các
chất.

trong đó: V
S
: thể tích pha tĩnh
V
M
: thể tích pha động
C
S
: nồng độ pha tĩnh
C
M
: nồng độ pha động
k' phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất 2 pha phân tích, dựa vào
hệ số V
S
/V
M
.
- 12 -

Thường chọn k’= 1-5.
1.3.2.3. Số đĩa lý thuyết
Mỗi cột sắc ký có thể phân thành nhiều lớp mỏng xếp sát nhau gọi là đĩa lý
thuyết. Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa
pha tĩnh và pha động. Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc
ký.
 


 



























R
S
: độ phân giải
(t

- Phương pháp chuẩn ngoại
- Phương pháp chuẩn nội
- Phương pháp thêm chuẩn
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích
Trong khuôn khổ của khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp
chuẩn ngoại.
Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều
được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic
của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của
các chất trong mẫu thử.
Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc chuẩn hóa nhiều điểm:
 Chuẩn hóa một điểm
Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ
của mẫu thử theo công thức:
C
x
= 






C
x
: Nồng độ mẫu thử.
C
S
: Nồng độ mẫu chuẩn.
S

1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS) [1]
LC-MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao
và phân tích khối phổ. Sự kết hợp này tạo nên một hệ thống có những ứng dụng
rộng lớn trong phân tích.
1.4.1. Nguyên tắc
Khối phổ (Mass Spectrometry – MS) là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng
và điện tích ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phần tử hoặc nguyên tử mẫu.
Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử hoặc bằng Dalton (Da).
Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ
bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được
thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau, tập hợp thành một khối phổ
đồ hoặc phổ khối, cung cấp thông tin để định tính, xác định cấu trúc và định lượng
các chất.
1.4.2. Máy khối phổ
1.4.2.1. Bộ nạp mẫu (Inlet)
- 15 -

Đưa mẫu vào máy. Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn phải chuyên mẫu sang
dạng hơi bằng cách thích hợp. Có thể nạp mẫu trực tiếp hoặc nối với đầu ra của một
thiết bị phân tích khác như sắc ký khí, sắc ký lỏng siêu giới hạn (SFC), điện di mao
quản (CE).

Hình 1.1. Sơ đồ khối của máy khối phổ
1.4.2.2. Bộ nguồn ion (Ion source)
Ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi, khử dung
môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối, cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển
với bộ phận nằm trong chân không sâu. Và rút ra ngoài các phân tử trung hòa, ion
khác dấu có thể ảnh hưởng tới phép đo.
Các kỹ thuật ion hóa đã được phát triển và sử dụng là: Va chạm electron, ion
hóa hóa học, ion hóa bằng nguồn ion phun sương khử solvat, ion hóa hóa học ở áp