1 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LOAN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
CIPROFLOXACIN VÀ OFLOXACIN
TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG
KHỐI PHỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LOAN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
CIPROFLOXACIN VÀ OFLOXACIN
TRONG NƯỚC THẢI BẰNG SẮC KÝ LỎNG
KHỐI PHỔ


TRẦN THỊ LOAN MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 3
1.1. NHÓM KHÁNG SINH QUINOLON 3
1.1.1. Vài nét về quinolon 3
1.1.2. Đặc tính của các quinolon nghiên cứu 4
1.2. KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG KẾT NỐI VỚI PHÔI KHÔ 5
1.2.1. Sắc ký lỏng 5
1.2.2. Khối phổ
(Mass Spectrometry)
7
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 13
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 13
2.2.1. Hóa chất 13
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ 14
2.3. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.3.1. Nội dung nghiên cứu 14
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu 15
CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19
3.1. XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC CHẤT BẰNG LC-MS/MS 19
3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ khối 19
3.1.2.Khảo sát điều kiện LC 21
3.1.3. Quy trình phân tích 26
3.2.XỬ LÝ MẪU 28


MS
MW
ppm
ppb
LOD
LOQ
SPE
R(%)
SD
RSD

Tiếng Anh
Acetonitril
The Bristist Pharmacopoeia 2010
Octadecyl carbon chain

Diode array detector

Internal standard
High perform liquid chromatography
High perform liquid chromatography –
Tandem Mass Spectrometry

Methanol
Mass Spectrometry
Molecular Weight
Parts per million
Parts per billion
Limit of Detection
Limit of Quantitation


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1.Đặc tính của các quinolon nghiên cứu………………………………….
Error! Bookmark not defined.
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất- thuốc thử - chất chuẩn 13
Bảng 3.1. Điều kiện phân mảnh của ciprofloxacin, ofloxacin và IS 20
Bảng 3.2. Kết quả sắc ký đồ khảo sát chương trình pha động 22
Bảng 3.3.Điều kiện LC-MS 28
Bảng3.4. Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống về thời gian và tỷ số diện tích
của kháng sinh so với chuẩn nội 30
Bảng 3.5. Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính 34
Bảng 3.6. Giá trị LOD và LOQ của phương pháp 37
Bảng 3.7.Kết quả khảo sát độđúng và độ lặp lại của phương pháp 39 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Công thức chung quinolon………………………………………………
Error! Bookmark not defined.
Hình 1.2. Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS 5
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc của máy khối phổ MS
7
Hình 1.4. Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba
10
Hình 3.1.Sơ đồ phổ khối của các chất phân tích 20
Hình 3.2. Kết quả sắc ký đồ khảo sát thể tích tiêm mẫu 24

pha hỗn dịch uống…Tuy nhiên việc kiểm soát sự tồn dư kháng sinh nhóm quinolon
trong nước thải ở các cơ sở sản xuất này vẫn chưa được quan tâm đúng mức. Tới
thời điểm hiện nay, ở Việt Namnghiên cứu xác định dư lượng các kháng sinh trong
nước thải đang còn hạn chế chưa có nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh
quinolon trong nước thải của cơ sở sản xuất dược.
2

Vì vậy để góp phần kiểm soát nồng độ dư lượng một số kháng sinh nhóm quinolon,
chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định Ciprofloxacin và
Ofloxacin trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ” với các mục tiêu:
1. Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích (điều kiện sắc ký, điều kiện MS) để
xác định Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước thải bằng LC-MS/MS
2. Thẩm định phương pháp định lượng Ciprofloxacin và Ofloxacin trong nước
thải
3

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN
1.1. NHÓM KHÁNG SINH QUINOLON

1.1.1. Vài nét về quinolon [10]
 Công thức cấu tạo chung của các quinolon:

Hình 1.1. Công thức chung quinolon
 Phân loại và phổ tác dụng
Có nhiều cách phân loại quinolon: phân loại dựa trên phổ và chỉ định lâm sàng,
phân loại dựa vào phân tử có hoặc không có fluor. Ngày nay, các quinolon được
phân loại chi tiết thành 4 thế hệ:
- Thế hệ I: Nhạy cảm với các vi khuẩn Gram (-), đặc biệt vi khuẩn gây bệnh
đường tiết niệu Enterobacter. Không tác dụng trên Pseudonomas aeruginosa. Chỉ
định trong nhiễm khuẩn tiết niệu chưa biến chứng.

FN
3
O
3
.HCl
Ofloxacin
C
18
H
20
FN
3
O
4

MW 367,8 336.1
CTCT
.HCl Tính
chất
Dạng base là bột kết tinh màu vàng
Nhạt, tan một phần trong H
2
O (1
g/25 ml), tan rất ít trong MeOH, rất
Tinh thể hình kim, không màu,
chảy ở khoảng 255
o

1.2.1.Sắc ký lỏng [1]
Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động làm
chất lỏng.Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch.Khi tiến
hành chạy sắc ký ,các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha
tĩnh.Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của
các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác
nhau.Do vậy chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau
a.Pha tĩnh.
Sắc ký

lỏng

Ion hóa
Bộ phận
tích khối
Detector / Lưu
giữ số liệu
6

Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất
phân tích đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ từ 3-7 m.Trong phần
tổng quan này chúng tôi đi sâu trình bày về kỹ thuật sắc ký phân bố là loại kỹ thuật
phổ biến nhất.Tùy theo bản chất của pha tĩnh, pha động sử dụng, sắc ký lỏng phân
bố được chia làm 2 loại: sắc ký pha thuận (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-
HPLC).
b.Pha động
Trong HPLC, pha động l
à các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ hoặc
dung dịch đệm được hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù
hợp.

phân cực khác nhau, giúp rút ngắn thời gian phân tích, tăng độ phân giải.
Pha động trong LC-MS/MS không chỉ đóng vai trò tách các chất mà còn
góp phần vào khả năng ion hóa của chất.
7

1.2.2.Khối phổ
(Mass Spectrometry) [1]
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry- MS) là phương pháp nghiên cứu
các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên
sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc
từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn
đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác
định được khối lượng của ion đó được.

Chân không cao

Hình 1.3: Mô hình cấu trúc của máy khối phổ MS
1.2.2.1.Nguyên tắc
Sau khi được tách trong hệ thống sắc ký lỏng, mẫu cần phân tích sẽ đi qua một
ống dẫn đến đầu dò MS. Tại đây diễn ra quá trình ion hóa trong buồng API với kiểu
ESI, APCI hoặc APPI. Ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion

hóa phun điện tử (ESI).
ESI là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền
nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn. ESI có khả năng tạo thành những ion
đa điện tích (dương hoặc âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế), được xem là kỹ
thuật ion hóa êm dịu hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học
như protein, peptide, nucleotide… hoặc các polyme công nghiệp như
polythylenglycol.
Trong ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và
sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang tích
điện tại bề mặt. Khí ở xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng làm bay hơi dung
môi ra khỏi giọt sương, khi đó, mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương gia tăng.
Mật độ điện tích này tăng đến một điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh) để
từ đó hạt sương phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn
sức căng bề mặt. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất
9

nhỏ. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này, các ion phân tích được chuyển
thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện sau rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối. Trong
kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải được biến thành chất điện ly, tan trong dung
dịch dùng để phun sương. Điều này phụ thuộc vào: dung môi sử dụng, pKa của
chất điện ly và pH của dung dịch.
Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm


Loại hình thành ion dương :


Phù hợp nhất cho chất phân tích có tính base



tứ cực, bộ phận phân tích bẫy ion, bộ phận phân tích thời gian bay.Bộ phân tích
khối ba tứ cực được sủ dụng phổ biến trong kỹ thuật LC-MS/MS và đây cũng là
kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này.
Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống
để các ion bay qua.Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dông một
chiều (DC) và điện thế tần số (RF).Các tứ cực được đóng vai trò như bộ lọc
khối.Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao
động phụ thuộc vào tỉ số m/z và trường RF.Chỉ có những ion có tỉ số m/z phù hợp
mới có thể đi qua được bộ lọc này.
10

Bộ phân tích khối ba tứ cực gồm ba tứ cực được ghép nối với nhau
Trong đó, tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion mẹ với m/z
nhất định từ nguồn ion chuyển đến dể chuyển đến Q2.Ở tứ cực thứ 2 (Q2) với áp
suất cao các ion phân tử bị phân li do va chạm với khí trơ có mặt như khí N
2
, Ar,
He.Bộ Q2 tạo ra phân ly do các ion mẹ bị phân mảnh tiếp theo tạo ra các ion nhỏ
hơn(ion con).Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion
do Q1 chuyển đến.Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3.Bộ tứ
cực thứ ba (Q3) làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để tới bộ phận
phát hiện.
Hình 1.4: Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba

c. Bộ phận phát hiện
(detector)


 Selected Ion Monitoring (SIM)
Trong chếđộ SIM, MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất
cần xác định. Phổđồ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đãđược lựa chọn trước đó, do
vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn. Đối với MS
tứ cực chập ba, chếđộ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân
mảnh khi đã biết ion mẹ.
 SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction
Monitoring)
Đối với MS tứ cực chập ba, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS), 2
kỹ thuật ghi phổ MS/MS có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.
 SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lậpđó, trong các mảnh
ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.
 MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng
nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM
thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất,
phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các
12

ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu
dò để phát hiện.
1.2.2.4.Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký
Trong các mẫu sinh học, mẫu môi trường có lẫn nhiều thành phần phức tạp, hàm
lượng chất cần phân tích rất thấp. Để làm giàu mẫu trong nghiên cứu này chúng tôi
đã sư dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE) để tách chiết mẫu.
Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn:
- Bước 1. Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được
với chất hấp phụ. Dịch mẫu khi cần thiết phải được lọc hoặc ly tâm trước khi cho
vào cột SPE để tránh làm tắc cột.
- Bước 2. Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc
hấp thu chất phân tích. Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất hấp

Methanol Merck (Đức) Dùng cho HPLC
Acid hydroclorid
đặc
Trung Quốc 36,36%

Na
2
EDTA Merck (Đức)
Nước cất Siêu tinh khiết
Acid formic Merck (Đức) Dùng cho HPLC
Chất chuẩn
Ciproloxacin 13C3
(IS)
USA( Mĩ) 99,99%

Ciprofloxacin
hydroclorid
Viện kiểm
nghiệm TW
SKS: 0212029.02 93,47%

Ofloxacin Viện kiểm
nghiệm TW
SKS: 010087.02 99,99%14

 Giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện.
15

2.3.2.Phương pháp nghiên cứu
2.3.2.1.Phương pháp thu thập và xử lý mẫu
Lấy nước thải từ nhà máy sản xuất kháng sinh trong giai đoạn nhà máy không sản
xuất,lọc, điều chỉnh đến pH thích hợp
Bảo quản mẫu saukhi lấy ở 2 – 8
0
C và tiến hành phân tích trong 24h về độ dặc hiệu
và độ đúng chứng minh nước thải không có kháng sinh Ciprofloxacin và Ofloxacin.
2.3.2.2.Xây dựng các điều kiện sắc ký
Tiến hành chạy thử trên từng kháng sinh CIPRO, OFLO, IS và hỗn hợp kháng
sinh với IS trong dung môi pha động.
 Khảo sát điều kiện khối phổ
Khảo sát lựa chọn điều kiện nguồn Ion hóa, điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion
con, lựa chọn ion con để định lượng.
 Khảo sát điều kiện sắc ký :
- Chuẩn nội: Đảm bảo phân tách tốt và thời gian phân tích không quá dài,đáp
ứng của chuẩn nội tốt. Chúng tôi quyết định chọn chuẩn nội để khảo sát là
Ciprofloxacin 13C3.
- Cột sắc ký Agilent SB C18 (1,8 µm; 2,1×50 mm)
- Chương trình pha động: Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát trên
pha động ACN (0,1% HCOOH) : H
2
O (0,1% HCOOH) với tỉ lệ tt/tt khác nhau và
chạy chế độ gradient.
- Tốc độ dòng: Thay đổi lưu lượng pha động từ 0,1- 0,3 ml/phút để xác định
được tốc độ phù hợp cho thời gian tối ưu.
- Thể tích tiêm mẫu: Thay đổi lưu lượng mẫu từ 1- 5 µl để xác định được thể tích

tuyến tính cần khảo sát. Nồng độ chuẩn nội trong mỗi dung dịch chuẩn được giữ
hằng định
17

 Tiến hành sắc kí theo các điều kiện đã chọn.
 Xây dựng đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỉ lệ diện tích pic kháng sinh
chuẩn nội (S
KS
/S
i
) (trục tung Oy) và nồng độ kháng sinh (trục hoành Oz).
 Thiết lập phương trình hồi qui tuyến tính dạng y = ax + b và hệ số tương
quan r từ đó kết luận về độ tuyến tính của phương pháp.
 Giới hạn định lượng (LOQ)
LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất phân tích có trong mẫu thử mà ta có
thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp.
LOQ được chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần
đáp ứng của mẫu trắng.
Tiến hành xử lý mẫu chuẩn ciprofloxacin và ofloxacin có nồng độ thấp dần và
tiến hành phân tích.
 Giới hạn phát hiện (LOD)
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu
có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được.
LOD được coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3
lần so với đáp ứng của tín hiệu của mẫu trắng (S/N =3)
LOD được tính theo giá trị LOQ theo công thức:
 =

3.3