ứng dụng phơng pháp xác định Clenbuterol và Salbutamol
trong thức ăn chăn nuôi bằng kỹ thuật Elisa (enzyme Link
imunosorrbent assay)

Th Khang, Phan Thanh m, Dng Th Thu Anh, o c Ho.
Phũng Phõn tớch Thc n v sn phm chn nuụi

1. Đặt vấn đề
Clenbuterol v salbutamol l nhng cht thuc nhúm Agonits cú tỏc dng
lm gión ph qun. õy l mt dc phm s dng ủ ủiu tr hen suyn trờn
ngi, cỏc trng hp viờm phi d ng trờn nga v viờm ủng hụ hp trờn bũ.
Ngi ta khỏm phỏ rng khi dựng liu cao cỏc cht Agonits theo ủng ming,
thuc cú th to ra mt s gia tng nhanh chúng v rừ rt s tng khi c ủng thi
lm gim khi lng m. Cỏc nh chn nuụi ủó phỏt hin ra tỏc dng k diu ny
ca Clenbuterol v Salbutamol nờn ủó b sung vo trong thc n gia sỳc, gia cm
nhm to ra nhng con vt cú quy tht nc hn v tng trng nhanh hn nhm thu
li nhun cao (Eshaq v cng s, 2003). Tuy nhiờn, ngi ta ủó phỏt hin ra s tn
d ca Clenbuterol v Salbutamol trong tht v ph tng, ủc bit l gan ca nhng
con vt ủc nuụi bng thc n cú cha cỏc cht ny v ủó gõy nh hng ủn sc
kho ngi tiờu th (Yu v cng s., 2004). Hin nay M, Canaủa, v cỏc nc
trong liờn minh chõu u ủó cm s dng cỏc cht thuc nhúm beta Agonits. Vit
Nam, B Nụng nghip v PTNT cng ủó ra quyt ủnh s 54/2002/Q-BNN ngy
20 thỏng 06 nm 2002, cm s dng cỏc cht thuc nhúm Agonist trong thc n
chn nuụi. Tuy nhiờn vic s dng bt hp phỏp cỏc cht cm nh Clenbuterol v
Salbutamol vn cú trờn th trng thc n chn nuụi nc ta. Trờn th gii ủó cú

+ S dng 2 loi b kit chun Salbutamol v Clenbuterol ca hóng BIOO
SCIENTIFIC - M . Trong mi b kit chun ny cú mt khay ủng 96 ging ủó
ph cht ủc bit (khỏng nguyờn) v cht chun Salbutamol hoc Clenbuterol ủó
ủc pha sn theo cỏc nng ủ khỏc nhau v cỏc hoỏ cht ủ thc hin xột nghim
ELISA.
+ Cỏc hoỏ cht ủ x lý mu ban ủu trc khi tin hnh xột nghim trờn
ELISA nh acetonitrile, ethyl acetate, n-hexan l nhng hoỏ cht tinh khit ca
MERCK(c). Nc ct dựng ủ pha loóng l nc ct 2 ln.
a ủim
Phũng phõn tớch thc n v sn phm chn nuụi - Vin Chn Nuụi.
Thi gian
T thỏng 4 ủn thỏng 9 nm 2006.
2.2. Phng phỏp thc hin
Cỏch b trớ thớ nghim
- X©y dùng ®−êng chuÈn cña Clenbuterol vµ Salbutamol dùa trªn 6 loại
nồng ñộ chất chuẩn (Salbutam dmol hoặc Clenbuterol) khác nhau: 0 ppb; 0.05ppb;
0.15ppb; 0.5ppb; 1.5ppb; 4.5ppb. Đường chuẩn của mỗi chất ñược xây xựng dựa
trên 5 nồng ñộ chuẩn trên và % hấp thụ tối ña của mẫu tương ứng với 6 nồng ñộ
trên
- Chất chuẩn Clenbuterol và Salbutamol ñược thêm vào mẫu trắng ở các
nồng ñộ khác nhau : 1ppb; 2ppb; 3ppb; 4ppb. Mỗi mức nồng ñộ thêm vào mẫu
trắng ñược lặp lại 10 lần.
- So sánh kết quả phân tích của 3 mẫu thức ăn chăn nuôi ñược phân tích
bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ(GC-MS) tại phòng thí nghiệm - Bộ Nông


Thêm 1 ml n-
hexan và 1ml 1x PBS.
Làm ñồng ñều hỗn hợp trong 1 phútLy tâm 5 phút với lực RCF 4.000g và lấy 50 µl phần dung dịch lớp
dưới ñem phân tích trên ELISA ở bước sóng 450 nm.

Trộn ñều mẫu, nghiền qua mắt sàng
1mm Cân khoảng 1.g mẫu.

2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập ñược xử lý theo phương pháp thống kê sinh vật học, phân
tích phương sai (ANOVA) bằng phần mềm Minitab version 14.0 for Window 2000,
sử dụng mô hình thống kê tuyến tính tổng quát (GLM)
. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn
Mỗi bộ kit chuẩn của từng chất Clenbuterol hoặc Salbutamol có 96 giếng
ñược phủ sẵn kháng nguyên và các hoá chất cần thiết ñể thực hiện xét nghiệm
ELISA. Nếu một số lượng mẫu lớn (khoảng 40 mẫu) có thể thực hiện trong thời
gian ngắn (4h) như vậy số lượng mẫu phân tích nhiều sẽ giảm chi phí phân tích và
tiết kiệm thời gian.
B¶ng 1.
ết qu thu h i c a các ch t chuẩn ñược thêm vào mẫu tr ng

n
Kết quả thu ñược
(ppb)
% thu hồi của
chuẩn

R.S.D (%)
Nồng ñộ Clenbuterl

(ppb)
m SE m SE
1 10 0.724 0.015 72.40 1.5 6.35
2 10 1.459 0.029 72.95 1.45 6.30
3 10 2.29 0.024
76.33


(ppb) m SE m SE
1 10 0.71 0.011 70.80 1.15 5.15
2 10 1.40 0.044
70.05
2.18 9.85
3 10 2.39 0.072 79.67 2.46 9.55
4 10 3.22 0.056
80.50
1.38 5.44

Qua kt qu bng 2 trờn, ta thy hiu sut thu hi ca cht Salbutamol
cỏc mc thờm vo mu trng t 1- 4 ppb ủt t 70.05% ủn 80.50 % v ủ lch
chun (R.S.D) nh hn 10%. Nh vy, cỏc kt qu ủ ủỏnh giỏ ủ n ủnh ca
phng phỏp hon ton trong khong cho phộp ca phõn tớch.
Bảng 3.
sỏnh kt qu phõn tớch gi a phng phỏp v .

Tờn mu

n
Kt qu phõn tớch ti
Vin Chn Nuụi (ppb)(ELISA)
Kt qu phõn tớch ti
Malaysia (ppb)(GC-MS)
Clenbuterol Salbutamol Clenbuterol Salbutamol
m SEM m SEM m SEM m SEM
Mu s 1 7 0.00 0.00 0.00 0.00
Mu s 2 7 3.074 0.042 5.978 0.059
Mu s 3 7 4.004 0.049 6.524 0.064

.2. Đề nghị
Tiếp tục ñược nghiên cứu phân tích các chất cấm khác trong thức ăn chăn
nuôi như nitrofuran, chloramphenicol, cimaterol….bằng phương pháp ELISA.
Tµi liÖu tham kh¶o
1.
Eshaq et al., 2003 Eshq,S.C. Chai,S. Jamokha, G.Aznar and M.K. Hoffman,
Determinationof ractopamin in animal tissue by liquid chromatography- fluorescence and
liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Anal.Chim. Acta 483 (2003), pp. 137-145.
2.
Hassnoot et al .,1994 W.Hassnoot, P.Stouten and A.M.Lommen, Determination of
fenoterol and ractopamin in urine by enzyme immunoassay, Analyst 119 (1994), pp. 2675-
2680.
3.
He et al., 2005 L.M.He, Y.J.Su and H.J.Zhang, Detection of clenbuterol in animal tissues
and feeds by cappilary gas chromatography- mass spectrometry, J.Chin.Mass Spectrom.Sos.26
(2005), pp. 168-172.
4.
Yu et al., 2004 H.X. Yu and S.M. Yang, Advance in detremination of ractopamin residues
in animal tissues end excrements, Chin.J.Vet.Drug 38 (2004), pp. 44- 47.
5.
Limin et al., Yijuan Su, Zhenling Zeng, Yahong Liu and Xianhui Huang, Determination of
ractopamin and clenbuterol in feeds by gas chromatography – mass spectrometry, J. Animal
Feed Science and Technology 3 (2007), pp.316-323.
Skeritt., 1998. Approate 3nalytical Technologies for Monitoring Agrochemical Residues.In
Seeking Agricultural Produce Fee of Pesticide Residues. Internatioanal Workshop held in
Yogyakarta, Indonesia, 17- 19 February 1998. ACIAR Proceeding No.85. ISBN 1 86320 2277,
Canberra Australia.