TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ĐHQG TP. HCM
KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC
TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH CÔNG CỤ
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM
LƯỢNG VITAMIN TRONG THỰC PHẨM

TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 12/2013
Tiểu Luận Môn Học 2
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM
LƯỢNG VITAMIN TRONG THỰC PHẨM
I. Giới thiệu chung về các họ Vitamin trong thực phẩm
1. Phân loại Vitamin trong thực phẩm – phản ứng sinh hóa của vitamin
Vitamin được ghép bởi hai chữ: “vita” và “amine”. “Vita” gốc Latinh có nghĩa là sự
sống, “amine” là các acid amin. Vitamin là những acid amine cần thiết cho sự sống.
Cơ thể con người cần một lượng nhỏ Vitamin nhưng thiếu chúng cơ thể sẽ mắc bệnh.
Hiện nay người ta đã nghiên cứu và phân lập được trên 30 loại vitamin khác nhau,
đồng thời đã nghiên cứu các thành phần, cấu tạo và tác dụng sinh lý của chúng. Người
ta cũng tổng hợp một số lượng lớn vitamin bằng tổng hợp hoá học ở phòng thí
nghiệm.
Căn cứ vào tính hoà tan của vitamin mà ngày nay người ta chia vitamin ra làm hai
nhóm.
1.1 Các vitamin tan trong nước
Vitamin tan trong nước chủ yếu tham gia và làm nhiệm vụ xúc tác trong quá trình sinh
học gắn liền với sự giải phóng năng lượng ( các phản ứng oxi hoá - khử, sự phân giải
các hợp chất hữu cơ ) nghĩa là chúng hoàn thành chức năng năng lượng như nhóm
các Vitamin B1 (tiamin), Vitamin B2 (riboflavin), Vitamin B3 (axit pantotenic),
Vitamin B5 (nicotinamit), Vitamin B6 (piridoxin), Vitamin B7 (biotin), Vitamin B10
(axit folic), các vitamin B12 (các cianocobalamin), vitamin B15 (axit pangaminic),
vitamin C, vitamin P (citrin), vitamin U (S-metyl-metionin), Vitamin C,…
1.2 Các vitamin tan trong chất béo ( trong dầu và mỡ)
Vitamin hoà tan trong chất béo (trong dầu và mỡ) thì tham gia vào phản ứng tạo nên

- Vitamin B: nhóm các vitamin B đều tan tốt trong nước, thường ở dạng tinh thể
- Vitamin B1 là những tinh thể trắng hình kim hay ở dạng vẩy, thường có mùi
đặc trưng. Khi tiếp xúc với không khí, chế phẩm khan nhanh chóng hút ẩm
(khoảng 4% nước).
- Vitamin B1 có tính axit, hoà tan tốt trong môi trường nước, axit acetic, nhưng
- khó tan trong ethanol 96% và methanol, không tan trong ete, benzen hay
cloroform và chịu nhiệt khá nên không bị phân huỷ khi nấu nướng. Vitamin B1
nóng chảy ở 2330C-252
0
C.
- Vitamin B1 bền trong môi trường axit, còn trong môi trường kiềm nó rất dễ bị
phân huỷ khi đun nóng
- Vitamin B2 ở dạng tinh thể màu vàng, có vị đắng, dễ bị phân hủy bởi ánh nắng
mặt trời, nhiệt độ cao và không ổn định với tia cực tím. Trong vùng UV
Vitamin B2 hấp thu tại 2 bước sóng 223,3 và 268,0nm. Vitamin B2 hoà tan
trong nước, ổn định trong môi trường axit, chịu nhiệt, phân huỷ nhanh trong
môi trường kiềm. Nó cũng bền vững khi đông lạnh, ở trạng thái khô Vitamin
B2 bền với nhiệt và axit.
- Vitamin B6 là tinh thể không màu, vị hơi đắng, hòa tan tốt trong nước và trong
rượu, chịu nhiệt, nhạy cảm với ánh sáng, pyridoxin bazơ có nhiệt độ nóng chảy
ở 1600C, pyridoxin hydrochloric nóng chảy ở 204-206 0C, bền vững khi đun
nóng. Bền khi đun sôi trong axit hay kiềm, không bền trong môi trường có tính
oxy hóa. Vitamin B6 nhạy cảm với ánh sáng. Chúng phân hủy nhanh khi chiếu
sáng ở môi trường kiềm hay trung tính, còn trong môi trường axit thì pyridoxin,
pyridoxan và pyridoxamin bền hơn.
- Vitamin C kết tinh không màu hoặc hơi vàng, rất dễ tan trong nước (300g/lít).
Dung dịch nước 5% có pH=3. Có khi dùng dạng muối natri dễ tan trong nước
hơn (900g/lít).
- Vitamin A tồn tại trong tự nhiên gồm 2 dạng:
Tiểu Luận Môn Học 7

- Các vitamin đều rất thiết yếu với cơ thể con người, nhưng việc dùng vitamin
quá liều có thể gây ra những tác động bất lợi, làm suy giảm hệ miễn dịch của cơ
thể. Nhiều người tiêu dùng “thoải mái” sử dụng các loại vitamin hoặc các thực
Tiểu Luận Môn Học 8
phẩm bổ sung vitamin vì nghĩ rằng “thừa còn hơn thiếu” mà không hề biết đến
tác hại của việc sử dụng vitamin quá liều.
- Các chuyên gia dinh dưỡng nói rằng cách tốt nhất để cơ thể hấp thụ các vitamin
là thông qua một chế độ ăn uống lành mạnh với nhiều trái cây và rau. Mọi
người nên dùng vitamin bổ sung chỉ khi họ không thể bổ sung đủ vitamin qua
thực phẩm hoặc có nhu cầu thêm, và nên tham khảo ý kiến bác sĩ hoặc chuyên
gia dinh dưỡng uy tín về đúng liều để dùng.
II. Các phương pháp phân tích xác định hàm lượng Vitamin trong thực
phẩm
Các vitamin đã được các nhà khoa học phát hiện và nghiên cứu từ rất lâu. Đi kèm với
việc nghiên cứu các vitamin thì các phương pháp phân tich hóa lý, y sinh dùng để xác
định hàm lượng các vitamin từ các nguồn gốc khác nhau cũng đã phát triển khá đầy đủ
và chi tiết. Trong phạm vi bài tiểu luận này, tôi xin liệt kê các phương pháp xác định
hàm lượng vitamin trong thực phẩm theo 2 nhóm vitamin tan trong nước và trong dầu.
Dựa vào cấu trúc hóa học, trạng thái tồn tại của các vitamin, hàm lượng các vitamin có
trong mẫu cần phân tích và các điều kiện thiết bị, hóa chất có trong phòng thí nghiệm,
các vitamin được xác định bằng rất nhiều cách khác nhau từ phương pháp phân tích cổ
điển đến phương pháp phân tích hiện đại.
A. Định lượng các nhóm Vitamin tan trong nước
Như đã nêu ở trên, các Vitamin thuộc nhóm này bao gồm các Vitamin B, Vitamin C…
Đặc điểm chung của nhóm này là có cấu trúc phân cực, tan nhiều trong nước. Các
phương pháp xác định hàm lượng nhóm Vitamin này bao gồm:
1. Phương pháp cực phổ
a) Nguyên lý:
Các Vitamin nhóm B và Vitamin C là những hợp chất phân cực
Vitamin nhóm B như B1, B3, B6, B9, Vitamin C trong thực phẩm được phân tích

3
-

Triiođua oxy hóa vitamin C tạo acid dehydroascorbic:
C
6
H
8
O
6
+ I
3
-
+ H
2
O > C
6
H
6
O
6
+ 3I
-
+ 2H
+

Vitamin C còn hiện diện trong dung dịch, thì triiotđua được chuyển thành ion
iođua rất nhanh chóng.
Tiểu Luận Môn Học 11
Tuy nhiên, khi tất cả vitamin C đã bị oxy hóa, thì iốt và triiođua sẽ hiện diện trong

uẩn độ chính là thể tích dung dịch iốt ban đầu trừ đi dung dịch sau chuẩn độ.
• Làm lại thí nghiệm chuẩn độ ít nhất 2 lần. Các kết quả chấp nhận sai
khác 0,1 ml
c) Tính toán kết quả:
Gọi V
iot
: thể tích dung dịch chuẩn Iot dùng chuẩn độ (mlk)
N
iot
: nồng độ đương lượng dung dịch Iot dùng chuẩn độ (N)
V
sample
: thể tích mẫu đem chuẩn độ (ml)
N
sample
: nồng độ đương lượng Vitamin C trong mẫu đem chuẩn độ.
Ta có:
Tiểu Luận Môn Học 13
iot iot
sample
sample
V *N
N
V
=
= M
sample
=>Hàm lượng vitamin C trong mẫu:
Vitamin C (mol/g) =
sample

-15
giây. Electron se duy trì ở trạng thái kích
thích từ 10
-8
ddeens 10
-4
giây. Sau đó nó sẽ bắt đàu nhảyvề trạng thái cơ bản. quá trình này
có thể xảy ra qua sự va chạm phân tử mà năng lượng tỏa ra dưới dạng nhiêựt hoặc e rơi
xuống mức dao động thấp nhất của trạng thái cơ bản ,đồng thời giải phóng một photon
năng lượng và phát huỳnh quang. Do một lượng năng lượng dã bị mất trước khi e nhảy
xuống trạng thái năng lượng thấp hơn ,nên năng lượng giải phóng dưới dạng photon phải
có ít năng lượng hơn photon kích thích
Các hợp chất phát quang tự nhiên đươc gọi là sự phát huỳnh quang tự phát. Nhiều hợp
chất không phát huỳnh quang có thể được chuyển hóa hóa học thành các chất phát huỳnh
quang hóa học.nếu các e của một hợp chất được tự do hơn (ví dụ bằng cách thay thế O,N
hoặc S vào cấu trúc) khả năng phát huỳnh quang sẽ tăng lên. Tuy nhiên một số nhóm có
thể có xu hướng định xứ các điện tử và do đó làm giảm độ huỳnh quang.từ những điều
trên có thể thấy rằng bước song hấp thụ và bước song phát xạ của mỗi hợp chất sẽ khác
nhau. Có nhiều hợp chất hấp thụ năng lượng vpứi bứơc sóng như nhau,một số chất phát
quang tại cùng một bước sóng .sự kết hợp của hai bước sóngkhá đặc trưng cho một hợp
chất, do đó phép đo huỳnh quang có thể được dùng trong phân tích định tính. Nếu có sự
nghi ngờ về sự có mặt của một hợp chất phát quang, tiếp tục đo bước sóng lân quang, sự
xê dịch bước sóng huỳnh quang bởi PH, hiệu suất lượng tử, thời gian phát quang và dữ
liệu phân cưch hóa sẽ hoàn chỉnh sự nghiên cứu này.
Tính đặc thù của phép đo huỳnh quang là đơn giản hóa và làm tăng độ tin cậy của quá
trình phân tíchvì hợp chất thường được đo trực tiếp mà không phải chiết tách trước.
Tiểu Luận Môn Học 15
không giống như quang phổ hấp thụ mà ở đó các hợp chất khác nhau co khả năng hấp thụ
cùng một bước sóng kích thích khác. Với việc thay đổi bước sóng kích thích cực đại hoặc
thay đổi PH, có thể làm giảm thậm chí đến mức tối thiểu tính chất đó.

loại dập tắt: dập tắt ảnh hưởng màng lọc và dập tắt thật. ảnh hưởng màng lọc xảy ra khi
màng lọc hấp thụ ánh sáng kích thích hoặc ánh sáng phát xạ. còn sự dập tắt thật thì xảy ra
khi yếu tố gây tắt làm giảm năng lượng của phát quang.làm cho năng lượng hấp thụ biến
thành dạng năng lượng khác chứ không phải thành dạng năng lượng huỳnh quang.sự dập
tắt xảy ra trong trường hợp chất phát quang chuyển hóa thành chất không phát quang. Có
thể phân tích các yếu tố dập tắt thong qua sự biến mất một hợp chất phát quang trong
dung dịch. Ví dụ như biến mất của phức chất borat-benzoin trong phổ phát quang bởi oxi.
Đóng góp quan trọng nhất của phương pháp đo quang phổ huỳnh quang là tính đặc thù và
độ nhạy. tính đặc thù được miêu tả ở trên ,còn độ nhạy thì thường gấp vài nghìn lần so với
phương pháp quang phổ hấp thụ.
Trong phương pháp đo phổ huỳnh quang ,bước sóng của ánh sáng phát xạ dài hơn bước
sóng của ánh sang kích thích. Vì vậy, một máy đơn sắc dược dung để ngăn phần lopứn
ánh sang kích thích đến máy ghi phổ mà chỉ cho phép ánh sáng huỳnh quang đi qua,cho
nên phép đo huỳnh quang được tiến hành trong điều kiện cường độ ánh sang thấp. trong
các kĩ thuật hấp thụ độ nhạy cảm của mức hấp thụ thấp nhất phụ thuộc vào tính chính xác,
do đó có thể so sánh hai cường độ ánh sáng tương tự nhau.
Có hai ưu điểm trong việc sử dụng đo huỳnh quang so với kĩ thuật hấp thụ là:
Tiểu Luận Môn Học 17
• Chỉ cần đo một lần chứ không cần đo hai lần như trong kĩ thuật hấp thụ
• Kết quả đưa ra từ máy đo huỳnh quang tỉ lệ thuận trực tiếp với nồng độ chứ không
phải là tỉ lệ nghịch với logarit nồng độ.
Dựa vào ưu điểm trên mà người ta dung phương pháp huỳnh quang để xác định hàm
lượng vitamin B
2
.
b) Nguyên tắc:
Trong ngũ cốc riboflavin (latoflavin,vitamin G, vitamin B
2
) là chất có màu vàng-xanh lá
cây được chỉ định bằng phương pháp phân tích huỳnh quang .riboflavin có nhiều trong tế

riboflavin bị phân hủy bởi ánh sáng. Đặt trong nồi cách thủy đang đun sôi khoảng
1 giờ, cứ 5 phút lại lắc một lần. kiểm tra mức nước mỗi lần lắc bình, không để
nước cạn.
 Làm nguội bình đến nhiệt độ phòng và cho vào cốc 100 ml.dùng máy đo PH chỉnh
đến 6.0 (bằng dung dịch NaOH 0.5M)
Chú ý: Cho NaOH từ từ dể tránh những chổ có PH cao sẽ dẫn đến mât riboflavin.
 Ngay lập tức thêm HCl 1M để giảm PH đến 4.5.Li tâm bằng ống li tâm thủy tinh
100 ml ở 2000 v/phút (rpm) trong 10 phút.
 Pha loãng dịch lọc đến 250 ml với nước cất trong bình định mức.
- Quá trình axit hóa và oxi hóa của dịch chiết
 Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 10ml dịch chiết và 1 ml nước.trộn đều bằng
máy trộn.
Tiểu Luận Môn Học 19
 Lấy 2 ống nghiệm khác, cho vào mỗi óng 10 ml dịch chiết và 1ml dung dịch chuẩn
riboflavin (0.5 microgam/ml) và trộn đều.
 Cho 1 ml axit axetic đặc vào cả 4 ống nghiệm và để 2 phút.
 Cho thêm 0.5 ml dung dịch KMnO
4
3%vào mỗi ống, trộn đều và để 2 phút.
 Cho 0.5 ml H
2
O
2
3% vào mỗi ống và trộn đều. màu đỏ sẽ biến mất trong vong 10
giây.
- Đo độ huỳnh quang của dịch chiết
 Để đo độ huỳnh quang của riboflavin, bước song phát xạ và bước sóng kích thích
phải được xác định bằng máy đo quang phổ quét (scanning spectrophotometer).
 Xác định cực đại của bước sóng phát xạ và bước sóng kích thích của dung dịch
chuẩn riboflavin (nồng độ 1 microgam/ml riboflavin) giá trị cực đại cho kích thích

O
4
(pha trong nước)
trộn đều và đo ngay lập tức (kết quả C)
 Đo độ huỳnh quang của dịch chiết có chứa riboflavin thêm vào (kết quả B).
4. Định lượng vitamin B1 bằng phương pháp huỳnh quang
a) Nguyên tắc
Khi oxi hóa vitamin B1(thiamin) bằng kali feroxianua trong môi trường kiềm sẽ tạo thành
hợp chất thiochom,chất này có màu huỳnh quang xanh dưới ánh sáng tử ngoại.Cứ một
phân tử thiamin sẽ tạo thành một phân tử thiocrom.
Để xác định hàm lượng thiamin, người ta dùng dung dịch chuẩn thiamin tinh khiết so
sánh với dung dịch nghên cứu. trước khi tiến hành các phản ứng, thiamin phải được giải
phóng ra khỏi mẫu bằng chế phẩm enzim photphataza , papayolin ,hoặc takađiataza.
b) Hóa chất
- Dung dịch H
2
SO
4
0.1N.
Tiểu Luận Môn Học 21
- Dung dịch CH
3
COOH 30%.
- Dung dịch NaOH 15%.
- Dung dịch kaliferoxianua [K
3
Fe(CN)
6
] 1%chẩn bị để dùng trong ngày và giữ trong
lo mầu.

100ml,thêm nước cất đến bình định mức,lắc kỹ,1ml dung dịch này chứa 1 γ
thiamim.
• Dãy dung dịch thiamin chuẩn(b):từ dung dịch trên cho vào các ống nghiệm lần
lượt 0.5;1.0;1.5;2ml(chứa 0.5;1.0;1.5;2 γ thiamim ),thêm vào các ông nghiệp lần
lượt 4.5;4.0;3.5;3.0ml nước cất và 1ml dung dịch K
3
Fe(CN)
6
1% (mới pha).Cuối
cùng cho vào mỗi ống 3ml dung dịch NaOH 1%.Lắc nhanh,mỗi ống lại cho thêm
10ml rượu butylic,lắc.Để yên 10 phút ,dung dịch sẽ tách thành 2 lớp.Li tâm ,tách
Tiểu Luận Môn Học 22
bơ lớp dưới,cho vào 1g Na
2
SO
4
khan.Dung dịch rượu khan chứa thiỏcom được cho
vào dãy ống nghiệp khác.Ta được dãy màu tiêu chuẩn bền trong 2-3 ngày.
c) Tiến hành:
- Cân 5-10g mẫu, nghiền trong cối sứ với 10-15ml H
2
SO
4
0.1N.Chuyển vào bình
định mức cỡ 100ml,thêm H
2
SO
4
đến 75ml.
- Đặt bình vào nồi cách thủy sôi trong 45 phút ,lắc điều, để nguội vào thêm chế

w- khối lượng mẫu(g).
1000-chuyển từ γ ra mg.
5. Định lượng vitamin nhóm B và vitamin C trong thực phẩm bằng sắc ký
lỏng ghép đầu dò UV
a) Nguyên tắc:
Vitamine B và C được chiết ra khỏi nền mẫu bằng hỗn hợp Acetonitril : H
3
PO
4
0.05%
(80:20) và định lượng bằng sắc ký lỏng kết nối với đầu dò UV.
Chuẩn làm việc:
- Chuẩn gốc dạng bột rắn , độ tinh khiết 99.2%, Dr. Ehrenstorfer hay tương đương
- Dung dịch chuẩn gốc (1000 mg/l)
Cân 10,0 mg chuẩn rắn định mức 10 ml bằng Acetonitril: H
3
PO
4
0.05% (80:20)
- Dung dịch chuẩn thứ cấp :
Dung dịch chuẩn thứ cấp 1 (500 mg/l) : hút 5 ml dung dịch chuẩn gốc định mức 10ml
bằng Acetonitril: H
3
PO
4
0.05% (80:20) .
Tiểu Luận Môn Học 24
Dung dịch chuẩn thứ cấp 2 (200 mg/l) : hút 2 ml dung dịch chuẩn gốc định mức 10ml
bằng Acetonitril: H
3

đem xay nhuyễn…). Toàn bộ mẫu sau khi đồng nhất sẽ được chuyển xuống
phòng thí nghiệm.
- Tiến hành phân tích mẫu:
 Mẫu kiểm soát:
Tiểu Luận Môn Học 25
- Cân khoảng 2 gam (hút 2 ml) mẫu cần phân tích vào óng nhựa 15 ml, tiến hành
thêm chuẩn ở nồng độ thích hợp (kết quả sau phân tích phải nằm trong khoảng
nồng độ của dãy chuẩn làm việc) vào trong nền mẫu phân tích, vortex mẫu, để yên
trong vòng 15 phút.
 Mẫu phân tích:
- Cân khoảng 2 gam (hút 2 ml) mẫu đã được đồng nhất vào ống 15mL.
Tiền hành phân tích tương tự các bước phía dưới cho cả hai mẫu kiểm soát và mẫu
phân tích.
- Thêm vào 10 ml hỗn hợp Acetonitril : H
3
PO
4
0.05% (80:20).
- Vortex cho đều mẫu, đánh siêu âm 5 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 5 phút, 5000 vòng/phút.
- Sau khi ly tâm mẫu xong ta tiến hành chuyển phần dung dịch trong vào bình định
mứt 25ml.
- Tiến hành chiết mẫu thêm 1 lần, tương tự các bước B.3, B.4, B.5 và B.6
- Gợp toàn bộ dung dịch trong sao khi chiết vào bình định mứt 25 ml và định mứt
đến vạch. Pha loãng mẫu nếu cần thiết.
- Sau đó lọc mẫu qua màng lọc 13mm, 0.45µm.
- Thu dịch lọc cho vào vial.
- Tiến hành đo trên máy HPLC/UV
- Tiến hành đo trên máy HPLC/UV
 Điều kiện phân tích