ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

TIỂU LUẬN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ
Đề tài:
CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
DƢ LƢỢNG CHLORAMPHENICOL TRONG THỦY SẢN

GVHD: TS. Huỳnh Khánh Duy
HV: Nguyễn Thị Bích Duyên
MSHV: 13050181
Lớp: Cao học 2013 TP. Hồ Chí Minh - 2013
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên 
i

[2]
10
2.2.3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu 10
2.2.3.2 Điều kiện thiết bị 11
2.2.3.3 Kết quả: 12
2.3 Sắc kí khí (GC) 15
2.3.1 GC/MS/MS
[1]
16
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên 
ii
2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu 16
2.3.1.2 Thông số 17
2.3.1.3 Kết quả 18
2.4. Phƣơng pháp Kít Elisa
[4]
: 19
2.4.1 Tóm tắt quy trình 19
2.4.2 Kết quả: 20
2.4.3 Kết luận 24
2.4.4 Ƣu và nhƣợc điểm 24
KẾT LUẬN 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO 26


0.1 đến 200 ng/mL (0.01 đến 20 ng/g tôm) với giá trị R
2
= 0.9997 14
Hình 2. 8: Quy trình chuẩn bị mẫu 16
Hình 2. 9: Nguyên tắc phân mảnh của CAP-TMS ether trong chế độ NCI: (1) m/z
304, (2) m/z 322; (3) m/z 358; (4) m/z 394; và (5) m/z 430 18
Hình 2. 10: Xác định CAP 18
Danh mục bảng biểu
Bảng 1. 1: Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của CAP 4

Bảng 2. 1: Sự phát triển của những phương pháp phân tích dư lược CAP trong
thủy sản 6
Bảng 2. 2: Thông số GC cho việc phân tích CAP bằng GC-MS
2
17
Bảng 2. 3: Thông số khối phổ cho phân tích CAP bằng GC-MS
2
17
Bảng 2. 4: Kết quả tỉ lệ dương tính giả trên các mẫu 19
Bảng 2. 5: Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỉ lệ dương giả
20

Biểu đồ 2. 1: Mẫu tôm 21
Biểu đồ 2. 2: Cá fillet 22
Biểu đồ 2. 3: Mẫu nhuyễn thể 22
Biểu đồ 2. 4: Mẫu ghẹ, cua 22
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên 

Chloramphenicol (CAP) có đặc tính kháng khuẩn nên thƣờng đƣợc sử dụng
để chữa bệnh trong tôm và đƣợc sử dụng trực tiếp để bảo quản nguyên liệu. Tuy
nhiên, việc sử dụng CAP không đúng cách gây ra hiện tƣợng kháng thuốc và tích
tụ trong thủy sản gây nên những nguy hiểm cho sức khỏe con ngƣời. Hiện nay, ở
Việt Nam đã có nhiều loài thủy hải sản đã bị cảnh báo và cấm xuất khẩu do sử
dụng CAP quá liều lƣợng.
Vì vậy việc xác định CAP trong thủy sản là cần thiết để tránh gây tác hại
cho ngƣời tiêu dùng.
Trong tiểu luận này, em xin trình bày về “Những phƣơng pháp xác định
hàm lƣợng Chlorophenicol trong thủy sản”
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên 
1

1.2 Nguồn gốc:
Năm 1947 Burlcholder đã phát hiện ra CAP từ môi trƣờng nuôi cấy xạ
khuẩn có tên là Streptomyces Veneduela. Chỉ hai năm sau ngƣời ta đã tổng hợp
đƣợc kháng sinh này. Dƣới tác động của của quá trình chuyển hóa, CAP có thể
chuyển hóa thành dạng D-threo-2-amino-(p-nitrophenyl)-1,3-propanediol và dạng
D-glucuronide. Gần 90% lƣợng CAP sẽ bài tiết bằng đƣờng niệu dƣới dạng chuyển
hóa, 15% bài tiết dƣới dạng ban đầu.
1.3 Phân bố
CAP đƣợc phân bố rộng khắp trong cơ thể từ tim, gan, phổi thận, lá lách,
huyết thanh, huyết tƣơng đến dịch màng phổi, dịch cổ trƣớng, tinh dịch, nƣớc bọt,
nƣớc tiểu. Nó có khả năng thẩm thấu nhanh qua dạ dày và phân tán nhanh trong cơ
thể. CAP cũng rất dễ hấp thụ vào cơ thể nên khi dùng CAP chữa bện hoăc thêm
vào thức ăn gia súc sẽ tồn dƣ trong thịt, sữa, trứng.
Khi thải vào môi trƣờng, CAP hiện diện dƣới dạng thể khí là chủ yếu. CAP
phát tán trong không khí chủ yếu bởi lắng khô, bám trên các lớp trầm tích và chất
lắng sinh học sống trong nƣớc. Khả năng thay đổi của CAP trong đất cao nhƣng nó
không bốc hơi, kể cá đất khô lẫn đất ẩm. Dƣới tác động phân giải của vi sinh vật,
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên 
3
CAP có thể bị phân giải trong đất và nƣớc. CAP cũng bị phân giải bởi các vi sinh
vật đƣờng ruột theo đƣờng phân hủy thành gốc amine. Sự hấp thu và bài tiết: CAP
đƣợc hấp thu qua hệ tiêu hóa, và đƣợc đƣợc bài tiết chủ yếu qua thận.
1.4 Cơ chế kháng khuẩn
CAP có thể xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và gắn với phần 50S của
Ribosom ức chế tổng hợp protein làm cho vi khuẩn không tổng hợp đƣợc protein
dẫn đến yếu đi và chết. Trong vi lập thể của động vật có vú cũng có Ribosom 50S
nên sẽ bị ảnh hƣởng. Điều này lý giải độc tính cao của CAP.

cơ thể trẻ sơ sinh có thể gây ra triệu chứng xanh tái dần rồi trị tim mạch và tử vong
(do chƣa có đủ men gan để khử CAP); suy tủy, phá hủy cấu trúc tủy xƣơng dẫn
đến thiếu máu, có thể dẫn đến tử vong; có thể tƣơng tác với AND, ARN dẫn đến
những sai lệch về di truyền; gây bạch cầu, giảm hồng cầu, sự thay đổi thành phần
máu xảy ra nếu hàm lƣợng CAP trong máu lớn hơn 25µg/ml; gây viêm lƣỡi, miệng
do thiếu vitamin B2 và PP, bồn nôn, ói, tiêu chảy.
Vì vậy việc xác định CAP trong thủy sản là cần thiết để tránh gây tác hại
cho ngƣời tiêu dùng.
1.6 Tiêu chuẩn
Bảng 1. 1: Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của CAP
Kháng sinh
Kí hiệu
Giới hạn phát hiện tối thiểu
EU
Mỹ
Nhật
Chloramphenicol
CAP
0.3 ppb
0.3 ppb
0.5 ppb

Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên 
5

GC-ECD
Tôm
1
Munns (1994)
LC-MS/MS ESI (-)
Tôm
<0.5
Pfenning (2002b)
LC-MS/MS
Tôm
0.08
Neuhaus (2002)
GC-ECD
Tôm
0.05
Ngoc Son (2002)
GC(NCI)-MS
Tôm
0.3

LC-MS/MS APCI (-)
Tôm
0.1

GC-MS/MS
Tôm
0.1
Impens (2003)
LC-MS/MS (ESI)
Tôm, cua

4. Ly tâm mẫu trong 5 phút tại 6000 rpm
5. Tách cặn và lặp lại bƣớc 2 đến 4
6. Kết hợp 2 dung dịch chiết từ ethyl acetate và sấy khô với rotovap tại 40
0
C
7. Hoàn nguyên với 1 mL acetonitrile, thêm 1 mL, lắc và loại bỏ lớp hexane
8. Thêm 1 mL hexane khác, lắc và loại bỏ lớp hexane
9. Sấy khô acetonitrile và hoàn nguyên với 10% acetonitrile trong 10mM
ammonium acetate
10. Lọc vào lọ đựng mẫu tự động
2.2.1.2 Cài đặt thiết bị
* Điều kiện LC
Cột: Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18, 3x 150 mm, 5 µm
Dung môi A: Nƣớc với 10 mM ammonium acetate
Dung môi B: Methanol
Gradient: 90/10 A/B 15 phút đến 70/30A/B
Nhiệt độ cột: 40
0
C
Thể tích mẫu: 20 µL
Tốc độ dòng: 0.5 mL/phút
* Điều kiện MSD
Ion hóa: APPI (Negative)
Chế độ quét: 100-400 m/z cho sự tối ƣu hóa
SIM ion: 321 m/z (M-H)
-
Nhiệt độ hóa hơi: 350
0
C
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên

9
* Điều kiện đầu dò MS/MS:
Nguồn tạo ion Turbo Spray
Kiểu tạo ion âm, kiểu scan: MRM
Điện thế ion hóa: 4200V
Nhiệt độ ống mao quản: 500
0
C
2.2.2.3 Kết quả:
* Định lượng CAP dựa trên phân mảnh ion:
CAP đƣợc xác nhận dựa trên phân ion phân tử m/z=321; hai ion xác nhận
m/z = 151,9 và m/z=256,9; và chúng đƣợc định lƣợng dựa trên m/z = 151,9.
 Đường chuẩn định lượng CAP
Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên 6 điểm chuẩn với các nồng độ chuẩn
0.1 ppb; 0.2 ppb; 0.3 ppb; 0.4 ppb; 0.5 ppb; 1 ppb.

Hình 2. 2: Đường chuẩn CAP (0.1 – 1 ppb)
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên 
10

Hình 2. 3: Phổ đồ ioin m/z 151.9 ở nồng độ CAP
Phƣơng trình đƣờng chuẩn y = 23596 x + 1270.2; đƣờng chuẩn có hệ số
tƣơng quan R
2
= 0.9939; giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp là 0.03 ng/g, hiệu
suất thu hồi của phƣơng pháp 87.93 – 116.80 %
2.2.3 LC/MS/MS ESI (-)

Cartridge: Strata – X
Điều kiện: 3 mL Methanol (1-2 mL/phút)
Cân bằng: 3 mL nƣớc (1-2 mL)
Nạp: Trích 10mL mẫu mô tôm (1 mL/phút)
Rửa: 3 x 1 mL nƣớc
Sấy: >10’’ Hg trong 5-10 phút để loại bỏ lƣợng nƣớc dƣ
Chiết: 3 x 1.0 mL Ethyl acetate (1mL/phút)
Dry down: khí N
2
ở 55
0
C
Hoàn nguyên: 500 µL Acetonitrile/ nƣớc (20:8)
* Điều kiện LC-MS/MS
Cột: Kinetex 2.6 µm C18, 50 x 2.1 mm
Pha động: A: 5mM Ammonium bicarbonate, B: Acetonitrile
Gradient:
Time B (%)
0.00 5
2.00 5
2.01 95
4.50 95
Tốc độ dòng: 0.4 mL/phút
Thể tích tiêm: 0.4 mL/phút
Nhiệt độ: 25
0
C
Mẫu: 1. CAP, 2 CAP-d5
Đầu dò: API 4000~ MS/MS, ESI-
Chế độ quét: MRM

13

Hình 2. 5: Lượng thấp nhất (0.1 ng/mL hoặc 0.01 ng/g của mô tôm) của tiêu chuẩn chiết
của CAP (321.2/152) và tiêu chuẩn nội chuẩn (326/157).

Mũi tạp chất tách tại 3.0 phút đƣợc tách tốt khỏi CAP và không ảnh hƣởng
đến việc định lƣợng. 0.1 ng/g CAP trong tôm dùng ống Strata-X SPE và cột
Kinetex C18 LC
Đƣờng cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn đƣợc dựng trong khoảng nồng độ từ 0.1
ng/mL đến 200 ng/mL bằng cách vẽ tƣơng đối (diện tích mũi của CAP/ diện tích
mũi của IS) so với nồng độ. Khoảng nồng độ này tƣơng ứng từ 0.1 ng/g – 20 ng/g
(0.01 – 20 ppb) trong mô tôm. Đƣờng cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn thì tuyến tính
trong khoảng hiệu chuẩn với giá trị của R
2
= 0.9998 (hình 2.6). Tại mức nông độ
tiêu chuẩn thấp nhất (0.1 ng/mL) tín hiệu nhiễu là 115.9 (hình 2.5), vì vậy giới hạn
định lƣợng (LOQ) đƣợc ƣớc lƣợng là ≤ 0.01 ng/mL, điều này tƣơng ứng từ ≤ 0.001
ng/g trong tôm hoặc ≤ 0.001 ppb.
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên 
14

Hình 2. 6: Đường cong tiêu chuẩn CAP từ 0.1 ng/mL đến 200 ng/mL.
Ion định lƣợng đƣợc dùng là 321.2/152. Phƣơng trình tuyến tính y =
0.2663x + 0.2169 với R

ECD cho phân tích CAP trong cơ tôm có LOD là 1 µg/kg (Munns, 1994)
GC kết hợp với MS, những kĩ thuật ion hóa thông dụng nhất là ion hóa hóa học
(CI) và electron impact (EI)
Ion hóa hóa học âm (NCI) cho số lƣợng mảnh vỡ ít. Tuy nhiên, ion phân tử
luôn nằm trong vùng phổ. Nhờ sự hiện diện của hai nguyên tử Chlorine trong phân
tử CAP, GC-MS trong NCI là một trong những kĩ thuật đáng tin cậy nhất, nó cũng
là phƣơng pháp thông dụng nhất cho việc xác định lƣợng dƣ của CAP. GC-MS
trong EI là chế độ ít nhạy nhất. Tuy nhiên, nó tạo phổ của những phân mảnh, vì
vậy có thể lƣu trữ dữ liệu điện tử cho mục đích tham khảo.
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên 
16
2.3.1 GC/MS/MS
[1]

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu

Phân tích GC-MS
2

Hình 2. 8: Quy trình chuẩn bị mẫu
Bên cạnh phát hiện với MS trong chế độ EI, CAP cũng có thể đƣợc xác định
bằng cách dung kĩ thuật ion hóa mềm NCI. Bởi vì nguyên tử Cl trong cấu trúc
phân tử, dẫn đến việc làm giảm giới hạn phát hiện so với việc cùng EI
Tiểu luận PP-PTCC Nguyễn Thị Bích Duyên 

90
0
C (giữ 1 phút)
280
0
C (20
0
C min
-1
)
280
0
C (giữ 15 phút)
Helium
0.91 ml min
-1
Bảng 2. 3: Thông số khối phổ cho phân tích CAP bằng GC-MS
2

Thông số
GCQ plus
Nhiệt độ nguồn ion
Nhiệt độ chuyển dòng
Khí tinh khiết (ion hóa hóa học âm)
Dòng khí tinh khiết
200
0



19
sau khi đồng phân hóa. Bởi vì TMS ether dễ bay hơi, sự bay hơi của MSTFA sau
khi đồng phân hóa rất quan trọng và không kéo dài hơn 8 phút. Khi phân tích trong
chế độ quét toàn bộ GC-MS
2
m/z 304, 322, 358, 394 và 340 đặc trƣng cho CAP
2.4. Phƣơng pháp Kít Elisa
[4]
:
Phƣơng pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên – kháng thể
(Enzyme – Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) là một công cụ hiệu quả cho
mục đích thử nghiệm sàn lọc. Tuy nhiên, có những yêu cầu khắt khe về LOD và độ
không đảm bảo đo và các tỷ lệ dƣơng tính giả và âm tính giả của xét nghiệm.
2.4.1 Tóm tắt quy trình
Kít thử ELISA: Kít thử của các hang R-Biopharm và TAPB
Quy trình chuẩn bị mẫu: Dƣ lƣợng CAP trong 3 g mẫu đƣợc trích ly bằng 6
mL ethyl acetate. Dịch chiết đƣợc cô đến khô ở 50
0
C dƣới dòng N
2
. Cặn khô đƣợc
hòa tan trong 1 mL đệm và làm sạch bằng 1 mL hexan. Hàm lƣợng CAP trong dịch
chiết đƣợc phân tích với kít thử ELISA
Bảng 2. 4: Kết quả tỉ lệ dương tính giả trên các mẫu

Quy trình thử nghiệm với ELISA: qui trình xác định hàm lƣợng CAP trong
dịch chiết trên ELISA tuân thủ theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi loạt thử
nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dƣơng để kiểm soát chất lƣợng