BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGỌ THỊ THU PHƯƠNGXÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
CEFADROXIL VÀ CEFOTAXIM
TRONG NƯỚC BẰNG SẮC KÝ LỎNG
KHỐI PHỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

môn Vật lý – Hóa Lý, Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất – Trường Đại học Dược
Hà Nội, cùng bạn bè và gia đình. Sự giúp đỡ quý giá đó là động lực giúp em có thể
hoàn thành tốt khóa luận của mình.
Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn DS. Lê Xuân Kỳ, người đã tận tình
hướng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu và tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này.
Em xin chân thành cảm ơn DS. Dương Thị Vân, DS. Nguyễn Thị Hạnh đã
nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ em hoàn thành khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh,
người đã tận tình chỉ bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong suốt quá trình thực
hiện đề tài và viết khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa
phân tích và Độc chất, Bộ môn Vật lý – Hóa lý – Trường Đại học Dược Hà Nội,
Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, động
viên em hoàn thành khóa luận.
Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015
Sinh viên

Ngọ Thị Thu Phương
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Công thức cấu tạo chung của các kháng sinh β- lactam 2
1.1.1. Kháng sinh Penicillin 2
1.1.2. Kháng sinh Cephalosporin 2

3.2.5. Độ đúng, độ chính xác của phương pháp 38
3.3. Bàn luận 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu
ACN
C18
ESI
HPLC
IS
LC - MS/MS

LOD
LOQ
MeOH
MS
R(%)
RSD
SD
SPE
S
pic
t
R

Giới hạn định lượng
Methanol
Khối phổ
Hiệu suất thu hồi
Độ lệch chuẩn tương đối
Độ lệch chuẩn
Chiết pha rắn
Diện tích pic
Thời gian lưu

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các nguyên liệu nghiên cứu 16
Bảng 3.1. Điều kiện phân mảnh của các kháng sinh 21
Bảng 3.2. Kết quả lựa chọn ion mẹ 23
Bảng 3.3. Các hệ pha động đã khảo sát 26
Bảng 3.4. Điều kiện chạy sắc ký lỏng khối phổ 31
Bảng 3.5. Bảng khảo sát độ thích hợp hệ thống 32
Bảng 3.6. Nồng độ dung dịch chuẩn gốc 35
Bảng 3.7. Khảo sát độ tuyến tính của dung dịch chất phân tích 35
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 39

1ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng kháng sinh luôn là vấn đề được nhiều người quan tâm và cũng là thực
trạng mà xã hội hiện nay đang phải đối mặt. Trong khi các kháng sinh mới ra đời
ngày càng ít, thì việc kháng các kháng sinh phổ rộng, tác dụng mạnh như quinolon,
các cephalosporin thế hệ mới ngày càng phổ biến và đe dọa sức khỏe con người.
Một trong những nguyên nhân gây ra tình trạng kháng kháng sinh là sự tồn dư của
kháng sinh và các chất chuyển hóa của chúng trong môi trường. Vì chỉ một lượng
rất nhỏ kháng sinh có mặt trong môi trường sống cũng giúp vi khuẩn sinh ra những
gen kháng thuốc. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các kháng sinh
và sự kháng kháng sinh trong môi trường nước đã trở nên phổ biến [7], [20], [30].
Cùng với việc kiểm soát sử dụng kháng sinh hợp lý, vấn đề kiểm soát nồng
độ kháng sinh thải ra môi trường tại các cơ sở sản xuất dược phẩm cũng cần được
quan tâm. Kháng sinh nhóm β-lactam là nhóm kháng sinh rất đa dạng và có phổ
kháng khuẩn rộng. Hiện nay, nhiều nhà máy, xí nghiệp dược đang sản xuất nhóm
kháng sinh này với các dạng bào chế khác nhau. Tuy nhiên, việc kiểm soát sự tồn
dư kháng sinh nhóm β-lactam trong nước thải ở các cơ sở sản xuất này vẫn chưa
được quan tâm đúng mức. Tới thời điểm hiện nay, ở Việt Nam mới có một số
nghiên cứu xác định dư lượng một số kháng sinh trong nước thải bệnh viện và nước
thải từ cơ sở sản xuất dược. [4], [11], [14].
Phương pháp xác định dư lượng kháng sinh hay sử dụng là HPLC với
detector khác nhau như UV-VIS, FLD, nhưng dùng nhiều nhất là LC-MS/MS. Để
có thể ứng dụng phân tích mẫu thực, phương pháp phân tích cần được xây dựng và
thẩm định. Do đó chúng tôi tiến hành bước đầu đề tài: “Xây dựng phương pháp
xác định Cefadroxil và Cefotaxim trong nước bằng sắc ký lỏng khối phổ” với
các mục tiêu:
1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích (điều kiện sắc ký, điều kiện MS)
để xác định Cefotaxim và Cefadroxil trong nước bằng LC-MS/MS.

OOH
H
H
R
3

Hình 1.2. Công thức chung của Cephalosporin [10]
Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic
(A7AC), dạng cấu trúc
3
-cephem,
3
mới đủ liên hợp điện tử với vòng β –lactam
để hợp chất có tác dụng sinh học.
Trong A7AC, các carbon bất đối C
(6)
và C
(7)
đều có cấu hình R, và hầu như
là nguyên nhân làm cho các Cephalosporin có tính hữu tuyền khá mạnh.
31.2. Tổng quan về các đối tượng nghiên cứu
1.2.1. Cefotaxim natri [5], [6], [10], [17], [21]
 Cấu trúc phân tử:

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của Cefotaxim natri [5]
 Danh pháp quốc tế: (6R,7R)-3-[(acetyloxy)methyl]-7-[[(Z)-2-(2-aminothiazol-4-
yl)-2-(methoxyimino)acetyl]amino]-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-

-

Lọ 0,5 g; 1 g; 2 g bột thuốc, kèm ống dung môi để pha.
- Lọ thuốc nước để tiêm tương ứng với 250 mg, 500 mg và 1 g cefotaxim.
 Một số nghiên cứu định lượng Cefotaxim:
- Trong Dược điển Việt Nam IV, phương pháp HPLC được dùng để định
lượng chế phẩm chứa cefotaxim với các điều kiện như sau [5]:
+ Pha động: Hòa tan 3,5 g kali dihydrophosphat (TT) và 11,6 g dinatri
hydrophosphat (TT) trong 1000 ml nước pH 7,0 và thêm 180 ml methanol (TT).
+ Điều kiện sắc ký:
Cột (0,25 mm x 4,6 mm) được nhồi octadecylsilyl silica gel dành cho sắc
ký (5 mm).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 235 nm.
Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
Thể tích tiêm: 10 ml
- Nghiên cứu của Từ Bình Minh và cộng sự (2009) đã xây dựng phương pháp
và đánh giá dư lượng của 4 nhóm kháng sinh, trong đó gồm 3 kháng sinh β-lactam:
Amoxicilin, Cephalexin và Cefotaxim. Nghiên cứu đã xử lý mẫu bằng kỹ thuật
chiết pha rắn và xác định dư lượng kháng sinh bằng LC - MS/MS. Nhóm tác giả đã
xây dựng được phương pháp với LOD của các kháng sinh β-lactam từ 0,7 - 20 ng/L.
Phương pháp này đã được sử dụng để đánh giá sự có mặt của các kháng sinh này
trong các mẫu nước từ một số nhà máy xử lý nước sông và nước biển tại Hồng
Kông [25].
- Nghiên cứu của tổ chức bảo vệ môi trường (EPA) Method 1694 (2007) về
xác định dược phẩm và các sản phẩm chăm sóc cá nhân (PPCPs) trong môi trường
mẫu bằng LC-MS/MS trong đó có kháng sinh Cefotaxim. Phương pháp này được
phát triển để phân tích trong dung dịch nước, môi trường rắn và dịch sinh học [28].
1.2.2. Cefadroxil monohydrat [5], [6], [21].
 Cấu trúc phân tử:
5

- Nhiễm khuẩn đường hô hấp: Viêm amidan, viêm họng, viêm phế quản - phổi
và viêm phổi thùy, viêm phế quản cấp và mạn tính, áp xe phổi, viêm mủ màng phổi,
viêm màng phổi, viêm xoang, viêm thanh quản, viêm tai giữa.
- Nhiễm khuẩn da và mô mềm: Viêm hạch bạch huyết, áp xe, viêm tế bào, loét
do nằm lâu, viêm vú, bệnh nhọt, viêm quầng.
- Các nhiễm khuẩn khác: Viêm xương tủy, viêm khớp nhiễm khuẩn.
6Với những trường hợp nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram dương, Penicilin vẫn
là thuốc ưu tiên được chọn, các kháng sinh Cephalosporin thế hệ 1 chỉ là thuốc
được chọn thứ hai để sử dụng
 Dạng bào chế:
Nang 500 mg; viên nén 1 g; dịch treo 125, 250 và 500 mg/5 ml.
 Một số nghiên cứu định lượng Cefadroxil:
- Trong Dược điển Việt Nam IV, sử dụng phương pháp HPLC để định lượng
chế phẩm chứa Cefadroxil với những điều kiện phân tích như sau [5]:
+ Pha động: Acetonitril - dung dịch kali dihydrophosphat 0,272% (4 : 96).
+ Điều kiện sắc ký:
Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh là octadecylsilyl
silica gel (5 mm).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm.
Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
Thể tích tiêm: 20 ml
- Đề tài nghiên cứu sinh của Trần Quang Hải: "Nghiên cứu xác định hàm
lượng một số chất hữu cơ trong dược phẩm và nước tiểu bằng phương pháp von-
ampe" đã nghiên cứu thành công phương pháp chiết pha rắn (SPE) sử dụng cột
chiết HLB xử lý nước tiểu xác định Ofloxacin và Cefadroxil bằng phương pháp
von-ampe xung vi phân và phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ [8].
1.3. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

khả năng làm giàu mẫu tốt, đặc biệt có ưu điểm là cơ chế chiết đa dạng phù hợp với
chất phân tích, tính chọn lọc tốt hơn. Tuy nhiên có nhược điểm là khó lưu giữ chất
phân cực mạnh, khó xây dựng được quy trình chiết tối ưu, lượng dung môi đã giảm
nhiều nhưng hãy còn lớn, giá thành của phương pháp còn cao.
1.3.2. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ: [12], [16]
Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là kỹ thuật phân tích chất dựa trên sự kết nối
giữa sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC) và phân tích khối phổ (MS). Về cơ bản, có
8thể coi sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detector khối phổ.
Trong phân tích khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được
chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích
hợp. Các ion tạo thành được đưa vào đo trong bộ phân tích khối của máy khối phổ.
Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu để chọn kiểu quét ion dương hoặc âm.
Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nên dùng phổ biến hơn.
1.3.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao [1], [3], [18], [24]
 Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao đổi
ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng.
 Nguyên tắc
Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và cho qua cột bằng một dòng
chất lỏng liên tục (pha động). Các chất tan là thành phần của mẫu di chuyển qua cột
theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất tan với
pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển qua cột khác nhau, các thành phần của
mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng.
1.3.2.2. Cơ sở lý thuyết của phương pháp khối phổ [2], [12]
- Phương pháp phổ khối lượng là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và

Tất cả quá trình này diễn ra trong hệ thiết bị chân không với áp suất giao động từ
10
-3
Pa đến 10
-6
Pa.

Hình 1.5. Cấu tạo thiết bị khối phổ
Trong đó:
(1) Bộ nạp mẫu (Inlet)
(2) Bộ nguồn ion hóa (Ion source)
(3) Bộ phận phân tích khối (mass analyzer)
4
5
3
2
1
10(4) Bộ phận phát hiện (Detector)
(5) Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)
 Bộ phận nạp mẫu (Inlet): Đưa các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hóa của
thiết bị khối phổ. Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của
cột sắc ký. Có hai phương pháp nạp mẫu chính, tuỳ thuộc vào trạng thái vật lý của
chất cần phân tích.
- Nạp mẫu trực tiếp : Với mẫu lỏng, mẫu được đưa vào buồng trung gian (áp
suất giảm) trước khi vào buông chân không của máy. Có thể tách phần hơi của mẫu
trắng bằng một màng bán thấm đưa thẳng vào buồng ion hóa. Dôi khi người ta nhiệt
phân mẫu, khí tạo thành được dẫn vào buồng ion hóa máy khối phổ hoặc dùng kết

ion hình thành có một điện tích và là ion kiểu (M+H)
+
trong chế độ phân cực
dương và kiểu (M-H)
-
trong phân cực âm. Kỹ thuật này phù cho việc ghép nối khối
phổ với sắc ký lỏng.
- Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Các ion hình thành ở nguồn ion hoá
có khối lượng m và điện tích z (tỷ số m/z được gọi là số khối) sẽ đi vào bộ phận
phân tích khối. Bộ phận phân tích khối có nhiệm vụ phân tách các ion có trị số m/z
khác nhau thành từng phần riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường trước
khi đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu. Một số bộ phân tích khối thường dùng :
- Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)
- Bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)
- Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser)
- Bộ phân tích từ (Magnetic analyser)
Trong nghiên cứu này sử dụng bộ phân tích tứ cực:
 Bộ phân tích tứ cực gồm có bốn thanh kim loại song song hình trụ được đặt
đối xứng hai bên đường đi của các ion; các cặp đối diện với nhau qua trục đối xứng
của các thanh điện cực được nối điện với nhau. Điện thế của hai cặp thanh điện cực
là đối nhau. Điện thế này là tổ hợp của một thành phần một chiều và một thành
phần xoay chiều. Các tứ cực đóng vai trò như một bộ lọc khối. Các ion hình thành
trong nguồn ion được truyền đi và tách bằng cách thay đổi thế đặt trên các điện cực.
Chỉ những ion có trị số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ lọc này.
 Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q
1
, Q
2
,
12

ion ban đầu đập vào một bề mặt chất bán dẫn tạo ra dòng các electron. Các electron
sau đó sẽ va đập vào một bề mặt phát quang và tạo ra các photon. Các photon này
được thu nhận và số lượng của chúng tỷ lệ với số lượng ion. Ưu điểm của phương
pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các
khả năng nhiễm bẩn.
 Một số chế độ thu phổ:
 Thu tín hiệu toàn phổ (SCAN)
Với chế độ SCAN, bộ phận phát hiện sẽ thu nhận được tất cả các mảnh ion
được tạo thành từ mẫu phân tích để cho khối phổ gồm tất cả các ion và tỷ lệ tương
13đối giữa. Chế độ này thường dùng để định danh hay phân tích cấu trúc khi chất phân
tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SCAN thường
được lựa chọn để khảo sát ion mẹ.
 Thu tín hiệu chọn lọc ion (Selected Ion Monitoring - SIM)
Trong chế độ SIM, bộ phận phát hiện chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion
đặc trưng cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được
lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư
viện phổ có sẵn. Ứng dụng chế độ này để định lượng khi đã biết mảnh ion đặc trưng
của chất phân tích.
 Thu tín hiệu chọn lọc ion hai lần (Selected Reaction Monitoring - SRM và
Multiple Reaction Monitoring - MRM):
Đối với máy khối phổ hai lần, 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được
sử dụng là SRM và MRM.
- Chế độ SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion đó, trong các mảnh
ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào bộ phận phát hiện.
- Chế độ MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi
lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ
MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ

thải bệnh viện. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn dùng cột
silicagel tự chế tạo và định lượng được các kháng sinh Ciprofloxacin, Norfloxacin,
Levofloxacin, Ofloxacin và Lomefloxacin có mặt trong nước thải bệnh viện bằng
HPLC với detector huỳnh quang. Điều kiện sắc ký: cột C16, nhiệt độ cột 50ºC, tốc
độ dòng 0,7ml/phút, bước sóng kích thích 278nm và bước sóng phát xạ 445nm.
Hiệu suất thu hồi trong nền nước thải đạt từ 80 đến 106% và giới hạn phát hiện
trong khoảng 0,5 đến 1,0 µg/L [4].
- Luận văn thạc sĩ Dược học của Trần Thị Thanh Huế (2013) đã xây dựng
phương pháp xác định dư lượng Cefixim có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược.
Đề tài sử dụng kỹ thuật HPLC, chiết với cloroform và acid hóa bằng HCl đến pH 3.
Điều kiện sắc ký: Cột Luna C18, detector DAD: λ = 285 nm, thể tích tiêm mẫu: 200
µl, nhiệt độ cột: 32ºC, pha động: methanol – dung dịch đệm phosphat pH = 3,2
15(dung dịch NaH
2
PO
4
40 mM, chỉnh pH bằng H
3
PO
4
). Giới hạn phát hiện là 6,68
ng/ml [11].
- Luận văn thạc sĩ Dược học của Nguyễn Văn Thuận (2014) đã xây dựng được
phương pháp xác định dư lượng 03 kháng sinh: Cefixim, Cefuroxim và Cephalexin
trong nước thải. Đề tài sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ và phương pháp chiết
pha rắn. Giới hạn phát hiện của các kháng sinh từ 0,58 – 1,22 ng/ml. Phương pháp
đã được sử dụng để phân tích các kháng sinh này trong mẫu nước thải nhà máy sản

94,37%, SKS: 0212190.02, nguyên trạng)
Viện kiểm nghiệm trung
ương (Việt Nam)
2 Cefotaxim natri (Hàm lượng: 92,19%, SKS:
QT232 010514, nguyên trạng)
Viện kiểm nghiệm trung
ương (Việt Nam)
3 Trimethoprim 13C3 (pyrimidin -4,5,6-13C3,
99%) 50 µg/ml MeOH
CLL (Hoa Kỳ)
4 Methanol dùng cho HPLC Merck (Đức)
5 Acetonitril dùng cho HPLC Merck (Đức)

6 Acid formic dùng cho HPLC Merck (Đức)

7 Na
2
EDTA Merck (Đức)
8 Acid hydroclorid đặc Trung Quốc
9 Nước cất hai lần Tinh khiết

2.1.2. Máy móc - trang thiết bị
- Máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent Technologies 6460 Triple Quad LC/MS,
Agilent (Mỹ)
- Cột Agilent SB C18 1,8 µm, 2,1 × 50 mm, (Mỹ)
- Bộ chiết pha rắn LiChrolut, Merck (Đức)
- Cột chiết pha rắn OASIS HLB Cartridge 200 mg, 6ml, Oasis (Mỹ)
- Thiết bị siêu âm Ultrasonic Cleaner Set, Wisd (Hàn Quốc).
- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510, Cyberscan (Mỹ)
- Máy lọc hút chân không.