BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
LỀ THÀNH LÂM
NGHIÊN CỨU XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
HÀM LƯỢNG TẠP DHA TRONG ARTESUNAT NGUYÊN
LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP bược SỸ KHOÁ 2000- 2005)
^ i
-
Người hướng dẫn: PGS.TS TRẦN ĐỨC HẬU
Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Dược
Thời gian thực hiện: tháng 10/2004-5/2005
Hà nội, tháng 5-2005
LỜI CẢM ƠN
Nhân dịp hoàn thành khoá luận tốt nghiệp cho phép tôi được bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành tới:
Thầy giáo PGS.TS TRẦN ĐỨC HẬU, chủ nhiệm bộ môn Hoá Dược đã
tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ của bộ môn Hoá
Dược đã giúp đỡ, khuyến khích, động viên tôi hoàn thành khoá luận.
Xin được cảm ơn sự giúp đỡ của các bộ môn Phân Tích, Vô Cơ, phòng thí
nghiệm Vật Lý trung tâm.
Cuối cùng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong
thời gian qua.
Hà Nội, tháng 5 năm 2005
Sinh viên
Lê Thành Lâm
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỂ 1
PHẦN 1: TỔNG Q U AN 3
1.1 Tổng quan về artesunat 3

2.1 Đối tưọng, hoá chất, thiết bị, nội dung và phưotig pháp nghiên cứu. 22
2.1.1 .Đối tượng 22
2.1.2Phương tiện, dụng cụ, hoá chất
22
2.1.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 23
2.1.4 Một số công thức sử dụng tính toán thống kê

23
2.2 Thực nghiệm và kết quả 24
2.2.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện sắc ký 24
2.2.2 Thử tính thích hợp của hệ thống
25
2.2.3 Đánh giá tính tuyến tính của phương pháp xác định DHA trong artesunat
nguyên liệu 27
2.2.4Tínli chính xác của phương pháp xác định DHA trong artesunat nguyên
liệu 28
2.2.5 Tính đúng của phương pháp xác định DHA trong artesunat nguyên
liệu 29
2.2.6 Tính đặc hiệu của phương pháp xác định DHA trong artesunat nguyên
liệu 31
2.2.7 Xác định giới hạn định lượng DHA theo phương pháp xây dựng

34
2.2.8 Xây dựng cách xác định DHA trong nguyên liệu artesunat khi không
có DHA chuẩn 35
2.2.9 Kết luận 38
Phần n i: Kết luận và đề xuất 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
CHỮ VIẾT TẮT
DHA :

ta còn rất nhiều hạn chế [12], [13], [14], [15], [16], Mặt khác artesunat lại đắt
nên rất dễ bị làm giả. Vì là thuốc điều trị sốt rét nên thuốc giả hay kém phẩm
chất rất nguy hiểm cho bệnh nhân. Theo một bài báo ở Đông Nam Á artesunat
bị làm giả rất nhiều. Mỗi năm thế giói có khoảng 1 triệu người chết vì sốt rét
trong đó có tới 200.000 người có thể cứu được nếu dùng đúng thuốc.
DHA là một tạp chất chính trong artesunat. Mặc dù DHA là một thuốc
điều trị sốt rét mạnh gấp 2 lần artemisinin nhưng tác dụng yếu hơn artesunat
2, 3 lần, DHA lại rất ít tan trong nước nên DHA là một nguyên nhân quan
trọng làm giảm hiệu quả điều trị của artesunat [21]. Vì vậy xác định và khống
chế hàm lượng DHA trong artesunat là rất quan trọng.
Trong điều kiện khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, kỹ thuật phân
tích HPLC đang được triển khai áp dụng rộng rãi ờ Việt Nam. Việc nghiên
cứu và thực hành phương pháp HPLC đối với một Dược sỹ là rất cần thiết.
Nằm trong mảng đề tài xây dựng phương pháp kiểm nghiệm artesunat
bằng phương pháp HPLC, trong khoá luận tốt nghiệp của mình tôi tham gia
cải tiến điều kiện sắc ký đã xây dựng trong khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ đại
học của Nguyễn Thanh Tùng (2004) để rút ngắn thời gian phân tích và xây
dựng phương pháp xác định giới hạn DHA trong artesunat nguyên liệu với
những mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu và sử dụng được máy HPLC để áp dụng phương pháp
HPLC vào kiểm nghiệm trong thời gian làm khoá luận.
2. Học tập cách nghiên cứu, trình bày một vấn đề khoa học.
3. Xây dựng được phương pháp xác định tạp DHA trong nguyên liệu
và đánh giá phương pháp vừa xây dựng.
PHẦN 1: TỔNG QUAN
I.ITỔNG QUAN VỂ ARTESUNAT
l.l.lC ông thức [1], [7].
CO OH
Công thức phân tử: CigHjgOg
Trọng lượng phân tử: 384.4

1.1.3 Tính chất
Tinh thể không mầu hay bột kết tinh trắng, không mùi, dễ tan trong
ethanol, aceton, cloroíorm, benzen, khó tan trong nước, kém bền trong môi
trường kiềm hay acid. [a]°25= +10°+ 14° [1], [26].
1.1.4 Tác dụng
Diệt thể phân liệt trong máu của mọi chủng ký sinh trùng sốt rét, đặc biệt
tốt với sốt rét thể não do p.falciprum, không diệt thể giao bào và không tác
dụng trên giai đoạn ngoại hồng cầu, cắt cơn sốt nhanh.
1.1.5 Dược động học
Sinh khả dụng đường uống: 24-64%, tj/2= 41phút bị giảm hoạt tính do
chuyển hoá qua gan; qua được hàng rào máu não và nhau thai; thải qua nước
tiểu: dạng deoxy [2].
1.1.6 Tác dụng không mong muốn: Nhẹ và thoảng qua: Rối loạn tiêu hoá,
đau đầu, hoa mắt, chóng mặt.
1.1.7 Chế phẩm: Có ba dạng: viên nén 50 mg artesunat, bột pha tiêm 60 mg
artesunat, thuốc đạn 50 mg artesunat [8].
1.1.8 Chỉ định: Điều trị sốt rét do p. falciparum, p. malaria, p. vivax, kể cả
p.falciparum đã kháng thuốc khác[2].
1.2 TỔNG QUAN VỂ TẠP DHA TRONG ARTESUNAT NGUYÊN
LIỆU
2.1. Tạp DHA và nguyên nhân gây tạp DHA trong artesunat nguyên liệu
Bản thân DHA là thuốc điều trị sốt rét mạnh hơn cả artemisinin. Tuy
nhiên, trong artesunat thì DHA lại được coi như là tạp chất, mặt khác DHA rất
ít tan, sinh khả dụng thấp, tác dụng kém hơn artesunat. Vì vậy nếu artesunat
lẫn nhiều DHA thì hiệu lực điều trị của thuốc sẽ giảm, đồng thời DHA còn là
chỉ thị cho mức độ tinh chế artesunat và cũng là yếu tố đánh giá bảo quản
thuốc [19], [21].
Nguyên nhân chính gây tạp DHA trong nguyên liệu artersunat:
- Tinh chế chưa tốt.
- Sản phẩm phân huỷ của artesunat trong bảo quản.

và vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch so sánh [1], [25], [28].
Nhận xét: Khi không có chuẩn tạp, người ta đã xem đáp ứng của tạp và
chất thử là như nhau.
♦ Sắc ký lỏng hiệu năng cao [1], [25], [28]
- Chuẩn hoá diện tích pic:
Pha dung dịch thử và tiến hành sắc ký, ghi diện tích của tất cả các pic trừ
pic dung môi và những pic có đáp ứng rất nhỏ (thường là những pic có đáp
ứng nhỏ hơn 0.1 % so với tổng diện tích các pic). Phần trăm diện tích của mỗi
pic được tính là phần trăm khối lượng mỗi chất có trong mẫu thử.
Phương pháp này cho kết quả khá chính xác nhưng đã xem đáp ứng của
các pic là như nhau khi nồng độ bằng nhau và tất cả các chất có trong mẫu thử
đều cho đáp ứng trên sắc ký đồ. Để xác định đúng hàm lượng phần trăm mỗi
chất (tạp chất) trong mẫu thử, cần xác định sự liên quan giữa tỉ lệ phần trăm
diện tích pic với phần trăm hàm lượng giữa các chất, thường xem hoạt chất có
tỉ lệ này bằng: 1. Vì vậy cần xác định hệ số biến đổi phần trăm diện tích pic ra
phần trăm hàm lượng (hệ số F). Khi đó phần trăm tạp được tính như sau:
% Tạp = -|í^ .lO O %
Ẻ Si-ß
i= ỉ
- So sánh với chuẩn tạp (khi chỉ cần xác định giới hạn cho phép của tạp).
Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn tạp có hàm lượng
bằng giới hạn quy định và ghi đáp ứng các pic. Diện tích pic tạp của dung dịch
thử tương ứng pic chuẩn tạp không được lớn hơn diện tích của pic chuẩn tạp.
- So sánh vói chuẩn của thử.
Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn, dung dịch này được
pha từ dung dịch thử, có nồng độ so với dung dịch thử bằng giới hạn cho phép
của tạp. Diện tích của bất kỳ pic tạp nào trên sắc ký đồ của dung dịch thử
không được lớn hơn diện tích pic chính của dung dịch chuẩn.
Nhận xét: Các phương pháp trên khi không có hệ số đáp ứng đã coi hệ số
đáp ứng bằng 1, trường hợp này rất khó xẩy ra,

Không được có hơn một pic có diện tích lớn hơn 1/2 diện tích pic chính
của c (< 0,5%).
Tổng diện tích các pic tạp (bỏ qua pic có diện tích nhỏ hofn hoặc bằng
0,1% diện tích pic chính của C) không lớn hơn 2 lần diện tích của pic chính
của c (< 2 %) [29],
Nhận xét: Phương pháp đã thừa nhận đáp ứng pic của các tạp chất và
artesunat là như nhau khi hàm lượng bằng nhau.
1.3 TỔNG QUAN VỂ PHƯƠNG PHÁP HPLC
1.3.1 Khái niệm về sắc ký và sác ký lỏng hiệu năng cao
a. Khái niệm về sắc ký: sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý
dùng để tách và phân tích các cấu tử của những hỗn hợp phức tạp dựa vào sự
sử dụng các quá trình sắc ký khác nhau trong các điều kiện động. Sự tách các
thành phần trong mẫu dựa vào sự phân chia khác nhau vào hai pha, là pha
động và pha tĩnh. Pha tĩnh có thể là chất rắn hay chất lỏng phủ trên nền chất
rắn. Pha rắn được nhồi trong cột hay tráng trên bản mỏng hay dàn thành film.
Pha động là khí hay chất lỏng. Sự tách là do hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay
loại cỡ [4].
b. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Phương pháp HPLC
là một phương pháp phân tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau của các
chất giữa hai pha không trộn lẫn với nhau. Trong đó, pha động là chất lỏng
được đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực cao của một bơm cao áp. sắc ký
lỏng dựa trên cơ sở là cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại cỡ
hay tương tác hoá học ở bề mặt [4].
1.3.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh là
yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ
thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì
ta có sắc ký phân bố. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi
ion.
Khi đặt chất phân tích lên pha tĩnh đầu cột rồi cho pha động liên tục đi

c.Hệ tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ
tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay)
hay microsyringe tiêm trong hệ tiêm mẫu tự động.
d. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao
Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký. Vì ở cột
xẩy ra quá trình tách các chất. Cột đóng vai trò rất quan trọng tới khả năng
tách các chất. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hoá chất, chịu được
áp suất cao đến vài trăm bar. Trong cột nhồi pha tĩnh của hệ sắc ký. Cột tách
có nhiều cỡ khác nhau, tuỳ theo mức độ và mục đích của quá trình sắc ký.
Một cách đại cương có thể chia ra 3 loại cột:
- Cột phân tích: dài 10-25 cm, đường kính 2-5mm.
- Cột bán điều chế: dài 5 0-1 00 cm, đường kính 5 - lOcm
- Cột điều chế: dài 100-150 cm, đường kính 10 - 50cm
e. Detector trong HPLC
Là bộ phận phát hiện các chất trong pha động từ cột sắc ký đi ra liên tục.
Đó là bộ phận thu nhận, phát hiện các chất hay hợp chất của chúng dựa theo
một tính chất hoá lý nào đó của chất phân tích. Thường có các loại Detector
sau:
- Detector UV- VIS.
- Detector huỳnh quang.
- Detector phổ phát xạ nguyên tử.
- Detector điện hoá, cực phổ.
- Detector đo thế.
- Detector đo độ dẫn điện
- Detector khúc xạ kế.
f. Bộ phận ghi tín hiệu: gồm có Recorder.
g. Hệ điều khiển: Computer.
1.3.5 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh
hưỏtig [1], [25], [28]

d. Tốc độ di chuyển tỉ đối của hai chất
Được đánh giá qua thừa số chọn lọc (select!vity-factor).
Để tách riêng hai chất thường chọn a = 1,05 - 2,0. Nếu a càng lớn 2 chất
tách nhau càng tốt, a nhỏ 2 chất khó tách nhau, nhưng a quá lớn thì thời gian
phân tích sẽ quá dài. Giá trị a phụ thuộc yếu tố quyết định t’jỊA và I’rb.
e. Độ phân giải (Resolution)
Là đại lượng đo mức độ tách 2 chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B).
_ tiỊg —tjị^ _ ~ f m ) _ -{(X — ] ) - K g
0,5.(ỊW^+Wg) Wo,5^+Wo5« 4.a(ỉ-K'„)
Như vậy Rs phụ thuộc vào:
+ Hiệu lực cột,
+ Thừa số chọn lọc a.
+ Thừa số dung lượng K’g.
- Rj. tối ưu > 1,5.
Có thể làm tăng Rs bằng cách:
Tăng N: Tăng chiều dài cột, giảm tốc độ dòng, cách này ít hiệu quả.
Tăng K’b: Thay đổi pha động làm Rs thay đổi lớn.
Tăng a: Thay đổi pha động hay pha tĩnh sẽ làm R, thay đổi lớn.
f. Hệ sỏ bất đối AF
w
2 d
Wqos là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao pic.
d là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong
phía trước ở 1/20 chiều cao pic[25].
Yêu cầu AF = 0,9 - 2,
Vai trò: AF càng gần 1 thì pic càng có dạng phân phối chuẩn Gauss nên kết
quả tính diện tích pic càng chính xác.
- Yếu tố ảnh hưởng:
Cột: Cột tốt AF sẽ tốt.
pH: Quyết định dạng tồn tại của chất tan từ đó có ảnh hưởng nên AF.

phân cực, chất phân tích thường là các chất ít phân cực.Trong sắc ký pha đảo
thì pha tĩnh ít phân cực còn pha động phân cực, chất phân tích có thể phân cực
hay ít phân cực.
Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC.
• Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký.
• Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định.
• Tính chất bề mặt ổn định.
• Cân bằng động học của sự tách phải xẩy ra nhanh và lặp lại tốt.
• Cỡ hạt phải đồng nhất.
Vì Silica là loại pha tĩnh hay dùng và un việt nên ỏ’ đây giới thiệu về một
số loại Silica:
• Silica trung tính, trên bề mặt còn có các nhóm OH phân cực (ưa nước).
Loại này sử dụng làm pha tĩnh cho sắc ký hấp phụ pha thuận để phân tích các
chất ít hoặc không phân cực.
• Silica đã Alkyl hoá, được điều chế bằng cách Alkyl hoá các nhón OH
trên bề mặt Silica bằng các gốc Alkyl - R của mạch Cacbon (C2, C8, C18)
hay các gốc Cacbon vòng. Do các nhóm OH thân nước được thay bằng các
gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực. Silica đã alkyl hoá được sử
dụng cho sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực
hay sắc ký cặp ion.
• Silica Sulfon hoá hay Nitro hoá để làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi
cation. Silica amin hoá dùng làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi anion.
b. Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động trong HPLC có thể chỉ là một dung môi hữu cơ hay hỗn hợp
của 2, 3 dung môi theo tỉ lệ nhất định. Pha động là yếu tố thứ hai quyết định
hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp, thời gian lưu tjỊ và hiệu quả tách.
Pha động có thể ảnh hưởng tới:
• Độ chọn lọc của hệ pha động.
• Thời gian lưu giữ của chất tan.
• Hiệu lực tách của cột.

Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính.
a. Định tính: Thời gian lưii của chất thử trên sắc đồ phải tương ứng với thời
gian lưu của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ. Tuy nhiên việc định tính đơn
thuần bằng HPLC không đảm bảo tính chắc chắn.
b. Sác ký điều chế: Qua quá trình sắc ký các chất được tách ra và dịch rửa
giải được hứng riêng rồi bốc hơi dung môi thu lấy chất.
c. Định lưọtig và xác định giói hạn tạp chất; sắc ký lỏng hiệu năng cao có
ứng dụng rất lớn trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp
chất.
Khi sắc ký, chất muốn phân tích được tách riêng ra khỏi hỗn hợp và được
định lượng dựa vào chiều cao hay diện tích của đáp ứng pic so với chất chuẩn.
Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong kỹ thuật HPLC là;
• Phương pháp chuẩn ngoại: Cả hai mẫu thử và chuẩn đều được tiến hành
sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó diện tích pic thu được từ mẫu thử được so
sánh với diện tích pic thu được từ mẫu chuẩn. Kết quả có thể được tính theo
cách chuẩn hoá một điểm hay từ đường chuẩn tuyến tính
• Phương pháp chuẩn nội
Là phưcttig pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ
hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu
thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai gọi là chuẩn nội.
• Phương pháp thêm chuẩn.
Phương pháp này được dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng của chất phụ
hay quá trình xử lý mẫu phức tạp. Mẫu thử được thêm một lượng chính
xác chất chuẩn. Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa trên sự
chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện
tích. Với phương pháp thêm nhiều lần ta có phương pháp thêm đường
chuẩn.
• Phương pháp chuẩn hoá diện tích pic.
Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều cấu
tử được tính bằng tỉ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của

trình tuyến tính là =kjXA + bj, B có phương trình tuyến tính y = kjXß + b2 thì
khi Ya = Yb Fß - Xạ/Xb = ki/kj + (bj- bi)/kiXB với Xß nằm trong khoảng khảo
sát ta tính được giá trị gần đúng của F.
- Cách 2: Xác định giá trị của độ hấp thụ riêng của từng chất và tính hệ
số đáp ứng dựa vào độ hấp thụ riêng. Ví dụ: có hai chất A và B, A được chọn
làm chất chuẩn có hệ số đáp ứng là 1, khi đó hệ số đáp ÚTig của B sẽ là: F =
E \ a/ E '. b.
- Cách 3: Tính hệ số đáp ứng dựa vào kết quả đo tại từng điểm rồi tính hệ
số hiệu chỉnh trung bình của các điểm. Ví dụ có 2 chất A và B trong đó A là
chất làm chuẩn ta phải tính hệ số hiệu chỉnh cho B. Kết quả xác định ở nồng
độ 100 % của A là Sạ, kết quả xác định của B ở 5 mức nồng trong khoảng
khảo sát tuyến tính là SiB, SjB, S3B, S4B, S5B ta lần lượt sẽ có FjB = S^/SiB, p2B =
F3B F4B “ F5B “ và Fji, = (F|b + p2B + F3B + F4B +
FjbVS (Ftb là hệ số đáp ứng tmng bình).
d. Xác định giói hạn định lương bằng HPLC

Trích đoạn Đánh giá tính tuyến tính của phương pháp xác định DHA trong artesunat

---