TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BÙI THỊ NGỌC HÂN

BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
HÀM LƯỢNG TRITERPENOID TỔNG TRONG NẤM
LINH CHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP UV – VIS

LUẬN VĂN ĐẠI HỌC
Ngành CỬ NHÂN HÓA HỌC
Mã ngành: 52440112 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Tên đề tài: Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid
tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV – Vis.
Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Ngọc Hân MSSV: 2102244
Lớp Hóa học – Khóa 36
Nội dung nhận xét:
Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp: Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:
Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

Những vấn đề còn hạn chế:

Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài: Kết luận, đề nghị và điểm: Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
Cán bộ hướng dẫn
Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Khoa Khoa học Tự Nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
Bộ môn: Hóa học 

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN



Cán bộ phản biện:
Tên đề tài: Bước đầu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng Triterpenoid
tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV – Vis.
Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Ngọc Hân MSSV: 2102244
Lớp Hóa học – Khóa 36
Nội dung nhận xét:
Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp: Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:
Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:

Những vấn đề còn hạn chế:

Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài: Kết luận, đề nghị và điểm: Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
Cán bộ phản biện
Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Khoa Khoa học Tự Nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
Bộ môn: Hóa học 


khảo từ nhiều nguồn tài liệu khác nhau và được ghi nhận từ những kết quả mà
tôi đã tiến hành khảo sát trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi xin cam đoan
các số liệu, kết quả được trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được
công bố trong những công trình luận văn trước đây.
Bùi Thị Ngọc Hân

Luận văn Đại học – Hóa học
Bùi Thị Ngọc Hân ii 2102244

LỜI CÁM ƠN

Để đạt được kết quả như hôm nay, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
toàn thể quý thầy cô bộ môn Hóa–Khoa Khoa Học Tự Nhiên. Các Thầy Cô đã
nhiệt tình truyền đạt những kiến thức chuyên ngành, cũng như những kinh
nghiệm thực tế, đây là hành trang vô cùng quý báu không chỉ để hoàn thành đề
tài tốt nghiệp mà còn hỗ trợ rất nhiều trên con đường sự nghiệp sau này.
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến cô Nguyễn Thị Ánh Hồng, cô đã
hướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình làm đề tài
và đã chỉnh sửa bài viết rất cẩn thận.
Xin cảm ơn cô Nguyễn Thị Diệp Chi đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều
kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Cảm ơn Công ty cổ phần Dược Hậu Giang đã cung cấp mẫu để tôi thực
hiện đề tài này.
Cảm ơn các thành viên của lớp Hóa học Khóa 36 đã chia sẻ và đồng
hành trên những chặng đường vừa qua.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình luôn là chỗ dựa vững
chắc cả về vật chất lẫn tinh thần.

Chân thành cảm ơn
BÙI THỊ NGỌC HÂN

ABSTRACT
The theme aims to servey the total triterpenoid content in some Lingzhi
samples that provided by Hau Giang Pharmaceutical Corporation and some
other samples are bought floating at the Can Tho city by the method UV–Vis
with standard substance is working Oleanolic acid concentration 100 ppm.
Proceed evaluation of analytical methods by constructing experiments is to
determine the linear range, accuracy, repeatibility, limit of detection and limit
of quantification. Base on that, were determined the total triterpenoid content
in ten Lingzhi samples. The research result show that the proposed method can
be applied to quantify the total triterpenoid content base on standard curve of
Oleanolic acid with correlation coefficient R = 0,9999, the accuracy of method
achieve 99,36%, the repeatibility has RSD less than 2%, LOD and LOQ are
about 0,3 and 0,9 ppm, respectively. Among the ten samples taken Lingzhi
analyzed, the no.2 contained most triterpenoid content (12361 mg/kg occupies
1.236% in the number of component in Lingzhi) and no.4 contained the lowest
concentration of triterpenoid (6649 mg/kg accounts for 0.665%). The result of
the study as a basis for evaluating the quality of Lingzhi are free to sold in the
current market, and help the cultivation of the best varieties Lingzhi at
industrical scale in our country today.
Keyword: the total triterpenoid, Lingzhi.

Luận văn Đại học – Hóa học
Bùi Thị Ngọc Hân v 2102244

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CÁM ƠN ii
TÓM TẮT iii
ABSTRACT iv
MỤC LỤC v

sóng siêu âm 25
2.2 Định lượng triterpenoid tổng trong nấm Linh chi bằng phương pháp
UV - Vis 26
2.3 Thẩm định phương pháp phân tích 27
2.3.1 Tầm quan trọng của việc thẩm định 27
2.3.2 Nội dung thẩm định 27
2.3.2.1 Độ tuyến tính (Linearity) 27
2.3.2.2 Độ đúng (Accuracy) 28
Luận văn Đại học – Hóa học
Bùi Thị Ngọc Hân vi 2102244

2.3.2.3 Độ lặp lại 29
2.3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) (Limit of detection) 29
2.3.2.5 Giới hạn định lượng (LOQ) (Limit of quantification) 30
Chương 3 THỰC NGHIỆM 31
3.1 Phương tiện nghiên cứu 31
3.1.1 Địa điểm và thời gian tiến hành 31
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị 31
3.1.3 Hóa chất 32
3.1.4 Thu mẫu 32
3.1.5 Qui trình chiết mẫu 33
3.1.6 Qui trình chuẩn bị mẫu phân tích 34
3.1.7 Hoạch định thí nghiệm 35
3.2 Kết quả thực nghiệm 35
3.2.1 Các thí nghiệm 36
3.2.1.1 Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 36
a. Thí nghiệm về xác định khoảng tuyến tính 36
b. Xây dựng đường chuẩn 37
3.2.1.2 Xác định độ đúng của phương pháp 38
3.2.1.3 Xác định độ lặp lại của phương pháp 39


Luận văn Đại học – Hóa học
Bùi Thị Ngọc Hân viii 2102244

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi
[9]
9
Bảng 1.2. Lục bảo Nấm Linh chi và các tác dụng trị liệu
[4]
11
Bảng 1.3. Các hoạt chất Triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh
chi (Lê Xuân Thám, 1996) 20
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 36
Bảng 3.2. Dãy dung dịch chuẩn làm việc của Oleanolic acid 37


Luận văn Đại học – Hóa học
Bùi Thị Ngọc Hân 1 2102244

MỞ ĐẦU

Ngày nay, xu hướng sử dụng các loại thảo dược thiên nhiên để trị bệnh
đã trở nên phổ biến, việc tìm kiếm những khả năng chữa trị từ các loại thảo
dược đã được tiến hành ở nhiều nơi trên thế giới. Trong đó, nấm Linh chi là
đối tượng nghiên cứu của nhiều quốc gia. Đặc biệt là các nước vùng Châu Á:
Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan,… .
Ở Trung Quốc, “Lục bảo Linh chi” đã được nghiên cứu rất nhiều và sử
dụng như là thảo dược quý để trị bệnh và có tác dụng như là bổ dưỡng, điều
hòa huyết áp, chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ, tăng trí nhớ, điều hòa hoạt động
tim mạch, hô hấp, lợi tiểu, bổ thận, trị đau nhức khớp xương, gân cốt…. Các
tác dụng của nấm Linh chi đã được khẳng định và xếp vào hàng “thượng
dược”, trị được bách bệnh.
Tại Việt Nam, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh ở
trong nước cũng như xuất khẩu ngày càng tăng. Các thành phần hóa học có
trong nấm Linh chi rất phong phú bao gồm các nhóm: Acid béo, Steroid,
Alkaloid, Protein, Polysaccharide,…. Trong đó thành phần có tác dụng dược
học đặc trưng cho nấm Linh chi phần lớn thuộc về nhóm triterpenoid. Trong
đó, các nhà nghiên cứu đã nhận định rằng triterpenoid có các hoạt tính sinh
học đáng kể như là: chống oxi hóa, bảo vệ gan, chống dị ứng, chống khối u,


Bùi Thị Ngọc Hân 3 2102244

Chương 1 TỔNG QUAN
1.1 Nấm Linh chi
1.1.1 Khái quát chung

Nấm Linh chi, viết theo kiểu phiên âm Trung Hoa là Lingzhi, tên Nhật là
Reishi, ở Hàn Quốc gọi là Youngzhi, tên khoa học là Ganoderma Lucidum, ở
Việt Nam nấm Linh chi còn có tên gọi là nấm Lim. Nấm Linh chi còn có
những tên khác như Tiên Thảo, nấm Trường Thọ, Vạn Niên Nhung. Gọi là
nấm nhưng khác với một số nấm ăn thông thường, nấm Linh chi có nhiều hình
dáng khác nhau, chẳng hạn: hình thận, gạc nai. Màu sắc của nấm Linh chi
cũng phong phú: đỏ, vàng, tím, đen, xanh, trắng. Nấm Linh chi thường phân
bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chúng thường phát triển trên giá thể là gỗ
mục hoặc các nguyên liệu có chất xơ
[1-2]
.
Trong sách “Thần nông bản thảo” cách đây khoảng 2000 năm thời nhà
Châu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc Lý Thời Trân phân
ra thành “Lục Bảo Linh chi” (thời nhà Minh) với các khái quát công dụng
dược lý khác nhau, ứng theo từng màu:
 Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi)
 Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi)
 Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi)
 Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi)
 Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi)
 Tử chi (Linh chi tím)
Cho đến nay nấm Linh chi không còn giới hạn trong phạm vi đất nước
Trung Quốc, mà mang tính toàn cầu. Hiện tại có khoảng 250 bài báo của các

Bộ: Polyporales
Họ: Ganodermataceae
Chi: Ganoderma
Loài: Ganoderma lucidum
1.1.1.2 Đặc điểm hình thái

Nấm Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi
xác lập thành một chi riêng là Ganoderma Karst (1881), đến nay tính ra có hơn
200 loài được ghi nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 loài. Nấm Linh
chi là một trong những loại nấm phá gỗ, nấm xuất hiện nhiều vào mùa mưa,
trên thân cây hoặc gốc cây
[2]
.
Nấm Linh chi (quả thể) gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến
đối diện với mũ nấm)
[4,5]
. Cuống thường đơn có khi phân nhánh, thẳng ít khi
cong quẹo, hình trụ hoặc trụ dẹt, nở rộng về phía mũ nấm, thường đính vào mũ
ở bên đôi khi ở gần tâm. Lớp vỏ cuống láng bóng, màu nâu đỏ–nâu đen, phủ
suốt đến một phần mặt trên mũ. Chất mô cuống chắc, dai; mặt cắt ngang
cuống thường chia làm 2 vùng phân biệt rõ bằng một vòng ranh giới cứng như
gỗ, vùng trong thường xốp và đầy những lổ nhỏ li ti, khắp trong cùng mỗi
vùng có những vệt nâu đen cứng như gỗ.
Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn dần có dạng thận, gần tròn, đôi khi
xòe hình quạt hoặc có hình dạng khác thường, dày ở gốc và mỏng dần về phía
mép, nơi đính cuống thường lõm xuống ít nhiều nhưng có khi gồ lên hay
phẳng. Mặt trên mũ nấm láng bóng khi không có bụi bào tử phủ lên, thường
màu nâu đỏ nhưng đậm nhạt khác nhau, đôi khi màu nâu vàng, nâu đất, nâu
Luận văn Đại học – Hóa học


nghiệp, Đại học Kyoto mới thành công trong việc gây giống và người ta mới
sản xuất được vị thuốc này một cách qui mô. Từ đó nấm Linh chi được trồng
và sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới.
1.1.1.4 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi

Để nấm Linh chi có thể phát triển tốt thì phải đầy đủ các điều kiện
[1]
:
 Dinh dưỡng
Nguồn cacbon: chủ yếu là đường glucose, saccharose, maltose, tinh bột,
pectin, lignin, cenlulose, hemicenlulose, từ đó chúng tổng hợp năng lượng và
tạo thành các chất cần thiết.
Nguồn nitơ hữu cơ: protein, pepton, acid amin, ngoài ra có thể hấp thu
ure, muối amon, sulphate amon. Tuy nhiên, Nitơ không được quá nhiều làm
cho sợi nấm mọc quá nhiều khó hình thành quả thể.
Luận văn Đại học – Hóa học

Bùi Thị Ngọc Hân 6 2102244

Trong giai đoạn sinh trưởng sợi nấm, tỉ lệ C/N là 25/1. Giai đoạn hình
thành quả thể, tỉ lệ là 30/1 hay 40/1.
Nguyên tố vi lượng: Ca, P, Mg, K.
 Nhiệt độ
Giai đoạn nuôi sợi, nấm Linh chi sinh trưởng tốt nhất ở 20–30°C.
Giai đoạn hình thành quả thể thì nhiệt độ thích hợp nhất là 22–28°C.
Nhiệt độ không nên thay đổi quá lớn, nếu thay đổi nấm Linh chi khó phát triển
thành tán mà ở dạng sừng hươu, dạng đuôi ngựa.
 Độ ẩm
Hàm lượng nước môi trường thường 65% là vừa, quá nhiều hoặc quá ít
sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm. Độ ẩm không khí giữ ở 85–95%,

nấm bằng chiếu xạ hoặc bằng các loại hóa chất khác nhau, kể cả chất chống
oxi hóa…. Nhưng thường ít hiệu quả và nhất là không kinh tế.
 Ưu điểm:
Giữ được màu sắc, mùi vị, sự thơm ngon, độ dinh dưỡng tối ưu nhất của
nấm trước khi đưa ra thị trường.
Không mất nhiều công sức, nhiều thời gian cho việc bảo quản, nên tiết
kiệm được chi phí bảo quản sau thu hoạch.
 Nhược điểm:
Thời gian lưu giữ, bảo quản rất ngắn, muốn duy trì sản phẩm có tuổi thọ sử
dụng tươi được cao hơn phải dùng hóa chất bảo quản, điều đó không tốt cho
sức khỏe người tiêu dùng và đôi lúc có sự biến đổi về chất và lượng của nấm.
Dễ bị sinh vật, côn trùng và các vi sinh vật xâm nhập và gây hại.
b. Bảo quản khô
Cũng giống như một số loại nấm khác, có thể bảo quản nấm Linh chi khô
trong thời hạn từ 6 tháng trở lên trong điều kiện khô ráo ở nơi thoáng mát.
Có 2 phương pháp để làm khô nấm Linh chi đó là phương pháp “phơi
nắng” và phương pháp “sấy khô” (dùng hơi nóng) để bảo quản.
Phương pháp phơi nắng
Là phương pháp làm khô nấm để bảo quản sử dụng nguồn năng lượng từ
tự nhiên là năng lượng mặt trời.
 Ưu điểm:
 Tiết kiệm chi phí và công sức
 Giảm tải cho máy sấy
 Bảo quản nấm lâu hơn, từ đó kéo dài thời gian sử dụng nấm
 Là giai đoạn làm khô nấm hiệu quả trước khi đưa vào máy làm
khô nấm hoàn toàn.
 Nhược điểm:
 Nấm Linh chi phơi nắng không tốt bằng sấy cả về màu sắc và
mùi vị
 Nấm phơi nắng dễ bị nhiễm mốc

trường hợp nấm hút ẩm trở lại.
1.1.1.6 Thành phần hóa học và đặc tính dược lý của nấm Linh chi

Viện nghiên cứu tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc nghiên cứu thành phần
hóa học của nấm Linh chi mọc hoang dại thấy
[4, 2]
:
 Nước 12–13%
 Hợp chất phenol 0,08–0,1%
 Lignin 13–14%
 Hợp chất có N 1,6–2,1%
 Tro 0,022%
 Xelluloza 54–56%
 Chất béo 1,9–2%
Luận văn Đại học – Hóa học

Bùi Thị Ngọc Hân 9 2102244

 Chất khử 4–5%
 Hợp chất steroid 0,14–0,16%
 Ergosterol (C
28
H
44
O).
Viện nghiên cứu kháng sinh Tứ Xuyên tìm thấy acid amin, protein,
saponin, steroid.
Học viện Y học Bắc Kinh phát hiện đường khử và đường kép acid amin,
dầu béo.
Theo những công trình nghiên cứu mới nhất của Viện nghiên cứu nấm

Trợ tim
Ganodosterone
Steroid
Giải độc gan
Lanosporeric acid A
Steroid
Ức chế sinh tổng hợp
Lanosterol
Steroid
Choesterol
Ganoderans A, B, C
Polysaccharide
Hạ đường huyết
Luận văn Đại học – Hóa học

Bùi Thị Ngọc Hân 10 2102244

D – Glucans
Polysaccharide
Chống ung thư, tăng tính miễn
dịch
D – 6
Polusaccharide
Tăng tổng hợp protein, tăng
chuyển hóa acid nucleic
Ganoderic acid R, S
Triterpenoid
Ức chế giải phóng Histamine
Ganoderic acid B, D, F,
H, K, Y

Năm 2001, Masao Hattori đã ly trích được 10 triterpenoid mới, bao gồm
Lucidumol A và B, các Ganoderic acid: A, B, E, F, H, K, Y và R. Trong đó
kiểu Lanostane triterpenoid có thành phần chính là lipophilic. Có khoảng 130
hợp chất được ly trích từ quả thể, hệ sợi và bào tử nấm Linh chi. Triterpenoid
có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống căn bệnh HIV, thành phần và hàm
lượng triterpenoid phụ thuộc vào nguồn giống và yếu tố môi trường
[2]
.
Hàng loạt các nghiên cứu của Shufeng Zhou chứng minh rằng
polysaccharide và triterpenoid của nấm Linh chi có khả năng chữa trị bệnh
viêm gan mãn tính, bệnh đái tháo đường loại 2 (type II diabetes mellitus)
[9]
.
He, Y.et al (1992) đã khảo cứu các BN3B–gồm 4 polysaccharide đồng
nhất có hoạt tính tăng miễn dịch. Trong đó BN3B1 được xác định là Glucan
(chỉ chứa Glucose) và BN3B3 là một arabinogalactan mang các liên kết
glucoside.
Hikino, H.et al từ 1985 đến 1989 chứng minh hoạt lực hạ đường huyết
của nhiều polysaccharide. Các heteroglycan có hoạt tính chống ung thư, các
ganoderan B có tác dụng làm tăng mức insulin trong huyết tương, giảm sinh
tổng hợp glycogen và giảm hàm lượng glycogen trong gan. Đây chính là cơ sở
trị liệu trên các bệnh nhân đái tháo đường.

Trích đoạn Khả năng chữa bệnh của nấm Linhchi Một số ứng dụng lâm sàng Phương pháp chiết triterpenoid trong dược liệu với sự hỗ trợ của Định lượng triterpenoid tổng trong nấm Linhchi bằng phương pháp Giới hạn phát hiện (LOD) – Giới hạn định lượng (LOQ )

---