Bài 1: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SHPT
Ngoài một số dụng cụ thường dùng cho tác thao tác vi sinh và hóa sinh, trong kỹ
thuật sinh học phân tử người ta còn sử dụng một số dụng cụ đặc trưng sau:
1. Sử dụng thiết bò:
Qui đònh chung:
• Không sử dụng bất kỳ một thiết bò nào khi chưa được hướng dẫn sử dụng. Chỉ khởi
động những thiết bò nào sắp sử dụng dưới sự hướng dẫn của ngưới trực tiếp quản lý
phòng thí nghiệm.
• Bao găng tay, khẩu trang, tóc cột cao (đối với những người tóc dài) để trách làm
nhiễm mẫu.
• Báo cáo ngay với người quản lý phòng thí nghiệm nếu phát hiện thiết bò nào hư
hỏng hoặc gặp sự cố khi vận hành. Đảm bảo các thí bò hoạt động trong tình trạng
tốt nhất.
• Lau chùi ngay các thiết bò khi sử dụng xong, nhất là trong trường hợp vương vãi
dung dòch hay hoá chất nào đó lên thiết bò.
2. Một số thiết bò thông dung trong SHPT
2.1 Micropipette(pipet man)
• Kiểm tra tình trạng hoạt động của pipetman
• Chỉnh về thể tích cần sử dụng. Thao tác xoắn vặn nútnê nnhẹ nhàng, trách
vặn quá nhanh hoặc vặn đi vặn lại nhiều lần làm hỏng răng của các
pipette.
• Chọn đầu típ thích hợp cho từng loại pipette:
Cỡ nhỏ: 1 - 10µl
Cỡ trung bình nhỏ: 10 - 100µl
Cỡ lớn: 100 - 1000µl
• Các đầu típ chỉ sử dụng một lần, sau đó phải được rữa sạch và hấp khử
trùng trở lại .
• n nhẹ nút vặ nđể đuổi hết không khí, cho đầu típ vào dung dòch và thả từ
từ để hút đúng lượng thể tích cần dùng.
2.2 ng eppendorf:
• Là ống bằng nhựa polyethylene hoặc polypropylene chứa thể tích nhỏ từ

• Pha loãng dung dòch từ dung dòch mẹ .
• Pha chế dung dòch từ các dd gốc:EDTA (Ethylenediamintetraacetic acid)
0.5M, TE (tris – EDTA), SDS (sodium dodecyl sulfate)…
3.2 Các bước pha chế dung dòch
• Chuẩn bò lọ đựng sạch, dán nhãn rõ ràng.
• Cân hóa chất đúng theo lượng cần dùng. Cho vào cốc thuỷ tinh với một ít
nước cất 2 lần và thanh khuấy từ. Đợi đến khi chất rắn tan hoàn toàn hoặc
các pha trộn lẫn đều vào nhau thành một pha duy nhất.
• Bổ sung nước cất cho đến thể tích xác đònh cuối cùng.
• Trường hợp cần agar hoặc agarose thì các chất đó được cân trực tiếp trong
cốc dùng cuối cùng.
• Chỉnh pH về điểm cần thiết (nếu có)
• Khử trùng dung dòch (nếu có)
• Kiểm tra độ trong, tạp chất và độ nhiễm lần cuối trứơc khi cho vào lọ vô
trùng để bảo quản hay sử dụng. Các dung dòch đệm và dung dòch chế phẩm
sinh học cần được bảo quản trong điều kiện lạnh và thời gian ngắn.
3.3 Cơ đặc dung dịch
• Các dung dịch DNA và ARN được cơ đặc với ethanol như sau:
• Đo thể tích dung dịch DNA và điều chỉnh theo nồng độ cation đơn giản trị.
Nồng độ cuối cùng phải là 2 – 2,5 M đối với amoni acetate; 0,3 M đối với
natri acetate; 0,2 M đối với natrichlorua và 0,8 M đối với lithichlorua.
• Ion được sử dụng thường phụ thuộc vào thể tích DNA và các ử lý tiếp theo;
như ta có thể dùng natri acetate ức chế phâ nđọan Klenow, ion amoni ức chế
T4 polynucleotide kinase và ion chlorua ức chế DNA polymerase phụ thuộc
Rnase.
• Bổ sung MgCl2 vào với nồnf độ cuố icùng 10mM giúp tủa các phân đoạn
DNA nhỏ và các oligonucleotide. Tiếp theo bổ sung các cation đơn hóa trị, 2 –
- 2 -
2,5 thể tích ethanol được bổ sung, hòa trộn đều và bảo quản lạnh hơặc -20
o

o
C là nhiệt độ dùng để bảo quản lâu dài các chế phẩm với điều kiện
trong môi trừơng có nồng độ muối hơn 1M, có mặt của EDTA (hơn 10mM)
ở pH = 8,5: hoặc bảo quản trong dòch nổi CsCl với EtBr trong tối ở 5
o
C.

- 3 -
BÀI 2 TÁCH CHIẾT DNA TỪ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
1. Nguyên tắc:
Việc thu nhận DNA từ tế bào gan động vật được tiến hành theo 2 bước:
• Bước 1: Cô lập nhân chứa DNA.
Người ta thường chọn tế bào mô gan làm vật liệu thu nhận DNA vì tế bào gan
tương đối đồng nhất về kích thước, thích hợp cho việc phân đoạn bằng kỹ thuật ly tâm.
Tế bào được phá vỡ bằng phương pháp hoá học, cơ học hay sóng siêu âm…, trong điều
kiện có dung dòch sinh lý thích hợp và nhân (chứa DNA) đựơc thu nhận dựa vào sự
khác nhau về khối lượng của chúng.
• Bước 2: Tách chiết DNA
Tiến hành loại bỏ các tạp chất dựa trên tính hoà tan khác nhau của chúng đối
với các dung môi hữu cơ. Các tác nhân thường dùng như:
 Phenol: chất làm biến tính mạnh protein và không hòa tan acid
nucleic.
 Chloroform: đi kèm với phenol, cũng có tác dụng biến tính
protein dù yếu hơn phenol và đồng thời loại bỏ hoàn toàn vết
phenol.
 Isoamyalcohol: Làm giảm bọt, ổn đònh hai pha nước và
chloroform sau ly tâm.
 Isobutanol: có tác dụng tách các phân tử hữu cơ như ethidium
bromide và làm đậm đặc dung dòch nucleic acid.
Để thu được tủa DNA tinh sạch từ dòch chiết trên, có thể tiến hành tủa bằng các

Thu nhận dịch đồng nhất
Cắt 30 g thành từng miếng nhỏ, hco vào bình chứa giữa trong đá. Phá màng tế bào
bằng phương pháp cơ học nghiền các miếng gan bằng máy xay trong 70 ml dung dịch S1
lạnh trong 2 phút. Trong lúc nghiền, bình chứa vẫn được giữ lạn htrong đá. Sau đó, dịch
nghiền được lọc qua vải lọc, phần dịch đồng nhất được thu nhận lại trong bình chứa sạch,
cũng được giữ trong đá.
- Thu nhận phân đọan nhân
Tiến hành ly tâm 1 nhằm loại bỏ trong phần dịch nổi những bào quan nhỏ và nhẹ
như ti thể, không bào… Trong lần ly tâm 2, còn gọi là ly tâm trên đệm saccharose, chỉ có
nhân - bào quan có tỉ trọng cao nhất là có thể di chuyển xuyên qua lớp đệm saccharose
đậm đặc để lắng xuống đáy ống ly tâm trong thời gian và lực ly tâm đã tính toán.
Các chất tẩy (detergent) sử dụng gồm hai loại: Chất tẩy nhẹ (triton X 100) và chất
tẩy mạnh (SDS). Trước tiên, chất tẩy nhẹ phá vỡ màng hồng cầu; nêu không có công
đọan này thì hồng cầu sẽ cùng lắng với nhân trong lần ly t6am 2. sau khi đã thu nhận
phân đọan nhân mới dùng chất tẩy mạnh để phá màng nhân.
- Quy trình
Mỗi nhóm nhận 1 ml dung dịch đồng nhất trong ống eppendorf 2 ml(có ghi tên
tiểu nhóm).
Thêm 1 ml dung dịch S1, trộn đều bằng cách đảo ống.
Ly tâm 2000 vòng / phút trong 5 phút.
Hút dịch nổi bằng pipette pasteur.
Huyền phù hóa phẩn cặn trong 0,9 ml dung dịch S1 + triton X 100 1% bằng cách
dùng pipette pasteur hút và nhả trong khỏang 2 phút.
Cho 0,9 ml dd S2 vào một ống eppendorf 2 ml sạch.
Dùng pipette pasteur hút lớp cặn đã huyền phù nằm cho chảy chậm dọc theo
thành ống ống eppendorl sao cho lớp cặn huyền phù nằm trên lớp S2 tạo thành hai pha
không hòa lẫn nhau.
Ly tâm 2000v/p trong 5 phút.
Hút bỏ dịch nổi. Thu nhận phần cặn chứa phần lớn là nhân, đây là phân đọan nhân
tương đối thuần khiết.

260
(1)
Công thức (1) được áp dụng tính hàm lượng của ADN sợi đôi. Đối với ADN biến tính sợi đơn
hay ARN, oligonucleotid thì độ hấp thụ ở bước sóng 260nm tăng lên và được tính bởi công thức
sau:
Hàm Lượng ARN hay ADN sợi đơn (ng/µl) = 40× HSPL×OD
260
(2)
Hàm lượng oligonucleotid (ng/µl) = 20× HSPL×OD
260
(3)
Trong đó
HSPL : hệ số pha loãng
OD
260
: chỉ số đo được ở bước sóng 260nm
OD
280
: chỉ số đo được ở bước sóng 260nm
1.2 Đo độ tinh sạch của ADN
Trong mẫu ADN thường có lẫn phenol và protein. Những tạp chất này làm tăng độ
hấp thụ ở bước sóng 280nm vùng tử ngoại. Vì vậy độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid
được đánh giá bằng tỉ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai bước sóng 260nm và 280nm.Được
tính bằng công thức sau:
Độ sạch nucleic acid = OD260/OD280 (4)
Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 đến 2 thì dung dịch ADN được xem là tinh sạch.
Tỉ lệ này thấp hơn 1,8 chứng tỏ mẫu có lẫn tạp chất. Đối với dung dịch ADN sợi đôi, nếu tỉ
lệ quá lớn thì chứng tỏ ADN có chứa trong mẫu bị biến tính hay bị phân hủy.
1.3 Hiệu ứng siêu sắc (hyporchromic effect)
Hiệu ứng siêu sắc là độ hấp thụ ở bước sóng của ADN tăng lên khi ADN biến tính

Kết quả
Kết quả đo OD260 và OD280 của các mẫu ADN
Bước sóng ADN không biến tính ADN biến tính ADN phục hồi sau biến tính
260nm
280nm

- 8 -
Bài 4 TÁCH CHIẾT TÒAN PHẦN RNA CỦA VI KHUẨN
1. Nguyên tắc:
Việc tách chiết RND cũng bao gồm các bước cơ bản như đối với DNA. Nhưng do RNA dễ
bị thủy giải bới Rnase, khó đảm bảo nguyên vẹn trong quá trình tách chiết nên trong thao tác cầ
ntuân thủ một số nguyên tắc chung.
Sử dụng các chất có khả năng biến tính mạnh protein như guanidium thiocyanate để ức chế
Rnase. Sử dụng nước đã qua xử lý với DEPC (Diethypyrocarbonate) để loại RNase.
Sử dụng phenol pH = 4 để ức chế Rnase, loại protein và DNA.
Thao tác trong điều kiện nghiêm ngặt tối đa: lạnh, mang găng tay, thao tác trong tủ cây vô
trùng.
Chất lượng của RNA tòan phẩn tách chiết sẽ được đánh giá sơ bộ qua điện di trên gel
agarose.
2. Vật liệu hóa chất
• Vi khuẩn Escherichia coli
• Trizol (phenol pH4, guanidium thiocyanate, glycerol, sodium acetate)
• Chloroform : isoamylacohol
• Isopropanol
• Ethanol 70%
• Nước đã xử lý với DEPC
3. Dụng cụ - thiết bị
• Pipetman 1000µl, 200µl, 10µl và các tip tương ứng
• Eppendorf 1,5µl
• Máy ly tâm

và còn có thể tách riêng từng phân tử ADN có kích thước khác nhau một nucleotid. Tùy theo kích
thước đối tượng ADN muốn tách mà ta có thể pha gel với các nồng độ khác nhau.
Nồng độ Agarose Kích thước phân tử ADN cần phân li (bp)

0.6% 1000 - 20000
0.7% 800 - 10000
1% 500 - 7000
1,2% 400 - 6000
1,5% 200 - 3000
2,0% 100 - 2000
Gel polyacrylamide cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đọan DNA sợi đơn có
kích thước dưới 500 bp, hiệu quả phân tách có thể đạt 1 Nu. Sau khi phân tích điện di xong, tiến
hành nhuộm ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát
hùynh quang dưới tia tử ngọai. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đọan DNA trên gel với việc
sử dụng thang mẫu DNA chuẩn(DNA LADDER). Các thang mẫu thường sử dụng như λ - Hind III
hay φX 174-Hae III.
Vật liệu – hóa chất
• DNA bộ gan động vật
• DNA plasmid pGEM3
• Thang DNA chuẩn λ-hind III
• Agarose
• Dung dịch điện di TAE 1X (pha lõang từ TAE 50X)
Đệm điện di TAE 1×
- Tris base 0,4M 44,8g
- Acetic acid 0,2M 11,4g
- EDTA 0,01M 20,0ml
Định mức đến 1000ml
• Dung dịch nạp mẫu 6X:
- Glycerol 30%
- Brommophenol Blue 0,25%

cắt hạn chế HinIII. Kích thước của các phần tử có trong thang được
biểu diễn ở hình bên.
• Pipetteman 10µl
• Eppendorf 1,5 ml; 2,0 ml
• Bàn đèn UV
• Lò viba
• Máy lắc ổn nhiệt.
3. Quy trình:
• Chuẩn bị gel agarose
- Cân 1g agarose vào 1 erlen 250ml (đối với gel agarose
1%)
- Thêm vào vừa đủ 100ml dung dịch TAE 1X.
- Làm tan agarose bằng cách đun trong lò viba. Bao miệng
hình tam giác bằng nilông rồi đun nóng trong lò viba 30
giây, lắc cho gel tan hoàn toàn. Nếu chưa tan hoàn toàn
thì lại làm tiếp như trên cho đến khi gel tan hoàn toàn.
Chú ý không để cho gel trào ra miệng bình ra ngoài vì gel agarose nóng chảy gây
bỏng rất nặng. Để nguội dung dịch agarose đến khỏang 50 - 55
o
C.
- Trong lúc chờ agarose nguội, chuẩn bị bản điện di.
- Đổ agarose lỏng vào bản điện di và lắp lược.
- Khi agarose đã đông đặc hoàn toàn, đặt bản điện di vào bồn điện di và tháo lược ra.
đổ đệm vào buồng điện di. Đổ cho đến khi mức dung dịch đệm cao hơn mặt bản gel
khoảng 1cm
• Chuẩn bị đặt mẫu:
- Trong một ống eppendorf 1,5ml, cho vào 10µl mẫu và 2µl dung dịch nạp mẫu, trộn
đều bằng pipetman.
- Dùng pipetman bơm mẫu và thang DNA chuẩn vào các giếng. thường người ta
không sử dụng 2 giếng ngoài cùng.

Mồi là đoạn ADN ngắn khoảng trên dưới 20 nucleotid có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu
mạch khuôn ADN có mang một đầu 3'-OH tự do giúp ADN polymerase khởi đầu sự tổng hợp một
chuỗi mạch mới. Khi cung cấp hai mồi chuyên biệt: mồi xuôi (sens primer) và mồi ngược (antisens
primer) để bắt cặp bổ xung với hai đầu của một trình tự ADN thì sau nhiều chu kì thì ta thu được
sản phẩm chủ yếu là đoạn ADN nằm giữa hai mồi. Kết quả phản ứng PCR phụ thuộc nhiều vào
đoạn mồi được thiết kế.
Mồi thiết kế phải tuân thủ theo các nguyên tắc sau:
- Mồi thường khoảng trên dưới 20 nucleotid và có lượng GC vào khoảng 50-60%.
- Tm của mồi xuôi và ngược không khác nhau quá xa.
- Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp
lại trên gen.
- Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ xung giữa mồi xuôi và mồi
ngược và cũng không có những cẩu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ xung giữa các phần khác
nhau của một mồi.
Muốn thực hiện được phản ứng PCR thì nhiệt độ annealing phải thấp hơn nhiệt độ Tm của mồi.
• Cách tính nhiệt độ Tm. Có nhiều cách tính nhưng ở đây người ta thường dùng cách tính
đơn giản sau:
Tm= 4(G+C) + 2(A+T) + 35 - 2n
- n: tổng số nucleotid
- G, C, A, T: tổng lượng các nucleotid G, C, T, A
Cách tính này đúng với các đoạn mồi từ 16 đến 35 nucleotid
1.3 Tag polymerase
Được chiết tách từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquticus sống ở suối nước nóng. Enzyme Tag
Polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của các acid nucleotid và có khả năng xúc tác
phản ứng tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình.
- 12 -
2. Hóa chất và dụng cụ
2.1 Hỗn hợp Primer
Nồng độ 2.5 pmol/µl
Nhân dòng đoạn ADN dài 967bp có chứa gen rnhA

- Tiến hành quay li tâm ở tốc độ10000rpm, trong vòng 5 phút, sau đó lấy phần nước dịch lỏng
có chứa ADN đem đi nhân dòng.
3.2 Phản ứng PCR
Thiết lập chương trình cho máy PCR
Step1. 94 độ 1min (Biến tính ADN)
Step2. 98 độ 20 sec (Tách ADN sợi đôi thành sợi đơn)
Step3. 60 độ 20 sec (Mồi bắt cặp với sợi khuôn)
Step4. 68 độ 1min (Phản ứng kéo dài)
Step5. lặp lại Step2 đến Step4 29 lần
Step6. 72 độ 10min ( Tổng hợp nốt các đoạn chưa được hoàn chỉnh)
Step7 4 độ ∞
Pha chế dung dịch phản ứng (Dung dịch phản ứng phải được pha chế trên đá)
- 13 -
- Hút 45µ l hỗn hợp phản ứng PCR vào trong ống eppendof 0.2ml. Sau đó cho 4µl dung dịch
hỗn hợp primer. Cuối cùng cho 2µl dung dịch mẫu đã được xử lí ở trên.
- Lắc nhè và quay li tâm cho dung dịch phản ứng chảy hết xuống đáy không còn bám trên
thánh ống ( Spin down)
- Đặt eppendof và máy PCR
- Khởi động chương trình (khoảng từ 1 đến 2 tiếng)
3.3 Điện di sản phẩm sau phản ứng-Điện di trên gel Agarose (0.8%)
- Gel pha trong dung dịch đệm điện di 0.5×TBE rồi đun nóng bằng lò vi sóng cho đến khi gel
được nóng chảy hoàn toàn.
- Trong khi để cho gel nguội đến 50 độ, tiến hành lắp dụng cụ điện di. Sau khi gel nguội đổ
gel vào khuôn gel có cắm lược và chờ cho gel đông tụ hoàn toàn.
- Sau khi gel đông tụ rút lược đổ đệm điện di ngập bản gel 1-2mm
- Pha 2µl ADN mẫu + (1µl thuốc nhuộm) + 7µl nước cất tuyệt trùng. Dùng pipetman tra hỗn
hợp mẫu và 2µl maker vào từng giếng gel.
- Chạy điện di với hiệu điện thế 80V trong vòng 30 phút.
- Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong vòng 30 phút.
- Soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.