TRỊNH ĐÌNH KHÁ – Kết quả tinh sạch và nghiên cứu một số đặc tính của enzyme cellulase 71

KẾT QUẢ TINH SẠCH VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME
CELLULASE TỪ CHỦNG NẤM SÒ PLEUROTUS SAIJOR-CAJU
Trịnh Đình Khá và Trần Thị Trà
Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên
Tác giả liên hệ: Trịnh Đình Khá – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên
Tel. 0280. 3746.985; Mobil: 0983.034.876; Email:

ABSTRACT
Results purification and study some properties of the enzyme cellulases
from Mushroom Pleurotus saijor-caju
A cellulase from basidiomycetes Pleurotus saijor-caju was purified 1.94-fold to homogeneity
throughout 90% (v/v) acetone precipitation and gel filtration Sephadex G-100. Purified
cellulase had a specific activity of 0.725 U/mg. Optimum temperature and pH were 45°C and
5.5, respectively. The enzyme was stable in pH range 4.5-5.5 with a residual activity of over
56% for 8 hours treatment. The metal ions Ag
+
, Mg
2+
, Mo
2+
, Na
+
, Fe
2+
, Pb

Cellulase có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất thức ăn chăn nuôi, sản
xuất bia, bột giấy, ngành công nghiệp chất tẩy rửa, ngành công nghiệp dệt may, nhiên liệu và
hóa chất, quản lý chất thải và xử lý ô nhiễm (Bhat, Bhat, 1997; Ole và cs., 2002). Do có ứng
dụng lớn trong công nghiệp, cellulase đã được tinh sạch và đánh giá tính chất từ nhiều chủng
vi nấm như Aspergillus aculeatus, A. nidulans, A. niger, A. terreus, Trichoderma reesei (Chen
và cs., 2001; Ali, El-Dein, 2008; Gao và cs., 2008; Elshafei và cs., 2009) và một số chủng
nấm đảm: Laetiporus sulphureus, Flammulina velutipes, Fomitopsis pinicola, Phanerochaete

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 32 – Tháng 10 – 201172

chrysosporUm, Vollvariella volvacea (Henriksson và cs., 1999; Ding và cs., 2001; Hong và
cs., 2001; Kenji và cs., 2008; Joo và cs., 2009).
Ở Việt Nam đã có những nghiên cứu về enzyme cellulase và ứng dụng enzyme này trong chăn
nuôi và một số lĩnh vực khác. Năm 2007, Trịnh Đình Khá và cộng sự đã tinh sạch và nghiên
cứu đặc tính của enzyme cellulase, đồng thời tối ưu môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme
này từ chủng nấm PenicillUm sp. DTQ-HK1 (Trịnh và cs., 2007a, b). Năm 2010, Nguyễn Hữu
Quân và Quyền DT đã tinh sạch và nghiên cứu đặc điểm của enzyme cellulase từ chủng
Aspergillus oryzae VTCC-F045 (Nguyen, Quyen, 2010a); Nguyễn Văn Tuân và cộng sự đã tinh
sạch, nghiên cứu đặc điểm của cellulase từ chủng Aspergillus awamori VTCC-F099, đồng thời
đã tối ưu môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme này (Nguyen, Quyen, 2010b, c). Tuy
nhiên, những nghiên cứu về cellulase từ các chủng nấm đảm còn hạn chế.
Trong bài báo này chúng tôi tiến hành tinh sạch và đánh giá tính chất của cellulase từ chủng
nấm sò Pleurotus saijo-caju làm cơ sở định hướng ứng dụng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi
và những ứng dụng khác.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chủng giống và môi trường nuôi cấy
Chủng Pleurotus saijor-caju do Công ty nấm Sông Hồng – Viện Di truyền Nông nghiệp cung

Phản ứng giữa enzyme và cơ chất được thực hiện với các nồng độ cơ chất CMC khác nhau từ 0,2-
2% pha trong đệm acetate 0.1M, pH 5,6. Hoạt độ enzyme được xác định sau 15 phút phản ứng ở
30°C. Hằng số động học V
max
và K
m
được xác định dựa trên phương trình Lineweaver – Burk.
Xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu
Hỗn hợp phản ứng của dịch enzyme với cơ chất 1% (w/v) CMC pha trong đệm acetate 0.1M,
pH 5,6 được thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng 30-60°C, trong 15 phút để tìm
nhiệt độ phản ứng tối ưu.
Xác định pH phản ứng tối ưu
Hỗn hợp phản ứng giữa dịch enzyme với cơ chất CMC 1% pha trong đệm acetate 0,1M, pH từ
4 - 8,0 được thực hiện ở 45°C trong 15 phút.
Xác định độ bền nhiệt độ
Dịch enzyme được ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30°C - 60°C, sau các khoảng thời gian 0- 8
giờ, tiến hành xác định hoạt độ còn lại của enzyme theo phương pháp trên.
Xác định độ bền pH
Dịch enzyme ủ trong các đệm có pH thay đổi trong khoảng 3-8, nhiệt độ 45°C, sau các
khoảng thời gian 0-8 giờ xác định hoạt độ còn lại của enzyme.
Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ của enzyme
Dịch enzyme được ủ cùng với muối của các ion kim loại: Ag
+
,Mg
2+
, Mo
2+
, Na
+
, Fe

(mg)

Hoạt độ tổng
(U)

Hoạt độ riêng
(U/mg) Hiệu suất thu
hồi (%)

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 32 – Tháng 10 – 201174

Dịch enyme thô 1,467 0,548 0,374 100
Dịch enzyme tủa 1,013 0,490 0,484 89,41
Dịch enzyme tinh sạch 0,12 0,087 0,725 15,86
Những nghiên cứu trước đây cho thấy: cellulase của chủng L. sulphureus var. miniatus sau
tinh sạch có độ sạch 16 lần và hiệu suất thu hồi đạt 5% (Hong và cs., 2009); của chủng V.
volvacea sau tinh sạch có độ sạch 42 lần và hiệu suất thu hồi 1,5% (Ding và cs., 2001); của
chủng P. byssoides sau tinh sạch có độ sạch 4,5 lần và hiệu suất thu hồi 27% (Chao và cs.,
2007). Như vậy, cellulase nghiên cứu có độ sạch thấp hơn nhưng hiệu suất thu hồi enzyme
cao hơn những nghiên cứu đã công bố trên một số chủng nấm khác.

Hình 1. Hàm lượng protein và hoạt độ cellulase của các phân đoạn sau tinh sạch
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Kết quả cho thấy, hoạt độ enzyme tăng khi tăng nồng độ cơ chất từ 0,2-1,0 và đạt cực đại ở

cực đại ở pH=5,5 (0.775 U/ml). Sau đó, hoạt độ enzyme giảm mạnh và đạt 31,39% (0,243
U/mg) ở pH=8 ( Hình 3B). Như vậy, cellulase của chủng P. saijor-caju có nhiệt độ và pH tối
ưu là 45°C và 5,5.

A B
Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH phản ứng (B) lên hoạt độ cellulase
Nhiệt độ và pH tối ưu của cellulase từ một số chủng nấm đảm đã công bố trước đây trong
khoảng 50-75°C và pH 4-7.5 như: cellulase của chủng V. volvacea là 55°C and pH 7.5 (Ding
và cs., 2001), của chủng P. byssoides là 50°C và pH 6 (Chao và cs., 2007), của chủng L.
sulphureus var. miniatus là 75°C và pH 4 (Hong và cs., 2009), của chủng Flammulina
velutipes là 60°C và pH 6.1 (Kenji và cs., 2008), của chủng Fomitopsis pinicola KMJ812 là
50°C và pH 4.5 (Joo và cs., 2009). Như vậy, nhiệt độ và pH tối ưu của cellulase từ chủng P.
saijor-caju nằm trong khoảng đã công bố trước đây trên các chủng nấm khác.
Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến độ bền của cellulase

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 32 – Tháng 10 – 201176

Kết quả nghiên cứu độ bền nhiệt cho thấy, sau 2 giờ ủ đầu tiên ở nhiệt độ 30 và 60
0
C hoạt độ
enzyme bị giảm mạnh (xuống còn 63,47 và 41,97 %), trong khi đó, ở 45
0
C hoạt độ enzyme
giảm ít hơn với hoạt độ còn lại là 85,51 %. Sau 2 giờ tiếp theo, hoạt độ của enzyme ở các
nhiệt độ giảm nhẹ và đến 8h thì hoạt độ lại tiếp tục giảm. Như vậy, độ bền nhiệt của enzyme
cellulase nghiên cứu là trung bình và ở 45°C bền hơn so với các nhiệt độ khác đã khảo sát
(Hình 4A).

enzyme trong nhóm metalloenzyme.

TRỊNH ĐÌNH KHÁ – Kết quả tinh sạch và nghiên cứu một số đặc tính của enzyme cellulase 77 A B
Hình 5. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ (A) và ion kim loại (B) lên hoạt độ cellulase
KẾT LUẬN
Cellulase tinh sạch đạt tỉ lệ sạch 1,94 lần so với dịch enzyme thô, hiệu suất của quá trình tinh
sạch đạt 15,86%. Nồng độ cơ chất phản ứng tối ưu: 1% CMC pha trong đệm acetate 0,1M, pH
5,6; Nhiệt độ phản ứng tối ưu: 45°

C, pH tối ưu: 5,5; độ bền pH trong khoảng 4-5,5. Hệ số
động học K
m
= 1,602mg/ml và V
max
=0,231 U/phút.
Các ion kim loại có ảnh hưởng khác nhau đối với hoạt độ endoglucanase: Ag
+
, Mg
2+
, Mo
2+
,
Na
+


VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 32 – Tháng 10 – 201178

Ding SJ, Wei G, Buswel JA (2001) Endoglucanase I from the edible straw mushroom,
Volvariella volvacea purification, characterization, cloning and expression. Eur J
Biochem 268: 5687–5695.
Elshafei AM, Mohamed MH, Bakry MH, Osama MA, Housam MA, Abdelmageed MO
(2009) Purification and properties of an endoglucanase of Aspergillus terreus DSM
826. J Basic Microbiol 49: 426-432.
Gao J, Weng H, Xi Y, Zhu D, Han S (2008) Purification and characterization of a novel endo-
beta-1,4-glucanase from the thermoacidophilic Aspergillus terreus. Biotechnol Lett
30: 323-327.
Han S, Yoo Y., Kang H. (1995) Characterization of a bifunctional cellulase and its structural
gene. J. Biol. Chem 270: 26012-26019.
Henriksson G, Nutt A, Henriksson H, Pettersson B, Stahlberg J, Johansson G, Pettersson G
(1999) Endoglucanase 28 (Cel12A), a new Phanerochaete chrysosporUm cellulase.
Eur J Biochem 259: 88-95.
Hong J, Tamaki H, Akiba S , Yamamoto K, Kumaga H (2001) Cloning of a gene encoding a
highly stable endo-1,4-glucanase from Aspergillus niger and its expression in Yeast. J
Biosci Bioeng 92: 434-441.
Hong MR, Kim YS, Joo AR, Lee JK, Kim YS, Oh DK (2009) Purification and
characterization of a thermostable β-1,3-1,4-Glucanase from Laetiporus sulphureus
var. miniatus. J Microbiol Biotechnol 19: 818–822.
Joo AR, Marimuthu J, Lee KM, Sim WI, Kim JS, Kim IW, Kim YS , Oh DK , Paramasamy
G, Lee JK (2009) Purification and characterization of a β-1,4-glucosidase from a
newly isolated strain of Fomitopsis pinicola. Appl Microbiol Biotechnol 83: 285–294.
Kenji Fukuda, Michika Hiraga, Sadaki Asakuma, Ikichi Arai, Mitsuo Sekikawa, Tadasu

PenicillUm sp. DTQ-HK1. Tạp chí Công nghệ Sinh học 5: 355-362.
Người phản biện: TS. Trịnh Xuân Cư và ThS. Nguyễn Giang Phúc