Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất
337
NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ CHO KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TRỞ LẠI
TS. Phan Xuân Hào
Viện Nghiên cứu Ngô
SUMMARY
Breeding for herbicide tolerance in Maize by backcrossing
The tolerance to Glyphosate has transferred into some promising inbreed lines by backcross method.
The new inbred lines and hybrids are the similar to initial ones regarding to the phenotypes and yield.
The presence of CP4 EPSPS gene and OPT/mepsps fragments in the donor, eight herbicide - tolerant
maize lines and four hybrids derived from these have asserted by PCR and southern blot technique. In
general, there are no significant difference in the degrees of damage of major diseases and the above -
ground insects among initial and new developed maize lines and hybrids.
Keywords: Glyphosate, backcross, inbred lines.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
*

Mặc dù hiện nay vẫn còn một số quan điểm
khác nhau về vấn đề cây trồng biến đổi gen
(GMO), nhưng với việc mở rộng nhanh diện tích
chỉ sau một thời gian ngắn đã khẳng định ý nghĩa
của thành tựu này đối với nhân loại.
Việc chuyển các gen kháng sâu và kháng
thuốc trừ cỏ vào ngô ở Mỹ chỉ thực hiện theo công
nghệ sinh học cho một số dòng, sau đó chuyển và
o
các dòng khác bằng phương pháp lai trở lại, kể cả
nhiều tính trạng như giống ngô Smart stax [8]. Các
công ty hạt giống vừa và nhỏ ở Mỹ cũng chuyển

- Phân tích PCR tiến hành với cặp mồi đặc
hiệu cho gen
KTTC.
- Tách chiết ADN theo phương pháp của
Saghai - Maroof (1984) [10].
- Phương pháp PCR theo phương pháp của
Grohmann và cộng sự (2009) [4].
- Phân tích sự kiện chuyển gene và vật liệu
thường sử dụng 03 trình tự mồi theo phương
pháp nghiên cứu của Heck và cộng sự (2005) [5].
- Phân tích đoạn OPT/m - epsps sử dụng 02
trình tự mồi theo phương pháp PCR của
Matsuoka và cộng sự (2000) [6].
- Thí nghiệm Southern blot thực hiện theo
phương pháp của Breitler và cộng sự (2004).
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
338
Bảng 1. Danh sách và trình tự các mồi cho thí nghiệm PCR
TT Tên mồi Trình tự
1 Primer D 5’ - GCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGG - 3’
2 Primer E 5’ - CAGCATCAGCGCTCGAAAGTTTCGTCAA - 3’
3 Primer F 5’ - GGCAGGGTGTTGTTGTCCATTTTATGG - 3’
4 Primer OTP5 5’ - ACGGTGGAAGAGTTCAATGTATG - 3’
5 PrimerEPS3 5’ - TCTCCTTGATGGGCTGCA - 3’
Bảng 2. Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt
Thành phần Nồng độ cuối Bước Nhiệt độ - Thời gian Chu kỳ
DNA 50ng DNA 1 95
0
C - 2 phút 1 chu kỳ
Primer 0,1uM Primer 2 94

Lần 2: Vào giai đoạn khoảng V18 - VT,
Lần 3: Vào giai đoạn khoảng R1,
Lần 4: Vào giai đoạn khoảng R2,
Lần 5: Vào giai đoạn khoảng R3 - R4.
Một số chỉ tiêu liên quan đến đa dạng loài
được tính theo Odum (1971) [9]
Các bệnh đốm lá lớn (Helminthoporium
turcicum), đốm lá nhỏ (Helminthoporium
maydis), gỉ sắt (Puccinia maydis), đốm nâu
(Physoderma maydis), khô vằn (Rhizoctonia
solani) được đánh
giá vào thời điểm 80 - 85 ngày
sau gieo. Tỷ lệ bệnh, mức độ nhiễm bệnh đánh
giá theo thang điểm từ 1 - 9.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả chọn tạo dòng ngô kháng thuốc
trừ cỏ (KTTC)
Duy trì, đánh giá các đặc tính nông học,
khả năng KTTC glyphosate và khả năng kết
hợp của 20 dòng KTTC ở thế hệ BC4S4. Kết
quả cho thấy, các dòng KTTC Glyphosate ổn
định; một số đặc tính nông học cơ bản đã hoàn
toàn giống với các dòng bình thường cùng
loại; các dòng KTTC có biểu hiện sinh trưởng
và phát triển khỏe hơn, cây chắc, lá xanh bền,
bông cờ to, ít nhiễm s
âu bệnh.

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất
339


Hình 1. Hình thái bắp của một số dòng
Các dòng KTTC có hình dạng bắp gần đồng
nhất so với các dòng bình thường. Tuy nhiên, do
có đời tự phối ít (BC4S2 - S4) nên vẫn có xu thế
bắp dài và to hơn.
3.2. Đánh giá đa dạng di truyền các vật liệu
mới tạo ra bằng chỉ thị phân tử SSR
Kết quả ở sơ đồ phả hệ cho thấy hệ số
tương đồng di truyền của các dòng biến thiên
trong khoảng
từ 0.23 - 1.00. Nhìn chung,
khoảng cách di truyền của các dòng tương đối
lớn, cho thấy các dòng tương đối khác biệt nhau
về vật chất di truyền. Hình 2 cho thấy ở hệ số
tương đồng di truyền 0.24, các dòng ngô chia
làm 3 nhóm chính.
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
340
Coefficient
0.24 0.43 0.62 0.81 1.00
H171.1
H1
H1.1
H97
Q59
H9
H14
H264
H240

H64
D55
NS25
H65
H53
H95.2
NX18
H171
H29
H414
H17
H60
H46
H8.1
H8.2
H171.
H5.1
H5.2
H4
H4.1
H80
H65.1
H603
DF9
51
H20
H3.1
H3.3
H672
H19

giếng 2: Đối chứng âm; giếng 3: Nguồn cho gene; giếng 4 - 11: 8 dòng ngô thường;
giếng 12 - 18: 8 dòng ngô BC4F4)

Hình 5. Kết quả phân tích PCR 7 giống ngô bằng 3 trình tự mồi D, E và F. (giếng 1: Thang
chuẩn 100bp; giếng 2: đối chứng âm; giếng 3: Nguồn cho gene; giếng 4 - 6: 3 giống ngô
thường; giếng 7 - 10: 4 giống ngô lai giữa các dòng BC4F4)
Năm 2012, kết quả điện di phân tích sự có
mặt của gen CP4 EPSPS bằng 3 trình tự mồi D,
E, F cho kết quả tương tự như năm 2011. Điều
này khẳng định chắc chắn sự có mặt của gen
KTTC Glyphosate CP4 EPSPS trong các dòng
mới và các tổ hợp lai có các dòng đó tham gia
(bảng 6 và 7). Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm PCR
của 20 dòng ngô bằng 3 trình tự mồi D, E, F.
(giếng M: Thang chuẩn 100bp; giếng 1: Đối
chứng âm; giếng 2: Đối chứng dương; giếng
3 - 12: 10 dòng ngô thường; giếng 13 - 22: 10
dòng ngô BC4S4)
Hình 7. Kết quả phân tích PCR 12 giống ngô bằng
3 trình tự mồi D, E, F. (giếng M : Thang chuẩn
100bp; giếng 1: Đối chứng âm; giếng 2: Nguồn vật
liệu cho gen; giếng 3 - 5: LVN4;
giếng 6 - 8: LVN14; giếng 9 - 11: LVN10;
giếng 12 - 14: 2AB)

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
342

chuẩn 100 bp)
Đoạn gen CTP2 - CP4 EPSPS được phân
tích trên hệ thống GenomeLab GeXP và thu được
trình tự 88bp như sau:
GGGATGACGTTAATTGGCTCTGAGCTTCG
TCCTCTTAAGGTCATGTCTTCTGTTCCCAC
GGCGTGCATGCTTCACGGTGCAAGCAGCC
Trình tự đoạn gene trên được so sánh với các
trình tự được công bố trên Ngân hàng Gen, cụ thể
là: Đoạn gen CTP2 - CP4 EPSPS của ngô chuyển
gen có mã số FN550387.1 và EU371957.1. Kết
quả so sánh tương đồng trên hai
trình tự
FN550387.1 và EU371957.1 cho kết quả như
bảng sau:
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất
343
Bảng 4. Trình tự đoạn gen
Tên trình tự CTP2 - CP4 EPSPS - FN550387.1 CTP2 - CP4 EPSPS - EU371957.1
SeqCTP2 - CP4 EPSPS 99,0% 82,0%

Hình 11. So sánh trình tự giữa đoạn SeqCTP2 - CP4 EPSPS bằng phần mềm Bioedit
Qua hình 3.11 cho thấy trình tự đoạn CTP2 -
CP4 EPSPS đọc được có số nucleotide giống với
các đoạn FN550387.1 và EU371957.1 công bố
trên Ngân hàng Gen lần lượt là 87/8
8 và 72/73
nucleotide. Đoạn gene được giải trình tự khác với
trình tự các đoạn FN550387.1 và EU371957.1 ở
nucleotide số 55,

ĐK bắp (cm) 4,5 4,4 4,1 4,1 4,5 4,4 4,5 4,5
TL hạt/bắp (%) 81,4 80,7 82,0 81,5 78,6 78,3 81,3 81,0
Năng suất (tạ/ha) 88,7 85,2 80,6 78,5 90,5 87,7 96,6 94,7
CV (%) 7,18 (So sánh trên chỉ tiêu năng suất)
LSD
.05
3,84 (So sánh trên chỉ tiêu năng suất)
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
344
DF5  DF7 DF1  DF2 161  DF4
SC2AB
Chỉ tiêu
KTTC BT KTTC BT KTTC BT KTTC BT
Thu 2011
TGST (ngày) 110 112 114 115 112 112 108 110
Cao cây (cm) 192,5 190,4 210,3 208,5 196,6 195,4 178,5 180,7
Đổ (điểm) 1 2 1 1 1 2 1 1
Sâu đục thân (điểm) 1 2 1 1 1 1 1 2
Bệnh khô vằn (đ) 1 1 1 1 2 3 1 1
Đốm lá (điểm) 1 2 1 1 1 2 2 2
Kháng TTC 100% 100% 100% 100%
Dài bắp (cm) 19,4 19,1 17,2 17,3 17,5 17,0 20,7 20,6
ĐK bắp (cm) 4,6 4,5 4,2 4,1 4,5 4,4 4,5 4,5
TL hạt/bắp (%) 80,0 79,8 80,9 80,5 78,5 78,3 80,6 80,2
N.suất (tạ/ha) 80,5 77,2 80,6 78,5 73,4 71,5 82,6 78,8
CV (%) 7,66 (So sánh trên chỉ tiêu năng suất)
LSD
.05
4,58 (So sánh trên chỉ tiêu năng suất)


128 233,3 2 1 76,5
5
161  DF4 K
125 223,4 2 2 80,7
6
161  DF4 T
125 225,5 2 2 80,2
7
2A  2B K
123 215,7 1 2 83,9
8
2A  2B T
123 220,4 2 2 82,5
9
H14  H53 K
122 208,4 1 1 84,5
10
H14  H53 T
123 210,5 1 1 84,2
11
2A  H64 K
120 202,8 2 2 76,8
12
2A  H64 T
121 200,7 2 2 76,2
13
DF4  H64 K
122 224,6 2 2 78,5
14
DF4  H64 T

110 195,6 2 1 78,6
4
DF1  DF2 T
111 193,3 2 1 76,8
5
161  DF4 K
110 183,4 2 2 77,9
6
161  DF4 T
110 185,5 2 2 79,5
7
2A  2B K
107 175,7 1 2 81,7
8
2A  2B T
118 173,4 2 2 82,5
9
H14  H53 K
110 178,4 1 1 80,5
10
H14  H53 T
110 178,5 1 1 79,2
11
H13  H14 T
111 182,8 2 2 76,8
12
H13  H14 K
112 180,7 2 2 76,2
13
H65  IL9

KTTC so với dòng/giống nền.
Số lượng các bộ của các loài chân khớp đã
thu thập được bằng bẫy
dính biến động từ 7 bộ
đến 10 bộ. Nhìn chung, không có sự chênh lệch
lớn giữa các dòng về chỉ tiêu này.
3.5.1.2. Tính đa dạng loài của tập hợp chân
khớp trong ruộng ngô thí nghiệm
- Tổng số cá thể bắt gặp trong mỗi kỳ điều
tra: Trong vụ Xuân 2011, tổng số cá thể bắt gặp
trong mỗi kỳ điều tra ở các dòng ngô KTTC biến
động từ 16,0 cá thể đến 109,
8 cá thể. Sự khác
nhau về tổng số cá thể bắt gặp trong mỗi kỳ điều
tra trên các dòng KTTC so với dòng/giống nền
tương ứng đều ở mức không có ý nghĩa thống kê.
Kết quả trong vụ Thu cũng có nhận xét tương tự.
Tổng số loài bắt gặp trong mỗi kỳ điều tra:
Tổng số loài bắt gặp trong mỗi kỳ điều tra trên
các dòng ngô KTTC biến động
từ 4,7 loài đến 7,8
loài và trên các dòng/giống ngô nền biến động từ
5,9 loài đến 8,7 loài. Sự khác nhau về tổng số
loài bắt gặp trong mỗi kỳ điều tra trên các dòng
ngô KTTC so với dòng/giống nền tương ứng đều
ở mức không có ý nghĩa. Trong vụ Thu 2011, chỉ
tiêu này ở các dòng ngô KTTC biến động từ 21,2
loài đến 25,1 loài và trên các dòng/giống ngô nền
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
346

Trong năm 2011 hầu hết các dòng ngô
KTTC và dòng/giống ngô nền đều có tỷ lệ nhiễm
bệnh đốm l
á nhỏ khá cao. Tuy nhiên, không có
sự khác biệt đáng kể giữa các dòng ngô KTTC so
với dòng/giống nền tương ứng.
3.5.3. Tính đa dạng loài của nhóm Collembola
trong đất trồng ngô
Đã thu thập và phân tích tổng số 215 mẫu
bẫy cốc trên các ruộng ngô thí nghiệm vụ Thu
năm 2011. Đã ghi nhận được 38 loài Collembola
thuộc 22 giống của 10 họ. Gần 1/2 số loài tập
trung ở họ Entomobryidae (18/38 loài, chiếm
47,37% tổng
số loài). Giống Lepidocyrtus có
nhiều loài nhất (11/38 loài, chiếm 28,95% tổng
số loài). Các giống còn lại chỉ có từ 1 - 2 loài.
Trong số đó, có 4 loài (Hypogastrura
manubrialis, Lepidocyrtus aseanus, Lepidocyrtus
medius và Lepidocyrtus heterolepis) mới chỉ thấy
trong mẫu bẫy cốc từ các ô trồng ngô KTTC.
Tuy nhiên, giá trị độ phong phú của ngô
KTTC vẫn chỉ tương đương với khoảng dao động
về số lượng cá thể của giống ngô đối chứng và sự
sai khác này
không có ý nghĩa thống kê (F
3,09
=
0,06; P = 0,97). Điều này chứng tỏ sự biến động
số lượng cá thể ở ngô KTTC so với ngô đối chứng

từ 0 - 3 họ.
- Phát hiện 51 loài chân khớp trên bẫy dính ở
các dòng/giống ngô trong vụ xuân 2012 tương tự
như năm 2011, không có loài nào mới xuất hiện.
Nhìn chung, số lượng bộ chân khớp đã phát
hiện được trên các dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ
tương tự như nhau hoặc hơn kém nhau 1 - 2 bộ so

với các dòng/giống ngô nền tương ứng.
- Tính đa dạng loài của tập hợp chân khớp
trong ruộng ngô thí nghiệm
Tổng số cá thể bắt gặp trong mỗi kỳ điều tra
ở các dòng/giống ngô KTTC biến động từ 80 cá
thể/kỳ ở dòng 2A N đến 157,3 cá thể/kỳ ở dòng
DF7 N. Sự khác nhau đều ở mức không có ý
nghĩa thống kê.
Tại mỗi kỳ điều tra, tổng
số loài bắt gặp
trung bình trên các dòng/giống ngô thí nghiệm
không giống nhau.
Chỉ số ưu thế Simson’D trên các dòng/giống
ngô trong vụ Xuân 2012 là khá cao, không có sự
khác biệt đáng kể giữa các dòng/giống ngô
KTTC so với dòng/giống nền.
Các giá trị của chỉ số ưu thế Simson’D cho
thấy trên mỗi dòng/giống ngô thí nghiệm đều
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất
347
không có loài chân khớp nào phát triển với số
lượng ưu thế gây mất cân bằng giữa các loài.

của các đoạn gene đích (88bp) và phân tích
Southern blot. Kết quả đã xác định chắc chắn 13
nguồn vật liệu ngô trên bao gồm: 1 (nguồn cho);
8 dòng và 4 THL từ các dòng mới có chứa gene
CP4 EPSPS KTTC Glyphosate.
- Đã xác định được trình tự đoạn gen (88bp)
của dòng ngô kháng thuốc trừ cỏ thể hiện độ
tương đồng tương ứng là 99% so với trình tự
gen mã số FN550387.1 và 82% so với trì
nh tự
có mã số EU371957.1 đã được công bố trê
n
Ngân hàng Gen.
- Những kết luận từ thí nghiệm đánh giá an
toàn sinh học cho thấy không có sự khác biệt
đáng kể về các loại bệnh hại và tần suất xuất hiện
một số chân khớp trên ô gieo trồng các
dòng/giống có KTTC và ô trồng các dòng/giống
ngô bình thường
Từ kết quả của đề tài có thể khẳng định,
phương pháp lai trở lại có thể chuyển được tính
kháng thuốc trừ cỏ từ vật liệu kháng cho các
dòng
triển vọng
4.2. Đề nghị
Có hướng sử dụng cho các sản phẩm đã có
của đề tài
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Ahmadi, N., Albar, L., Pressoir, G., Pinel, A.,
Fargette, D. & Ghesquyere, A. (2001). “Genetic

Characterization of a CP4 EPSPS - Based,
Glyphosate - Tolerant Corn Event.” Crop Sci 44:
329 - 339.
6. Matsuoka, T., H, Kuribara., K, Takubo., H,
Akiyama., H, Miura., Y, Goda., Y, Kusakabe., K,
Isshiki., M, Toyoda., A, Hino (2000). “A multiplex
PCR method of detecting recombinant DNAs from
five lines of genetically modified maize.” J Food
Hyg Soc Japan 42: 24 - 32.
7. Ming, T. C. (2005). “Corn breeding Achievements
in United States “ Proceedings of the Ninth Asian
Regional Maize WorkshopBeijing, China: 12 - 21.
8. Narsarimham, U., W, Xu (2010). “Molecular maize
breeding.” Training course. In National maize
research institute 5/2010
9. Odum, E. P. (1971). “Fundamentals of ecology.”
W.B. Saunders Company 3Philadelphia, London,
Toronto.
10. Saghai - Maroof, M. A., K, Soliman., R.A,
Jorgensen., R.W, Allard (1984). “Ribosomal DNA
spacer - length polymorphisms in barley: Mendelian
inheritance, chromosomal location, and population
dynamics.” PNAS 81: 8014 - 8018.