ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

LÊ THỊ DŨNG
NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI
KHUẨN BACILLUS SP. CÓ KHẢ NĂNG XỬ LÝ
NƯỚC THẢI NHÀ MÁY CHẾ BIẾN TINH BỘT
SẮN QUẾ CƯỜNG – QUẾ SƠN – QUẢNG NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP


KHUẨN BACILLUS SP. CÓ KHẢ NĂNG XỬ LÝ
NƯỚC THẢI NHÀ MÁY CHẾ BIẾN TINH BỘT
SẮN QUẾ CƯỜNG – QUẾ SƠN – QUẢNG NAM Chuyên ngành: Quản lý tài nguyên và môi trường
Người hướng dẫn khoa học: ThS. Nguyễn Thị Lan Phương
Đà Nẵng - Năm 2015 LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn
Bacillus sp. có khả năng xử lý nước thải nhà máy chế biến tinh bột sắn
Quế Cường - Quế Sơn - Quảng Nam” là kết quả nghiên cứu của tác giả.

Sinh – Môi trường, các thầy cô giáo và giám đốc công ty Cổ phần FOCOCEV
Quảng Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện khóa luận của mình.
Cuối cùng xin cảm ơn bạn bè và gia đình đã động viên và giúp đỡ kịp thời. Đà Nẵng, ngày 06 tháng 5 năm 2015
Sinh viên thực hiện Lê Thị Dũng

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU

2.2.3. Thời gian nghiên cứu 15
2.3. Vật liệu và phương pháp 15
2.3.1. Vật liệu 15
2.3.2. Các phương pháp nghiên cứu 16
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 24
3.1. Kết quả phân lập và xác định VK từ nước thải chế biến tinh bột sắn 24
3.2. Test nhanh với KOH 25
3.3. Kết quả nhuộm Gram 26
3.4. Kết quả nhuộm bào tử 26
3.5. Kết quả xác định chủng VK có hoạt tính amylase 27
3.6. Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
30
3.6.1. Ảnh hưởng của pH 30
3.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 31
3.6.3. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh hoạt tính enzyme của VK
32
3.7. Kết quả xác định mật độ vi khuẩn cho vào bể xử lý sinh học hiếu khí 34
3.8. Kết quả xử lý nước thải tinh bột sắn bằng bể xử lý sinh học hiếu khí 35
3.8.1. pH 36
3.8.2. COD 37
3.8.3. BOD
5
38
3.8.4. Chất rắn lơ lửng (SS) 40
3.8.5. Nitơ tổng 41
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44
4.1. Kết luận 44
4.2. Kiến nghị 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
TIẾNG VIỆT 45

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Số hiệu
bảng
Tên bảng Trang

Bảng 1.1
Phương pháp xử lý theo tinh chất của nước thải 9
Bảng 3.1
Hình thái khuẩn lạc các chủng VK phân lập được 25
Bảng 3.2
Vòng phân giải của các chủng VK Bacillus có hoạt tính
amylase
28
Bảng 3.3
Đường kính vòng phân giải enzyme của chủng VK D2, D5
và D15
33
Bảng 3.4
Giá trị pH của nước thải qua 7 ngày xử lý 36
Bảng 3.5
Giá trị COD của nước thải qua 7 ngày xử lý 38
Bảng 3.6
Giá trị BOD

thải chế biến tinh bột sắn.
24
Hình 3.2
Hình thái và khả năng bắt màu thuốc nhuộm Gram của
chủng VK phân lập
26
Hình 3.3
Bào tử của các chủng VK bắt màu đỏ với thuốc nhuộm
Ogietska
27
Hình 3.4
Vòng phân giải amylase của 16 chủng VK Bacillus có hoạt
tính
29
Hình 3.5
Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng VK D2,
D5, D15
31
Hình 3.6
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng chủng VK D2,
D5, D15
32
Hình 3.7
Đường kính vòng phân giải tinh bột của chủng VK D2, D5
và D15 tương ứng với thời gian nuôi cấy
34
Hình 3.8
Kết quả đếm khuẩn lạc xác định mật độ VK 35
Hình 3.9
Sự thay đổi pH trong nước thải qua 7 ngày xử lý 36

thời, nó cũng trở thành nguồn nguyên liệu chính của nhà máy chế biến tinh bột sắn.
Hiện nay, nhiều cơ sở, nhà máy chế biến hoạt động với sản lượng khoảng 800.000
– 1.200.000 tấn tinh bột sắn mỗi năm, trong đó trên 70% xuất khẩu và gần 30% tiêu
thụ trong nước. Theo thống kê năm 2009 xuất khẩu tinh bột sắn được Bộ công
thương xếp vào một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực, đem lại công ăn việc
làm và thu nhập cao cho người dân [23].
Tuy vậy, song song với sự phát triển mang lại lợi ích kinh tế xã hội cao thì
ngành công nghiệp chế biến mặt hàng này cũng gây áp lực lớn đến môi trường, mà
một trong những vấn đề nổi cộm nhất là xử lý nước thải (XLNT) sau sản xuất.
Nước thải từ nhà máy chế biến tinh bột sắn được đánh giá là tác nhân gây ô nhiễm
lớn đến nguồn nước tự nhiên với nhiều thành phần hữu cơ như tinh bột, xenlulo,
pectin, đường, protein có trong nguyên liệu củ sắn tươi giàu nitơ, photpho,…[29].
Bên cạnh đó, sự phân giải các thành phần này trong điều kiện tự nhiên gây ra mùi
hôi rất khó chịu, ảnh hưởng đến chất lượng môi trường không khí xung quanh.
Nước thải xử lý chưa đạt tiêu chuẩn xả thải nếu được đưa vào môi trường sẽ là
nguồn tác động xấu đến sức khỏe con người và hệ sinh thái. Với tính chất và thành
phần như thế, trong việc lựa chọn các biện pháp xử lý chất thải, các nhà quản lý
2luôn cân nhắc giữa việc sử dụng các biện pháp hóa lý với các biện pháp sinh học.
Xử lý chất thải bằng các tác nhân sinh học đã được nghiên cứu và chứng minh là
đem lại hiệu quả cao, giảm chi phí và ưu điểm nhất là thân thiện với môi trường.
Vi khuẩn (VK) Bacillus thuộc nhóm VK Gram dương, hình que, sinh trưởng
trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc và có khả năng sinh bào tử, do
đó chúng có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau. VK
Bacillus rất phổ biến trong tự nhiên và đồng thời tham gia vào nhiều quá trình
chuyển hóa vật chất, phân giải các hợp chất hữu cơ cao phân tử gây ô nhiễm nhờ
khả năng sinh tổng hợp mạnh các enzyme ngoại bào [16]. Đây cũng là cơ sở khoa
học cho các nghiên cứu sản xuất và chế tạo các chế phẩm sinh học phục vụ nông

Đồng thời tạo tiền đề cho việc nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học từ các
chủng VK này.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Các chủng VK có khả năng phân giải tinh bột mạnh được tuyển chọn có thể
được sử dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học xử lý chất thải rắn, làm phân vi
sinh, phân hữu cơ vi sinh và XLNT giàu chất hữu cơ tinh bột như nước thải nhà
máy chế biến tinh bột sắn.

4CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về VSV sinh tổng hợp enzyme amylase
1.1.1. Tổng quan về enzyme amylase và các ứng dụng của enzyme

khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase (hay α-dextrin 6
– glucosidase); khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và
maylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi
polysaccharide.
Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy phân
tinh bột của chuỗi polysaccharide. α – amylase β-amylase
Hình 1.1. Một số loại enzyme amylase
(Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure
)

1.1.2. Tổng quan về VSV sinh tổng hợp amylase
Hiện nay người ta đã phát hiện được trên 2000 enzyme khác nhau, nhưng chỉ
có khoảng 140 enzyme có thể được sử dụng cho mục đích thương mại. Trong đó,
enzyme amylase được sử dụng nhiều trong công nghiệp và sản xuất với số lượng
lớn. Ngoài việc sử dụng các enzyme có nguồn gốc từ thực vật thì nhiều nhóm VSV
6cũng được biết đến như các “nhà máy” sản xuất amylase, ví dụ như các VK, nấm
mốc và nấm men [8].
1.1.2.1. Nấm mốc
Các nấm mốc sinh enzyme amylase mạnh có thể được kể đến như là các mốc
thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Mucorsnr, Neurospora, Rhizopus sp, Rhizopus
japanicus. Trong đó, chế phẩm enzyme amylse được thu từ hai loài nấm
mốc Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori ứng dụng nhiều trong sản xuất bánh
mì .
1.1.2.2. Nấm men

Hà*, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn đã tiến hành nghiên cứu phân lập được 236
chủng Bacillus từ các mẫu đất và nước thải khác nhau. Theo đó, khi khảo sát hoạt
tính enzyme ngoại bào như amylase, protease và CMC – aza của 236 chủng trên thì
có 3 chủng có khả năng sinh enzyme mạnh và XLNT hiêu quả.
Một nghiên cứu khác của Phạm Trần Thùy Hương và Đỗ Thị Bích Thủy
(2012) tập trung vào khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình thu nhận
chế phẩm amylase ngoại bào trên đối tượng Bacillus subtilis DC5. Trong nghiên
cứu này, cùng với việc đã xác định được thành phần môi trường thích hợp để nuôi
cấy chủng Bacillus subtilis DC5 là pepton 1%; cao thịt 0,3%; NaCl 0,5%; lactose
0,25%, nhiệt độ 35
o
C và pH 5, tác giả cũng xác định được sau 24 giờ nuôi cấy cũng
là thời điểm tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào.
Cũng với VK lactic, VK Bacillus cũng được xác định là những VK có đặc tính
probiotic được áp dụng nhiều trong các chế phẩm sinh học. Để tăng khả năng đề
kháng của tôm, tác giả Khuất Hữu Thanh; Nguyễn Đăng Phúc Hải; Bùi Văn Đạt;
Võ Văn Nha (2009) đã phân lập được 12 chủng VK Bacillus và 18 chủng VK lactic
có hoạt tính đối kháng VK Vibrio và VK kiểm. Kết quả nghiên cứu trên cho thấy
chế phẩm probitic tạo được có hiệu quả tăng sức kháng bệnh của tôm sú ở điều kiện
phòng thí nghiệm.
Phạm Thị Xòe (2012), tiến hành phân lập được 35 chủng VK có hoạt tính
kitinaza và một số đặc tính của enzyme từ mẫu đất làm giàu. Theo đó, chọn lọc
được 2 chủng VK sinh kitinaza cao nhất xác định được nhiệt độ và pH tối ưu cho sự
phát triển là chủng HD1 ở 40
o
C, pH 7 và chủng HD5 ở 35
o
C, pH 7,5. Đồng thời,
khẳng định 2 chủng VK trên là Bacillus.
Một nghiên cứu của Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý (2012), từ nước

lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp, sản xuất probiotic phòng bệnh,… Trong khi đó,
những nghiên cứu về ứng dụng khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ của VSV
vào quá trình XLNT, đặc biệt là nước thải giàu tinh bột còn tương đối hạn chế. Như
vậy, trên nền tảng của những nghiên cứu trước, chúng tôi tiến hành đề tài này với
mong muốn phát triển hơn nữa những ứng dụng của VSV vào thực tiễn cuộc sống.
1.3. Tổng quan về các phương pháp XLNT.
Đối với các hoạt động công nghiệp, nước thải được thải ra môi trường nếu bị
lưu đọng hoặc xử lý chưa đạt yêu cầu sẽ gây ô nhiễm môi trường, đặc biệt đối với
9nguồn nước tiếp nhận, hậu quả kéo theo gây tác động xấu đến vệ sinh môi trường
và sức khoẻ con người. Do đó, quy trình XLNT được áp dụng rất nhiều phương
pháp nhằm đạt hiệu quả xử lý cao. Thông thường, hệ thống xử lý nước thải bao gồm
tổng hợp các phương pháp lý học (cơ học), hoá học và sinh học [15].
Việc áp dụng các phương pháp trên ngoài sự phụ thuộc vào tính chất nước thải
(bảng 1.1), lưu lượng nước thải còn phụ thuộc vào hàng loạt các yếu tố khác như:
kinh phí, diện tích dành cho hệ thống xử lý, đặc điểm địa hình, hệ thống thoát nước,
mục đích sử dụng của nguồn nước tiếp nhận v.v
Bảng 1.1. Phương pháp xử lý theo tinh chất của nước thải
Chất bẩn Các phương pháp xử lý
Chất hữu cơ dễ phân hủy sinh hóa
(BOD)

Chất lơ lửng
Chất hữu cơ bền vững
Vết nhơ

Bản chất của quá trình XLNT bằng phương pháp hóa học và hóa lý là áp dụng
các phản ứng hóa học và vật lý khi bổ sung các hợp chất khác nhau vào để loại bỏ
bớt các chất ô nhiễm, các quá trình thường được áp dụng trong phương pháp xử lý
hóa học và hóa lý bao gồm [6]:
- Phương pháp đông tụ: để tăng nhanh quá trình lắng các chất lơ lửng phân tán
nhỏ, keo,…
- Phương pháp trung hòa: Nước thải sản xuất trong nhiều lĩnh vực có chứa
nhiều axit hoặc kiềm. Ðể ngăn ngừa hiện tượng xâm thực ở các công trình thoát
nuớc và tránh cho các quá trình sinh hóa ở các công trình làm sạch và trong hồ,
sông không bị phá hoại, nguời ta phải trung hòa các loại nước thải đó. Trung hòa
còn với mục đích làm cho một số muối kim loại nặng lắng xuống và tách ra khỏi
nước.
- Phương pháp oxy hóa – khử.
- Phương pháp hấp phụ.
1.3.3. Phương pháp xử lý sinh học
Phương pháp dựa trên cơ sở: Hoạt động của VSV để phân hủy các chất hữu cơ
gây nhiễm bẩn trong nước thải. Các VSV sử dụng các chất hữu cơ và một số chất
khoáng làm chất dinh dưỡng và tạo năng lượng. Chúng nhận các chất dinh duỡng để
xây dựng tế bào, sinh truởng, sinh sản nên sinh khối của chúng tăng lên. Quá trình
phân hủy các chất hữu cơ nhờ VSV gọi là quá trình oxy hóa sinh hóa. Nước thải
đuợc xử lý bằng phương pháp sinh học sẽ được đặc trưng bằng chỉ tiêu COD và
BOD
5
. Đặc biệt quá trình tự làm sạch do trong môi trường có các VK giúp cho quá
trình chuyển hóa, phân hủy chất hữu cơ nên khi XLNT cần xem xét nước có các
VSV hay không để lợi dụng sự có mặt của nó và nếu có thì tạo diều kiện tốt nhất
cho các VSV phát triển. Do đó, đối với dòng nước thải chứa nhiều hợp chất hữu cơ
thì phương pháp xử lý sinh học là tối ưu nhất [15], [6].
11


(BOD), nhu cầu oxy hóa học (COD) có nồng độ cao, đặc biệt là hàm lượng tinh bột
trong củ cao (62 – 65% lượng chất khô) sẽ là nguyên nhân chủ yếu làm cho dòng
nước thêm ô nhiễm [9], [1]. Vì vậy, phương pháp sinh học là lựu chọn tối ưu nhất
12cho quá trình xử lý, nhưng do tính đặc thù của quy trình chế biến là phải loại bỏ các
phần vỏ và đất của sắn nên tách riêng dòng nước thải ra là không thể thiếu nhằm
nâng cao hiệu quả xử lý.
Hiện nay, tại Việt Nam công nghệ phổ biến được áp dụng trong xử lý là công
nghệ hồ sinh học kỵ khí dạng hở (open anaerotic lagoons). Một số nhà máy tinh bột
sắn áp dụng bể CIGAR (bể được tạo thành bằng cách phủ bạt toàn bộ mặt hồ kỵ
khí) và công nghệ UASB (kỵ khí kiểu chạy ngược qua lớp bùn yếm khí) kết hợp thu
khí metan (CH
4
). Đối với phương pháp kỵ khí kết hợp thu khí CH
4
tại 13 nhà máy ở
nước ta được công nhận là dự án CDM (CDM – clean Development Mechansm).
Quá trình xử lý nước thải tinh bột sắn của một số nhà máy được áp dụng như sau:
- Nước thải từ quy trình công nghệ dẫn qua song chắn rác để loại bỏ tạp chất
thô rồi được dẫn qua bể gạn bột để thu hồi tinh bột, từ đó được dẫn qua bể lắng cát
và qua bể axit hóa để khử CN
-
nhằm tạo môi trường thuận lợi cho quá trình xử lý
sinh học phía sau. Nước thải sẽ được dẫn vào hai mương với hai dòng nước thải
khác nhau.
- Quy trình xử lý sinh học ở các bể hiếu khí và kỵ khí là giai đoạn mà nước
thải tiếp tục đưa qua bể UASB (kỵ khí) sau đó dẫn qua bể Aeroten (hiếu khí), ở đây
sục khí liên tục và các vi sinh vật dạng hiếu khí sẽ phân hủy các chất hữu cơ còn lại

khi nước thải vào hồ kỵ khí thì được lưu lại tại bể tùy nghi để thực hiện quá trình
lắng và phân hủy hiếu khí. Tuy nhiên, quá trình xử lý của các nhà máy, cơ sở sản
xuất chưa thực sự hiệu quả.
14CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng Bacillus sp. sinh enzyme amylase có trong nước thải chế biến
tinh bột sắn
- Nước thải chế biến tinh bột sắn.
- Mô hình thử nghiệm XLNT.
2.2. Địa điểm, phạm vi và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
* Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa
Quá trình thu mẫu nước để phân lập và xác định các chủng vi khuẩn Bacillus

Tủ sấy
Máy đo pH
Máy lắc
Nồi hấp vô trùng ở áp suất
cao
Kính hiển vi
Bếp điện nấu môi trường
Máy đo so màu
Ống nghiệm
Đĩa petri
2.3.1.2. Hóa chất
Cao nấm men
NaCl
Peptone
NaNO
3
KH
2
PO
4

KCl
MgSO
4
. 7H
2
O
FeSO
4


o
C và trong thời gian 20 phút
2.3.1.4. Môi trường định tính sinh tổng hợp enzyme amylase
NaNO
3
1,6g
KH
2
PO
4
0,8g
KCl 0,4g
MgSO
4
. 7H
2
O 0,4g
FeSO
4
0,008g
Tinh bột tan 4g
Thạch 16g
Nước cất 800ml
pH 7 ÷ 7,5
2.3.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.3.2.1. Phương pháp lấy mẫu nước phân lập
Về nguyên tắc cần thu mẫu sao cho mẫu thu được có tính đại diện cho khối
lượng nước cần phân tích. Quá trình lấy mẫu chúng tôi sử dụng bình thu mẫu loại
dùng một lần hoặc có thể dùng nhiều lần. Trường hợp dùng bình chứa sử dụng
nhiều lần, chất liệu bình phải cho phép khử trùng lặp lại nhiều lần mà không tạo ra