Khóa luận tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Quang Huy,
người thầy đã trực tiếp hướng dẫn em rất tận tình trong quá trình thực hiện đề tài,
giúp em vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt khóa luận này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh
học, trường Đại Học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và
cung cấp cho em những kiến thức bổ ích trong suốt bốn năm học vừa qua và giúp
đỡ em rất nhiều trong việc nắm bắt kiến thức cũng như động viên em rất lớn về mặt
tinh thần.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS. Phạm Bảo Yên cùng các anh chị, các
bạn, các em thuộc phòng Enzyme học và phân tích hoạt tính sinh học - Phòng thí
nghiệm trọng điểm Công nghệ Protein và Enzyme và phòng thí nghiệm bộ môn Sinh
lý thực vật và Hóa sinh đã luôn chia sẻ, giúp đỡ và tạo điều kiện rất lớn để em có
thể thực hiện được đề tài khóa luận này.
Khóa luận được thực hiện có sự hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp Đại học Quốc
gia Hà Nội mã số QG11-16 và đề tài Nghiên cứu phát triển công nghệ màng sinh
học trong xử lý nước thải giàu nitơ, photpho của Bộ Công thương. Nhân dịp này em
xin cảm ơn sự hỗ trợ của các đơn vị tài trợ.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên, động
viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận, giúp em
trưởng thành hơn khi sắp bước đi trên những con đường mới.

Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2012.
Sinh viên

Đoàn Diệu Linh

Đoàn Diệu Linh

i


ESC

Esculin ferric citrate

GEL

gelatine

GLU

D-glucose

GNT

Potassium gluconate

LB

Môi trƣờng Luria – Bertani

MAL

D-maltose

MAN

D-mannitol

MLT


w/v

Khối lƣợng (g)/thể tích (ml)

Đoàn Diệu Linh

ii

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
MỤC LỤC
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM ...............................................................2
1.1.

Giới thiệu về Biofilm .................................................................................2

1.2.

Khả năng tồn tại của màng sinh vật ...........................................................3

1.2.1.

Trong môi trƣờng tự nhiên ..................................................................3

1.2.2.

Trong các vật liệu, hệ thống ................................................................4


Mối quan hệ hợp tác giữa các loài ........................................................10

1.6.

Ứng dụng của màng sinh vật ....................................................................11

1.6.1.

Ứng dụng trong phòng trừ bệnh hại ở cây trồng ..................................11

1.6.2.

Ứng dụng trong xử lý nƣớc thải ...........................................................11

1.7.

Vấn đề xử lý nƣớc thải .............................................................................12

1.7.1.

Quá trình nitrate hóa .............................................................................13

1.7.2.

Quá trình phản nitrate hóa ....................................................................13

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .............................................15
2.1.


Đoàn Diệu Linh

iii

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
2.3.3.

Tối ƣu hóa các điều kiện của môi trƣờng ..........................................19

2.3.4.

Khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ...........................................19

2.3.5.

Phƣơng pháp nhuộm Gram nhận dạng chủng nghiên cứu ................20

2.3.6.
Quan sát cấu trúc màng sinh vật bằng kỹ thuật ảnh chụp trên kính
hiển vi điện tử quét ...........................................................................................21
2.3.7.

Phƣơng pháp đo phân tích hàm lƣợng nitrate N-NO3-. .....................21

2.3.8.

Phƣơng pháp đo phân tích hàm lƣợng nitrite N-NO2-. ......................22


Ảnh hƣởng của nhiệt độ ....................................................................28

3.3.2.

Ảnh hƣởng của độ pH .......................................................................28

3.3.3.

Ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl..................................................29

3.4.

Cấu trúc màng sinh vật .............................................................................30

3.4.1.

Hình thái vi khuẩn phân lập ..............................................................30

3.4.2.

Hình thái màng sinh vật.....................................................................31

3.4.3.

Cấu trúc hiển vi của màng biofilm nổi ..............................................32

3.5.

Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ ...................................................33

lƣợng ôxy hòa tan trong nƣớc giảm mạnh gây ảnh hƣởng đến hệ sinh thái thủy sinh.
Những nghiên cứu về vi sinh vật học ngày nay đóng một vai trò quan trọng
trong nhiều lĩnh vực từ công nghiệp, nông nghiệp, y học và đặc biệt là trong vấn đề
xử lý ô nhiễm môi trƣờng. Việc áp dụng các phƣơng pháp sinh học để xử lý nƣớc
thải hiện nay đang đƣợc quan tâm đặc biệt là phƣơng pháp sử dụng vi sinh vật, chủ
yếu là vi khuẩn để phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ. Trong phần lớn những
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, các vi sinh vật thƣờng đƣợc xem xét đánh giá
dƣới góc độ là những tế bào đơn lẻ. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy
rằng hầu hết các tế bào vi sinh vật thƣờng liên kết với nhau tạo thành một cộng
đồng và bám dính trên các bề mặt giá thể thông qua mạng lƣới các hợp chất ngoại
bào, hình thành nên cấu trúc gọi là màng sinh vật (biofilm).
Biofilm là một dang cấu trúc sống tồn tại khá phổ biến trong tự nhiên. Chúng
đƣợc hình thành khi các tế bào tiết ra các polymer ngoại bào tạo điều kiện thuận lợi
cho việc bám dính, hình thành mạng lƣới. Cấu trúc biofilm giúp cho vi sinh vật tồn
tại và chống chịu đƣợc trong những điều kiện bất lợi của môi trƣờng đồng thời
thông qua mối quan hệ hợp tác giữa các loài khác nhau trong hệ thống màng sinh
vật, các vi sinh vật có thể tận dụng đƣợc nguồn dinh dƣỡng.
Nghiên cứu về màng sinh vật giúp chúng ta có cái nhìn mới về mối tƣơng tác
của vi sinh vật trong điều kiện tự nhiên. Những phát hiện nghiên cứu mới giúp
chúng ta kiểm soát đƣợc sự phát triển của vi sinh vật, từ đó ứng dụng vào nhiều
ngành công nghiệp khác nhau trong đó có xử lý ô nhiễm môi trƣờng. Xuất phát từ
thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh
vật có khả năng tạo màng sinh vật (biofilm) và bƣớc đầu định hƣớng ứng dụng
xử lý ô nhiễm nƣớc thải”.

Đoàn Diệu Linh

1

K53A Sinh học

tƣợng bám dính và phát triển phổ biến của vi khuẩn trong các mảng bám răng một

Đoàn Diệu Linh

2

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
dạng của màng biofilm [1]. Đến những năm 1940, những nghiên cứu đầu tiên về sự
phát triển của vi sinh vật thành các lớp đƣợc thực hiện, khi Zobell mô tả những đặc
điểm cơ bản về sự gắn kết quần thể vi sinh vật. Ban đầu, màng sinh vật đƣợc cho là
một hệ thống đồng nhất các tế bào bám dính trong lớp chất nhờn. Tuy nhiên, những
nghiên cứu sau này cho thấy màng sinh vật thƣờng là tập hợp nhiều các loài vi
khuẩn tạo thành quần thể phức tạp riêng biệt có khả năng phát triển các cấu trúc
phức tạp [35]. Trong suốt những năm 1960 đến 1970 đã có rất nhiều nghiên cứu về
sự phát triển màng sinh vật, tuy nhiên thuật ngữ màng sinh vật (biofilm) chỉ mới
đƣợc công nhận từ năm 1984 [7].
Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về màng sinh vật đã đƣợc đề xuất trong
những năm qua. Theo bách khoa toàn thƣ Wikipedia màng sinh vật đƣợc định
nghĩa là: “một cấu trúc tập hợp của vi sinh vật đƣợc bao quanh bởi mạng lƣới ngoại
bào do chính nó tạo ra và đƣợc gắn kết trên bề mặt trên bề mặt hữu sinh hoặc vô
sinh” [40]. Nhìn chung, màng sinh vật là một quần thể sinh vật có cấu trúc phức tạp
liên kết với nhau bởi một hệ thống mạng lƣới ngoại bào. Mạng lƣới này có chứa các
polysaccharide ngoại bào, protein và ADN có nguồn gốc từ vi sinh vật. Giữa các
cấu trúc của chúng có các kênh dẫn chất lỏng cho phép các tế bào tƣơng tác với
nhau và hợp tác trao đổi chất. Màng sinh vật có thể đƣợc hình thành do một loài vi
sinh vật song đa số màng sinh vật là sự cộng sinh của nhiều loài vi sinh vật khác
nhau [9].

phát triển xuất hiện những vết màu.
Màng sinh vật cũng có thể đƣợc tìm thấy phát triển trong môi trƣờng cực trị
nhƣ sông băng ở Nam Cực, hay các mạch suối nƣớc nóng…
Đối với thực vật, một số loài thực vật cộng sinh với vi khuẩn có trong màng
sinh vật bám ở rễ cây. Rễ cây tiết ra một lƣợng đáng kể các loại đƣờng, axit amin,
vitamin… nhƣ là chất dinh dƣỡng cho các màng sinh vật. Ngƣợc lại, màng sinh vật
tạo điều kiện thuận lợi cho khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng của thực vật [39].
1.2.2. Trong các vật liệu, hệ thống
Trong khi màng sinh vật đối với tự nhiên mang nhiều yếu tố tích cực thì đối
với công nghiệp, màng sinh vật lại là nguyên nhân của nhiều vấn đề tiêu cực nhƣ sự
ô nhiễm và tắc nghẽn màng sinh vật (biofouling) xảy ra gần nhƣ ở tất cả những
khâu xử lý trong công nghiệp có liên quan đến việc sử dụng nƣớc nhƣ hoạt động
làm mát, sản xuất bột giấy… Màng sinh vật là nguyên nhân gây ra hiện tƣợng tắc
ống dẫn ăn mòn ống dẫn và làm ô nhiễm nguồn nƣớc.
Trong các vật dụng hàng ngày cũng có sự xuất hiện của màng sinh vật.
Những mảng bám trên vòi hoa sen, bồn rửa mặt, sự tắc nghẽn đƣờng ống nƣớc là
những ví dụ cho sự có mặt của màng sinh vật (Hình 2B) [39].
1.2.3. Trong y tế và cơ thể sinh vật
Trên thực tế cơ thể con ngƣời và các sinh vật nói chung là nơi tồn tại của hệ
thống rất đa dạng các loài vi sinh vật. Tuy nhiên đôi khi sự mất cân bằng về hệ vi
sinh vật trong cơ thể là nguyên nhân gây ra các vấn đề về nhiễm trùng. Trong đó
màng sinh vật là một trong số những nguyên nhân gây ra một số bệnh nhiễm trùng
mãn tính viêm tai hay thƣờng gặp nhất là trên những mảng bám răng. Thậm chí bề
mặt của những dụng cụ y tế đặt trong cơ thể nhƣ van tim niệu quản nhân tạo cũng
có thể là nơi phát triển của biofilm (hình 2C) [38].

Đoàn Diệu Linh

4


sâu trong cấu trúc màng sinh vật. Hầu nhƣ lƣợng EPS đƣợc sản sinh trong màng
sinh vật cũng có nhiều điểm khác so với các vi sinh vật phù du [19]. Thành phần
EPS thay đổi theo thành phần vi sinh vật và điều kiện môi trƣờng hình thành nên
màng sinh vật. EPS thông thƣờng bao gồm 40-95% polysaccharide, 1-60% protein,
1-10% axit nucleic và 1-40% lipid [12].

Đoàn Diệu Linh

5

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
Bảng 1. Vai trò của các thành phần trong EPS [13]
Chức năng của hợp
chất ngoại bào

Thành phần của EPS

Chức năng trong biofilm

Polysaccharide trung tính
Cấu trúc

Cấu tạo nên biofilm
Amyloid

Kênh dẫn



Thu nhận electron

Chất dinh dƣỡng

Các loại polymer

Nguồn cung cấp cacbon, nitơ,
photpho

Hoạt hóa
Hoạt hóa bề mặt

Thông tin di truyền

1.3.1.1.

Vai trò của protein ngoại bào

Nhìn chung, thành phần protein trong EPS là tƣơng đối lớn, song vai trò của
chúng trong màng sinh vật chƣa đƣợc biết đến một cách rõ ràng. Đối với một số
loại vi khuẩn protein đóng vai trò là pili roi curli và sợi amyloid đƣợc cho là yếu
tố quan trọng cho sự hình thành màng sinh vật. Ngoài ra, những enzym ngoại bào,
thông thƣờng là protease và glycosidase trong màng biofilm, đóng vai trò trao đổi
chất [33].
1.3.1.2.

Vai trò của polysaccharide ngoại bào

Polysaccharide là thành phần quan trọng để tạo nên cấu trúc hoàn chỉnh

cũng nhƣ có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào nhƣ lông roi lông nhung hỗ trợ cho việc
bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể. Giữa các tế bào trong hệ thống
mạng lƣới màng sinh vật có các kênh dẫn, cho phép di truyền ngang các tính trạng
mới trong quần thể sinh vật [6].
1.4.

Quá trình hình thành màng sinh vật

Dựa trên các phƣơng pháp phân tích di truyền học, proteomics và sinh học
phân tử, cùng với những phân tích về mặt cấu trúc, hóa học màng sinh vật, các nhà
khoa học đã đƣa ra một mô hình cấu trúc màng sinh vật cơ bản [8]. Trong mô hình
này, vi khuẩn hình thành nên các vi khuẩn lạc và đƣợc bao quanh bởi một mạng
lƣới chất ngoại bào giúp các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự
đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào đồng thời tạo nên
những kênh dẫn truyền dịch ngoại bào bên trong màng sinh vật. Nhờ đó dịch tế bào
có thể đi qua màng sinh vật tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh
dƣỡng đến khắp các tế bào trong màng cũng nhƣ loại bỏ các chất thải [34].
Sự tạo thành màng sinh vật cũng giống nhƣ một quá trình phát triển của vi
sinh vật và cần phải trải qua một số bƣớc bao gồm: sự gắn kết của các tế bào vi

Đoàn Diệu Linh

7

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
sinh vật trôi nổi tự do lên một bề mặt, sự tăng trƣởng và liên kết các tế bào thành vi
khuẩn lạc, sự tạo thành màng sinh vật trƣởng thành (hoàn chỉnh), và cuối cùng là sự

tế bào và giá thể. Việc chuyển từ giai đoạn bám dính thuận nghịch sang giai đoạn
bám dính không thuận nghịch đƣợc thực hiện nhờ lông roi, tiêm mao vào các sợi
bám dính. Trong khi sự vận động thông qua trung gian lông roi đƣợc đánh giá là
quan trọng trong bƣớc đầu thiết lập sự bám dính của vi sinh vật lên bề mặt thì vận
động co rút đƣợc chỉ ra là cần thiết cho sự trƣởng thành của màng sinh vật trong
điều kiện tĩnh.
Cụ thể nhu động co rút giúp cho sự hình thành nên các vi khuẩn lạc trong
màng sinh vật bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho tƣơng tác giữa các vi khuẩn với
bề mặt để hình thành nên các nhóm tế bào qua đó giúp tăng cƣờng mức độ bám
dính với bề mặt [30].
Giai đoạn 3: Hình thành mạng lƣới ngoại bào
Các hợp chất polymer ngoại bào tiếp tục đƣợc tạo ra bởi các tế bào để liên
kết các tế bào với nhau một cách có tổ chức đồng thời tạo thành cầu nối giữa các vi
khuẩn lạc. Chúng cũng có vai trò trong việc thu hút các tế bào sống trôi nổi (có thể
là từ nhiều loài khác nhau) trong môi trƣờng. Kết quả là mật độ tế bào trong một
màng sinh vật cũng nhƣ lƣợng các polymer ngoại bào tạo ra tăng lên. Một mạng
lƣới màng sinh vật dần đƣợc hình thành [34].
Giai đoạn 4: Hình thành một biofilm hoàn chỉnh
Khi tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch lên bề mặt thì quá trình
trƣởng thành của màng sinh vật bắt đầu. Trong suốt quá trình này, sự phân chia của
các tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch là nguyên nhân giúp các tế bào
phân chia để lan rộng và phát triển dần lên từ các điểm gắn kết để hình thành các vi
khuẩn lạc hay các cụm tế bào. Từ một phạm vi ban đầu biofilm có thể mở rộng về
không gian cũng nhƣ độ phức tạp tùy thuộc vào điều kiện môi trƣờng. Một biofilm
hoàn chỉnh có cấu trúc giống nhƣ tháp hình nấm đƣợc bao quanh bởi các kênh vận
chuyển nƣớc có tính thẩm thấu cao tạo điều kiện cho việc vận chuyển chất dinh
dƣỡng và oxy vào bên trong biofillm cũng đƣợc quan sát. Các biofilm phát triển khá
chậm thƣờng cần vài ngày để đạt đƣợc cấu trúc hoàn chỉnh. Một biofilm trƣởng
thành đƣợc coi nhƣ một tổ chức tiên tiến luôn có sự thích nghi liên tục với môi


chống lại tác động của một số kim loại nặng, các cation và chất độc; đồng thời bảo
vệ tế bào tránh khỏi nhiều yếu tố stress từ môi trƣờng nhƣ sự thay đổi độ pH, bức xạ
tia cực tím, áp suất thẩm thấu và sự khô hạn. Thành phần chính của màng sinh vật
chiếm tới 97% là nƣớc. Khả năng giữ nƣớc cao của mạng lƣới ngoại bào thông qua
các liên kết hydro trong cấu trúc màng giúp bảo vệ màng chống lại sự khô hạn trong
môi trƣờng tự nhiên [20].
1.5.2. Mối quan hệ hợp tác giữa các loài
Màng sinh vật đƣợc hình thành nhờ sự hợp tác cùng chung sống của nhiều
loài vi sinh vật tạo nên một quần xã vi sinh vật phức tạp. Khả năng tồn tại với
những điều kiện dinh dƣỡng khác nhau giúp các loài vi sinh vật tận dụng đƣợc tối
đa nguồn dinh dƣỡng trong môi trƣờng cũng nhƣ hỗ trợ nhau theo hƣớng cùng có
lợi trong chu trình chuyển hóa vật chất. Các loài vi sinh vật cũng có thể phối hợp
các cơ chế trao đổi chất để cùng phân giải một hợp chất hữu cơ thúc đẩy quá trình
tuần hoàn các nguyên tố trong tự nhiên.

Đoàn Diệu Linh

10

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
Môi trƣờng nội bào trong cấu trúc màng sinh vật cung cấp phƣơng tiện trao
đổi dinh dƣỡng và chuyển hóa chất hiệu quả thông qua các pha dung dịch lớn tăng
cƣờng khả năng hấp thụ dinh dƣỡng cũng nhƣ loại bỏ những sản phẩm trao đổi chất
có nguy cơ độc hại. Màng sinh vật cung cấp một môi trƣờng lý tƣởng cho sự thiết
lập mối quan hệ hợp dƣỡng giữa các loài vi sinh vật [14].
Các vi khuẩn tồn tại trong màng sinh vật, liên kết với nhau qua mạng lƣới
chất ngoại bào, sẽ có hiện tƣợng trao đổi gen từ tế bào này sang tế bào khác, giúp


11

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
lớn. Với những ƣu điểm này, các nhà khoa học đã đề xuất công nghệ xử lý nƣớc
thải ứng dụng màng sinh vật đƣợc xem là giải pháp thân thiện môi trƣờng [22].
1.7.

Vấn đề xử lý nƣớc thải
Ngày nay, vấn đề ô nhiễm nƣớc thải là một vấn đề lớn trong bối cảnh toàn

cầu nhƣ là một hệ quả của tiến trình công nghiệp hóa đô thị hóa, kết hợp với sự
tăng trƣởng dân số và sự thay đổi về lối sống. Việc xử lý nƣớc thải môi trƣờng
trong tình hình thực tiễn hiện nay là một vấn đề mang tính thời sự cấp thiết. Bởi lẽ
xử lý nƣớc thải không chỉ nhằm mục đích cải thiện điều kiện vệ sinh môi trƣờng
sống của con ngƣời mà còn nhằm duy trì cân bằng sinh thái, tạo điều kiện phát triển
bền vững lâu dài cho loài ngƣời.
Đặc trƣng của nƣớc thải sinh hoạt là hàm lƣợng chất hữu cơ lớn, chứa nhiều
vi sinh vật trong đó có các vi sinh vật gây bệnh. Khi xây dựng các công trình xử lý
nƣớc thải phải đạt đƣợc các yêu cầu về chất lƣợng nguồn nƣớc xả ra. Một trong
những chỉ tiêu cần đạt đƣợc là hàm lƣợng nitơ trong nƣớc thải. Hàm lƣợng nitơ
trong nƣớc thải cao làm ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời đến môi trƣờng và các
quá trình xử lý khác trong trạm xử lý nƣớc thải.
Có nhiều nguồn nitơ (từ tự nhiên và từ hoạt động của con ngƣời) có thể dẫn
dến ô nhiễm. Tuy nhiên, một trong số những nguồn ô nhiễm nitơ tiềm năng liên
quan đến cách hoạt động nông nghiệp, hoặc xử lý các rác thải sinh hoạt của con
ngƣời. Chẳng hạn nhƣ ở các hầm tự hoại cung cấp phân bón cho nông nghiệp, ở

(1)

5 CO2 + NH4+ + 10 NO2- + 2 H2O  10 NO3- + C5H7NO2 + H+

(2)

Các vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter sử dụng năng lƣợng lấy từ các
phản ứng trên để tự duy trì hoạt động sống và tổng hợp sinh khối. Cùng với quá
trình thu năng lƣợng, C5H7NO2 tạo thành dùng để tổng hợp nên sinh khối mới cho
tế bào vi khuẩn.
Quá trình nitrate hóa là giai đoạn cuối cùng của quá trình khoáng hóa các
chất hữu cơ có chứa nitơ. Nitrate hóa là quá trình hoàn thiện của các công trình xử
lý nƣớc thải bằng phƣơng pháp sinh học. Quá trình này tạo nên sự tích lũy oxy
trong các hợp chất nitơ để các quá trình oxy hóa sinh hóa các chất hữu cơ tiếp theo
có thể xảy ra khi lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc rất ít hoặc đã hết.
1.7.2. Quá trình phản nitrate hóa
Khi thiếu oxy và tồn tại nitrate hóa sẽ xảy ra quá trình ngƣợc lại: Tách oxy
khỏi nitrate và nitrite để sử dụng lại trong các quá trình oxy hóa các chất hữu cơ
khác. Quá trình này đƣợc thực hiện nhờ các vi khuẩn phản nitrate hóa (vi khuẩn
yếm khí tùy tiện). Trong điều kiện không có oxy tự do mà môi trƣờng vẫn còn chất
hữu cơ cacbon một số loại vi khuẩn khử nitrate hoặc nitrite để lấy oxy cho quá
trình oxy hóa các chất hữu cơ. Quá trình khử nitrate đƣợc biểu diễn theo phƣơng
trình phản ứng sau:
4 NO3- + 5Chữu cơ + 4 H+  5 CO2 + 2 N2 + 2 H2O
Trong những năm gần đây những nghiên cứu ứng dụng mạng lƣới màng
sinh vật trong xử lý nƣớc thải đang thu hút sự quan tâm trên thế giới. Đặc biệt việc
phân lập các chủng vi sinh vật vừa có khả năng phân hủy các hợp chất nitơ gây ô
nhiễm đồng thời vừa có khả năng tạo màng sinh vật là một hƣớng nghiên cứu hứa
hẹn đem lại nhiều tiềm năng cho việc xử lý nƣớc thải. Xuất phát từ thực tiễn đó


Nƣớc thải từ hầm Biogas làng Phú Bến, Thụy Hƣơng, Chƣơng Mỹ, Hà Nội.
Nƣớc thải từ khu vực đầm nuôi tôm ấp Xẻo Rừng, xã Ninh Thành Lợi, huyện
Hồng Dân, tỉnh Bạc Liêu.

A

B

Hình 4. Một số địa điểm, khu vực lấy mẫu trong đề tài
A. Nƣớc thải khu tập trung rác thải làng Vạn Phúc
B. Nƣớc thải đầm nuôi tôm Bạc Liêu
2.2.

Hóa chất, thiết bị

2.2.1. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng LB (Luria – Bertani broth hay Luria broth) (g/l)
Tryptone

10g

Cao nấm men

5g

NaCl

10g

Nƣớc cất


NaCl

2g

CaCO3

0,01g

Nƣớc cất

1 lít

pH = 7
Môi trƣờng phân lập Nitrobacter: môi trƣờng Winogradki 2 (g/l)
K2HPO4

1g

MgSO4.7H2O

0,5 g

FeSO4.7H2O

0,03 g

NaCl

0,3g


K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
HCl

3 ml

Nƣớc cất nóng

70 ml

Các hóa chất đƣợc hòa tan, làm lạnh về nhiệt độ phòng rồi định mức
đến 100ml với nƣớc khử ion
Dung dịch Sunfanilamide:
Hòa tan 0,6 g sunfanilamide (H2NC6H4SO2NH2) trong 50 ml nƣớc cất
khử ion nóng, làm lạnh, thêm 40ml dung dịch HCl đặc và định mức
đến 100ml
Dung dịch Naphtylendiamide dihydrochloride đƣợc chuẩn bị:
Hòa tan 0,1g Naphtylendiamide dihydrochloride (C10H7NHCH2NH2.2HCl)
trong 100ml nƣớc cất khử ion.
Các dung dịch thuốc thử đều đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thấp và
tránh ánh sáng.
2.2.3. Máy móc, thiết bị
Nồi khử trùng (ALP - Nhật Bản)
Máy lắc ổn nhiệt (Satorius - Đức)
Tủ cấy vi sinh vật (Aura vertical - Ý)
Cân điện tử 2 số lẻ (Kern - Đức)
Cân phân tích (Presica - Thụy Sỹ)

Các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi tĩnh trong điều kiện dinh dƣỡng thích hợp,
mạng lƣới màng sinh vật có thể đƣợc hình thành trên bề mặt các giá thể. Màng
biofilm đƣợc tạo thành có thể đƣợc phát hiện bằng cách nhuộm tím tinh thể
1%(w/v) [31]. Dung dịch tím kết tinh 1% có khả năng bắt màu với các tế bào sống.
Sự thay đổi về cƣờng độ màu thể hiện mức độ và số lƣợng các tế bào vi sinh vật.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Morikawa và cộng sự [26]
Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập đƣợc lắc kích hoạt với 15ml LB trong
bình tam giác ở 37oC trong 24 giờ. Hút một lƣợng thể tích dịch nuôi cấy bổ sung
vào 700 μl LB lỏng trong các ống eppendorf đã khử trùng sao cho mật độ tế bào xác
định bằng máy đo mật độ quang học OD620 đạt khoảng 0,3-0,4 và ủ trong điều kiện
tĩnh ở 37oC.
Sau khoảng thời gian từ 24 đến 48 giờ, các dịch nuôi cấy đƣợc loại bỏ khỏi
các ống eppendorf. Đánh giá mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trƣờng bằng
phƣơng pháp đo mật độ quang học ở bƣớc sóng 620nm (OD620) dịch nuôi cấy vi
khuẩn.
Quan sát khả năng tạo màng sinh vật: Mỗi ống eppendorf đƣợc rửa sạch 2
lần bằng nƣớc cất khử trùng. Sau đó mỗi ống eppendorf đƣợc bổ sung 1ml dung
dịch tím Gentian và giữ trong 25 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dung dịch nhuộm,
rửa sạch 2 lần bằng nƣớc cất và sau đó quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên
thành ống với tím kết tinh.

Đoàn Diệu Linh

18

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
Đánh giá mật độ tế bào trong biofilm: Các tinh thể tím bám trên thành

nuôi cấy, khả năng hình thành màng sinh vật của các chủng vi khuẩn đƣợc thực hiện
trong môi trƣờng có bổ sung các nồng độ muối NaCl khác nhau từ 0% đến 5%.
2.3.4. Khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ
Để kiểm tra khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ điển hình của các chủng
vi khuẩn, chúng tôi tiến hành thử với Kit thử API 20NE của hãng BioMérieus.
Hóa chất và thuốc thử cần thiết đƣợc cung cấp cùng với bộ kit. Các bƣớc tiến
hành đƣợc tóm tắt nhƣ sau
 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn không quá 24 giờ

Đoàn Diệu Linh

19

K53A Sinh học


Khóa luận tốt nghiệp
 Bổ sung khuẩn lạc vào nƣớc cất khử trùng sao cho giá trị hấp thụ ánh sáng
bƣớc sóng 600nm (OD600) đạt giá trị 0,132
 Bổ sung 200μl dịch vào các giếng thử từ NO3 đến 4-nitrophenyl-βDGalactopyranoside (PNPG) trong khay thử. Các giếng D-glucose
(GLU), L-arginine (ADH), Urea (URE) bổ sung thêm dầu khoáng.
 Bổ sung 200μl dịch vi khuẩn vào ống API AUX (đƣợc cung cấp trong kit
thử), rồi bổ sung 200μl dịch này vào các giếng còn lại
 Ủ khay thử trong 24 giờ ở 30oC
 Kiểm tra NO3: Thêm 1 giọt thuốc thử NIT1 và NIT2 (đƣợc cung cấp trong
bộ kit) vào giếng và so sánh kết quả với bảng đối chiếu kết quả. Nếu kết
quả âm tính thì bổ sung 2-3mg Zn để kiểm tra khả năng hình thành N2 rồi
so sánh kết quả sau 5 phút.
 Kiểm tra L-tryptophan (TRP): Thêm 1 giọt thuốc thử JAMES (đƣợc cung
cấp trong bộ kit) rồi so sánh kết quả

 Nhỏ dịch tẩy màu (ethanol 95%), giữ khoảng 30 giây, rửa nƣớc, thấm khô
 Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2 - 3 phút, rửa nƣớc để
khô trong không khí
 Quan sát dƣới kính hiển vi quang học: dùng vật kính dầu với độ phóng đại
100 lần và đƣa ra kết luận
2.3.6. Quan sát cấu trúc màng sinh vật bằng kỹ thuật ảnh chụp trên kính hiển
vi điện tử quét
Chuẩn bị mẫu màng sinh vật nổi: dung dịch nuôi cấy lắc chủng vi khuẩn
đƣợc bổ sung vào bình tam giác chứa 20ml môi trƣờng LB lỏng. Nuôi cấy tĩnh ở
37oC trong 24 giờ.
Màng sinh vật đƣợc làm vết bôi trên kính sau đó hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn
cồn để cố định.
Rửa nhẹ mẫu gắn màng sinh vật bằng nƣớc cất khử trùng để khô tự nhiên.
Mạ phủ mẫu bằng vàng trên máy JFC – 1200 trong 5 phút ở 30mA
Quan sát và chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét JSM - 5421LV (Nhật) tại
phòng chụp hiển vi điện tử quét thuộc Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trƣờng Đại
học Khoa học Tự nhiên.
2.3.7. Phƣơng pháp đo phân tích hàm lƣợng nitrate N-NO3-.
Nguyên tắc: Phản ứng giữa nitrate và brucide ở pH 2-3 tạo thành dung dịch
có màu vàng, nhận biết bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng
415nm (OD415) [4].
Phƣơng pháp tiến hành:
 Chuẩn bị 5ml mẫu
 Bổ sung 3ml dung dịch NaCl 30%
 Lắc trên máy lắc rung trong 5 giây

Đoàn Diệu Linh

21