Luận văn tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Với khoảng thời gian hơn bốn năm ngồi trên ghế giảng
đường, và đặc biệt là hơn bốn tháng làm luận văn tốt nghiệp
vừa qua, em đã trưởng thành rất nhiều trong việc nghiên cứu
cũng như trong rèn luyện nhân cách bản thân. Để có được
những điều này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến tất
cả các quý thầy cô trong trường Đại học Bách Khoa, và đặc
biệt là các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm, những
người đã giúp đỡ và dìu dắt em rất nhiều trên con đường trở
thành một kỹ sư, một trí thức trẻ trong tương lai.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến
thầy Lê Văn Việt Mẫn và cô Tôn Nữ Minh Nguyệt đã tận tình
hướng dẫn và chỉ bảo cho em trong thời gian làm luận văn vừa
qua.
Con xin cảm ơn bố mẹ đã hết lòng yêu thương, chăm sóc và
cổ vũ tinh thần cho con, giúp con vượt qua được những giai
đoạn khó khăn nhất trong công việc cũng như trong cuộc sống.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè tôi, những người đã
cho tôi hiểu thế nào là một tình bạn chân thành và đẹp đẽ,
những người đã luôn ở bên cạnh tôi động viên và giúp đỡ tôi.
TpHCM, ngày 10 tháng 01 năm 2007
Sinh viên
Nguyễn Thò Hiền Lương
Luận văn tốt nghiệp
MỤC LỤC
Chương 1: GIỚI THIỆU................................................................1
Thời gian lên men dài, năng suất lên men thấp..................................................................1
Tiêu tốn nhiều năng lượng để tách nấm men ra khỏi rượu vang sau quá trình lên men...1
Khả năng tái sử dụng nấm men rất thấp.............................................................................1
Khó tự động hóa quá trình lên men.....................................................................................1

Nitơ 5
Acid hữu cơ.....................................................................................................................5
SO2 7
Tannin.............................................................................................................................7
Tannin thủy phân: có nguồn gốc từ các acid phenolic như là acid gallic và acid ellagic. 7
i
Luận văn tốt nghiệp
Tannin ngưng tụ: là polymer của flavan-3-ol (epicatechin, catechin và gallocatechin) và
flavan-3,4-diol........................................................................................................................7
2.1.3 Nấm men.................................................................................................................8
Thứ nhất gọi là non-Saccharomyces (NS – là những loài nấm men không thuộc giống
Saccharomyces), thường xuất hiện trên bề mặt của trái nho cùng với nhiều loại vi sinh
vật khác. Hầu hết các loài NS không có khả năng tồn tại khi nồng độ cồn cao hơn 6%v/v
(ngoại trừ Brettanomyces bruxellensis có thể phát triển trong môi trường có nồng độ cồn
lên đến 12%). Trước đây, nấm men NS được xem là các vi sinh vật gây hư hỏng. Tuy
nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, một số loài nấm men NS có lợi cho chất
lượng rượu vang, giúp tăng cường hương vò của rượu vang [23, 41, 42, 45, 149, 166, 207].
8
Nhóm khác góp phần vào hương vò rượu vang, cũng là nhân tố chính của quá trình lên
men cồn là các loài thuộc giống Saccharomyces. Saccharomyces có khả năng chòu đựng
sự thay đổi của điều kiện môi trường với nồng độ ethanol và acid hữu cơ tăng và sự cạn
kiệt chất dinh dưỡng (Pretorius, 2000). Như vậy, mặc dù có nhiều giống và loài nấm men
trong dòch nho, nhưng giống Saccharomyces, mà chủ yếu là loài Saccharomyces
cerevisiae mới là loài đảm nhiệm việc thực hiện các quá trình chuyển hóa sinh học quan
trọng trong lên men vang. Chính vì thế, Saccharomyces cerevisiae còn được gọi là “nấm
men vang” [58, 85, 92, 149, 166, 199]. .................................................................................9
Bước thứ nhất là bước chọn lọc sơ bộ dựa trên khả năng chòu đựng đối với SO2, các loài
có hại, khả năng phát triển tại nhiệt độ cao và sự tạo bọt thấp.........................................10
Bước thứ hai là bước chọn lọc chính thức dựa trên hàm lượng acid dễ bay hơi và ethanol
tạo thành cũng như hàm lượng đường sót còn lại trong rượu vang.....................................10

[113, 138]..............................................................................................................................13
15. Các vật liệu vô cơ: polygorskite, montmorilonite, hydromica, sứ xốp, thủy tinh xốp,
vòng Raschig, silicate, hợp chất titanium, … [113, 138]......................................................13
16. Polymer tự nhiên [113]:................................................................................................13
17. Polysaccharide: alginates, κ-carrageenan, agar, chitosan và polygalacturonic acid.. 13
18. Polymer khác: gelatin, collagen và polyvinyl alcohol.................................................13
19. Polymer tổng hợp: polyacrylamide, polyurethane và polyvinyl chloride [138]..........13
2.2.2 Các chất mang cố đònh nấm men trong sản xuất rượu vang................................13
2.2.3 Cố đònh nấm men trong gel alginate....................................................................19
Là thành phần cấu trúc của tảo nâu biển (Phaeophyceae), chiếm đến 40% khối lượng
chất khô................................................................................................................................19
Là polysaccharide màng bao trong các loại vi khuẩn đất.................................................19
Block M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau.....................................................19
Block G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau..........................................................19
Block MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nối với nhau....19
Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài...............................................20
Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên trong................................................21
Ưu điểm.........................................................................................................................21
Quá trình cố đònh dễ thực hiện [10, 35, 102, 103, 115, 176, 192, 194, 209].....................21
Điều kiện cố đònh ôn hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất. Do đó, các tế bào
cố đònh không bò mất hoạt tính [10, 35, 102, 103, 115, 176, 209, 211]...............................21
Alginate là chất mang trơ về mặt hóa học [176]...............................................................21
Alginate không có độc tính, thích hợp cho các sản phẩm thực phẩm [10, 103, 169, 176,
192].21
Độ xốp của mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán cơ chất và sản phẩm [8, 27]..........21
Gel alginate vẫn giữ được độ bền khi nhiệt độ lên men cao [205]..................................22
Nhược điểm và cách khắc phục....................................................................................22
Độ bền gel giảm theo thời gian lên men do [113, 114, 115, 176, 194, 209, 211]:...........22
Gel Ca-alginate rất nhạy với các chất tạo chelate (hợp chất hữu cơ trong đó nguyên tử
tạo thành nhiều hơn một liên kết phối trí với các kim loại trong dung dòch) như phosphate,

[101, 116, 144, 173, 181, 192, 193]. Kazuaki và cộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu và
kết luận rằng gel alginate giàu G thích hợp để cố đònh nấm men hơn vì gel này ít gây cản
trở đến khả năng khuếch tán của glucose và có độ bền cơ học cao hơn [210]..................23
nh hưởng của nồng độ alginate..................................................................................24
nh hưởng của pH tạo gel............................................................................................24
nh hưởng của nhiệt độ tạo gel...................................................................................24
nh hưởng của mật độ tế bào trong hạt.......................................................................24
nh hưởng của tỷ lệ S/V..............................................................................................24
2.2.4 Một số tính chất của nấm men cố đònh................................................................25
Banyopadhyay và cộng sự (1982) đã tiến hành nghiên cứu khảo sát quá trình sinh trưởng
của nấm men cố đònh trên thủy tinh xốp (Controled pore glass) bằng phương pháp hấp
phụ. Khả năng sinh trưởng của nấm men tự do và cố đònh được đánh giá gián tiếp thông
qua tốc độ hấp thu O2 và tốc độ sinh CO2. Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm men cố đònh
có hiện tượng giảm khả năng hấp thu O2 và sinh CO2 so với nấm men tự do [16]..........25
Doran và cộng sự (1985) cũng tiến hành khảo sát quá trình sinh trưởng của nấm men
Saccharomyces cerevisiae cố đònh trên gelatin. Kết quả thực nghiệm thu được tương tự
như kết quả của Bandyopadhyay và cộng sự (1982). Ngoài ra tác giả còn nhận thấy rằng
tốc độ sinh trưởng và tỷ lệ nảy chồi của nấm men cố đònh trên gelatin đều thấp hơn so với
nấm men tự do [56]..............................................................................................................25
iv
Luận văn tốt nghiệp
Hệ lên men sử dụng nấm men cố đònh là một hệ phản ứng dò thể, trong đó, các chất dinh
dưỡng có xu hướng tập trung trên bề mặt chất mang, vì vậy nấm men hấp phụ trên bề
mặt chất mang có điều kiện tiếp xúc với nồng độ chất dinh dưỡng cao hơn so với trong
môi trường đồng thể. Chính sự thay đổi áp lực thẩm thấu một cách đột ngột gây mất cân
bằng trao đổi chất qua màng tế bào, làm ảnh hưởng đến quá trình hô hấp của tế bào [16].
25
Chồi có thể được hình thành ở bất kỳ vò trí nào trên bề mặt tế bào nấm men
Saccharomyces cerevisiae, tuy nhiên phổ biến nhất là chồi sẽ mọc ở các cực ellipsoide
của tế bào nấm men lưỡng bội. Vì vậy khi 1 cực của tế bào nấm men gắn vào chất mang

và hấp phụ trên cellulose thì có khả năng sống sót cao hơn nhiều so với nấm men tự do,
lần lượt là 72 và 62% [117]..................................................................................................27
v
Luận văn tốt nghiệp
Holcberg và Margalith (1981) cho rằng hàm lượng glucose 40 và 50%w/w sẽ ức chế tế
bào tự do, làm cho quá trình lên men hầu như không xảy ra, trong khi đó tế bào cố đònh
vẫn có thể lên men mặc dù tốc độ chậm [91].....................................................................27
Sự có mặt của chất mang đã bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của hàm lượng cồn cao và
ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu cao do đường gây ra [12, 113, 117, 133, 150, 206]......28
Nấm men cố đònh tạo thành glycerol nhiều hơn. Glycerol có tác dụng làm cân bằng thế
oxy hóa khử nội bào của nấm men hoặc sự cân bằng NAD+/NADH và hoạt động như là
một chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu đối với áp lực thẩm thấu cao của đường trong suốt
quá trình lên men. Nhiều tác giả cũng cho rằng khi hàm lượng đường càng tăng thì lượng
glycerol tạo thành cũng tăng [15, 43, 52, 60]......................................................................28
Nấm men cố đònh chứa lượng acid béo no cao hơn so với nấm men tự do, nên làm tăng
khả năng chòu nồng độ cồn cao. Mức độ no của acid béo càng tăng sẽ làm tăng khả năng
chòu đựng đối với ethanol. Agudo (1992) cũng nhận thấy rằng các giống Saccharomyces
chòu cồn có chỉ số không no thấp hơn so với các chủng ít chòu cồn [53, 117, 150]............28
Nấm men cố đònh có sự thay đổi về khả năng vận chuyển các chất qua màng, do đó làm
tăng khả năng giải phóng ethanol nội bào ra ngoài môi trường. Nagodawithana và
Steinkraus (1976) cho rằng khả năng chòu cồn tùy thuộc vào khả năng tế bào giải phóng
ethanol nội bào ra ngoài môi trường [150, 163, 206]..........................................................28
Có hoạt tính enzyme ADH (là enzyme xúc tác phản ứng chuyển hóa acetaldehyde thành
ethanol) cao hơn [59]...........................................................................................................28
Tạo thành nhiều ester hơn. Do việc cố đònh các tế bào nấm men có thể làm thay đổi
hoạt động của các enzyme acetyl-transferase theo hướng tích cực hơn, do đó làm tăng
quá trình tổng hợp ester [20, 56, 113, 131, 133, 135, 193, 208]..........................................29
Tạo thành ít diacetyl hơn [113]..........................................................................................29
Tạo thành ít acetaldehyde hơn [193, 196, 208].................................................................29
Tạo thành ít methanol hơn [196, 208]................................................................................29

men hoặc qúa trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn rất cao......................40
Khi khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến động học quá trình lên men rượu vang sử dụng
nấm men cố đònh trên DCM, Bardi và Koutinas (1994) nhận thấy rằng khi nhiệt độ lên
men giảm từ 30 xuống 15oC, thời gian lên men của rượu vang sử dụng nấm men cố đònh
tăng 158%, trong khi đó nấm men tự do tăng tới 331%. Kết quả được minh họa như trong
Hình 2 .22 [17].....................................................................................................................41
Bakoyianis và cộng sự (1997) đã tiến hành cố nấm men lần lượt trên 3 chất mang là
kissiris, γ-alumina và calcium alginate và tiến hành lên men ở các nhiệt độ khác nhau là
7, 13 và 27oC. Trong tất cả các trường hợp, tốc độ lên men của các tế bào cố đònh cao
gấp 2 – 3 lần so với tế bào tự do, và sự khác biệt về tốc độ lên men càng tăng khi nhiệt
độ càng giảm [14]. ..............................................................................................................42
Bardi và cộng sự (1996) đã nghiên cứu quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men
cố đònh trên gluten tại nhiệt độ phòng và nhiệt độ thấp. Kết quả cho thấy rằng tốc độ lên
men của nấm men cố đònh cao hơn nhiều so với nấm men tự do. Khi nhiệt độ giảm từ 30
xuống 15oC, thời gian lên men của nấm men cố đònh tăng 22%, trong khi đó, nấm men tự
do tăng 76% [18]..................................................................................................................42
2.4 ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TRONG SẢN XUẤT RƯU VANG.....43
2.4.1 Dùng kỹ thuật cố đònh để khắc phục một số vấn đề trong sản xuất rượu vang..43
Cung cấp thêm chất dinh dưỡng (ammonium phosphate, chất chiết nấm men) [163].....46
Cấy lại bằng nấm men mới [163]......................................................................................46
Hấp phụ các acid béo lên than hoạt tính [163].................................................................46
2.4.2 Dùng kỹ thuật cố đònh trong một số phương pháp lên men.................................46
M. Iconomopoulou và cộng sự (2002) đã nghiên cứu khả năng ứng dụng của nấm men
cố đònh sấy thăng hoa (FGB) trong công nghiệp và nhận thấy rằng tuy ở chu kỳ 1, thời
gian lên men và năng suất lên men không có sự khác biệt so với nấm men tự do (ffdc)
nhưng ở chu kỳ 2, nấm men cố đònh cho năng suất lên men cao hơn hẳn và tốc độ lên
men tăng lên đáng kể (Hình 2 .24) [93].............................................................................46
Bardi và cộng sự (1997) đã lần lượt cố đònh nấm men trên 2 loại chất mang là DCM và
gluten để sử dụng cho quá trình lên men tónh nhiều chu kỳ tại các nhiệt độ khác nhau.
Kết quả cho thấy nấm men cố đònh trên DCM có thể sử dụng trong 43 chu kỳ, trong khi

hợp cồn khi lên men theo phương pháp liên tục cao hơn so với phương pháp lên men tónh
(bảng 2.11) [14]....................................................................................................................48
Kourkoutas và cộng sự (2002) đã thực hiện quá trình lên men rượu vang liên tục sử dụng
chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae ưa lạnh cố đònh trên miếng táo. Kết quả
nghiên cứu cho thấy rằng năng suất lên men theo phương pháp này cao hơn nhiều so với
phương pháp lên men tónh truyền thống. Năng suất lên men cồn ở 5oC thì bằng với năng
suất lên men cồn ở 22 – 25oC theo phương pháp truyền thống. Bình lên men có thể vận
hành liên tục trong vòng 95 ngày mà không làm giảm năng suất tạo cồn. Đồng thời, hàm
lượng rượu bậc cao và acetaldehyde trong rượu vang này thì thấp hơn so với rượu vang
lên men theo phương pháp lên men tónh truyền thống (bảng 2.12). Điều đó chứng tỏ rằng
chất lượng rượu vang đã được cải thiện [112]. Một nghiên cứu khác của Kourkoutas và
cộng sự (2005) khi sử dụng chất mang là miếng táo, mộc qua và lê cũng cho kết quả
tương tự [107].......................................................................................................................48
Ogbonna và cộng sự (1989) đã tiến hành quá trình lên men rượu vang theo phương pháp
liên tục trong thiết bò phản ứng sinh học nhiều cấp (multistage bioreactor) sử dụng các đóa
sinh học (bioplate) làm tác nhân lên men. Các đóa sinh học này chính là nấm men cố đònh
trên các đóa thủy tinh đã được gia công tạo mặt lưới. Kết quả nghiên cứu cho thấy quá
viii
Luận văn tốt nghiệp
trình lên men liên tục sử dụng nấm men cố đònh trên đóa thủy tinh không những có tính ổn
đònh cao, bền trong thời gian dài sử dụng mà còn có khả năng tạo sản phẩm có chất lượng
không thua kém sản phẩm tạo ra theo phương pháp lên men truyền thống [152].............49
2.4.3 Dùng kỹ thuật cố đònh trong sản xuất một số loại rượu vang..............................49
Làm lạnh để giảm tốc độ lên men.....................................................................................49
Tách dòch lên men ra khỏi nấm men (bằng cách xử lý với bentonite rồi lọc).................49
Thêm SO2 sau khi lọc xong...............................................................................................49
Sử dụng nấm men cố đònh không gây ra bất cứ sự thay đổi đáng kể nào trong quá trình
lên men.................................................................................................................................50
Tế bào giải phóng ra không ảnh hưởng đến độ trong của rượu vang...............................50
Các thành phần chính như ethanol, acid hữu cơ, nitơ tổng và rượu bậc cao không có sự

Nhỏ từng giọt hỗn hợp alginate natri-nấm men vào dung dòch CaCl2 2%. Đường kính
ống nhỏ giọt 3mm, lỗ ra đặt cách mặt trên của dung dòch CaCl2 2cm, hạt được tạo thành
ix
Luận văn tốt nghiệp
có đường kính khoảng 4÷5mm. Dung dòch CaCl2 được khuấy đảo liên tục trên bàn khuấy
từ với tốc độ 100÷200 vòng/phút. Mỗi giọt hỗn hợp alginate nấm men rơi xuống dung
dòch sẽ tạo thành một hạt nấm men cố đònh........................................................................56
Ngâm hạt.......................................................................................................................56
Hạt nấm men cố đònh tạo ra được ngâm trong dung dòch CaCl2 2% trong 2 giờ, tốc độ
khuấy đảo hạt vẫn giữ từ 100÷200 vòng/phút. Ta phải thay mới dung dòch CaCl2 2% sau
mỗi giờ ngâm để nồng độ ion Ca2+ trong dung dòch không bò giảm xuống quá thấp. ...56
Rửa hạt..........................................................................................................................56
Chắt bỏ dung dòch CaCl2, rửa lại hạt gel bằng nước cất và dòch lên men để muối CaCl2
không còn bám trên bề mặt hạt gel. Chúng tôi tiến hành rửa hạt gel 2 lần bằng nước cất
và một lần bằng dòch lên men cho tất cả các thí nghiệm...................................................56
Hạt sau khi được tạo thành phải được tiến hành lên men ngay. Nếu muốn bảo quản hạt
thì cho hạt gel chứa nấm men cố đònh vào dung dòch CaCl2 0,4%, bảo quản ở 5oC trong
vòng tối đa là 24h.................................................................................................................56
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến động học quá trình lên
men rượu vang nho sử dụng nấm men cố đònh trong gel alginate..................................56
3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến động học quá trình lên
men rượu vang nho, sử dụng nấm men cố đònh trong gel alginate.................................57
3.2.5 Xử lý kết quả........................................................................................................57
Dựng đồ thò biểu diễn sự thay đổi mật độ nấm men theo thời gian:................................57
X = x(t) .............................................................................................................................57
Xác đònh tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men theo thời gian: .....................................57
57
Dựng đồ thò µ = f(t). Từ đó xác đònh được tốc độ sinh trưởng riêng cực đại µmax trên đồ
thò. 58
Kiểm tra ANOVA để so sánh giá trò µmax giữa các mẫu thí nghiệm với nhau...............58

Hòa tan 1g DNS (C7H4N2O7) và 1,6g NaOH trong khoảng 60 – 70mL nước cất. Sau đó
cho 30g Kali Natri Tartrate (C4H4O6KNa.4H2O) vào hỗn hợp trên và khuấy cho tan
hoàn toàn..............................................................................................................................59
Chuyển dung dòch trên vào bình đònh mức 100mL và đònh mức đến vạch......................59
Dung dòch sau khi pha được bảo quản trong chai thủy tinh màu ở điều kiện lạnh (6-8oC),
dùng tốt nhất trong 15 ngày.................................................................................................59
Dung dòch đường chuẩn................................................................................................59
Dung dòch đường chuẩn là dung dòch chứa hỗn hợp glucose và fructose với tỉ lệ 1:1
(w:w), có nồng độ là 2g/L....................................................................................................59
Xử lý mẫu......................................................................................................................60
Vì trong dòch nho có chứa nhiều acid hữu cơ, các chất màu và nhiều tạp chất khác nên ta
phải tiến hành xử lý mẫu hợp lý để không làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.........60
Dựng đường chuẩn........................................................................................................60
Lần lượt cho 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1mL dung dòch chuẩn 2g/L vào 5 ống nghiệm khác
nhau. ....................................................................................................................................60
Sau đó, lần lượt thêm vào các ống nghiệm 2,8; 2,6; 2,4; 2,2 và 2mL nước cất theo đúng
thứ tự ống nghiệm như trên..................................................................................................60
Cho thêm vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dòch DNS, lắc đều.........................................60
Dùng một miếng nylon sạch bòt kín miệng ống nghiệm và tiến hành đun cách thủy ở
nhiệt độ 100oC trong thời gian 5 phút.................................................................................60
Làm nguội nhanh dung dòch, cho thêm 10mL nước cất và lắc đều cho đến khi dung dòch
không còn phân lớp..............................................................................................................60
Đo độ hấp thu A ở bước sóng λ = 540nm..........................................................................60
Làm mẫu trắng với 1mL nước cất để hiệu chỉnh máy so màu về 0.................................60
Từ các kết quả đo được, ta tiến hành xây dựng đường chuẩn C = f(A). ..........................60
Xác đònh hàm lượng đường khử trong mẫu thí nghiệm...............................................60
Pha loãng mẫu sao cho nồng độ đường khử trong mẫu ≤ 2g/L.........................................60
Lấy vào ống nghiệm 1mL mẫu, 2mL nước cất và 1mL dung dòch DNS, lắc đều. Sau đó
tiến hành tương tự như trên..................................................................................................60
Từ đồ thò đường chuẩn ta xác đònh đường nồng độ đường khử có trong mẫu nghiên cứu.

Sodium hypochlorite 5%: đây là dung dòch có bán sẵn trên thò trường. Dung dòch này
dùng trong 2 tháng...............................................................................................................62
Dung dòch oxy hóa: trộn 100mL dung dòch alkaline citrate với 25mL sodium
hypochlorite. Dung dòch này chỉ dùng trong 1 ngày............................................................62
Dung dòch chuẩn N 1g/L: hòa tan 4,7143g (NH4)2HPO4 trong nước cất và đònh mức
thành 1L. ..............................................................................................................................62
Dung dòch chuẩn N 10mg/L: hút 10mL dung dòch chuẩn N 1g/L và đònh mức thành 1L.62
Từ dung dòch chuẩn N 10mg/L pha loãng thành 5 dung dòch chuẩn: 0,1mg/L; 0,2mg/L;
0,3mg/L; 0,4mg/L và 0,5mg/L.............................................................................................62
Cho 25mL mẫu vào erlen 50mL, thêm vào đó:................................................................62
Bao erlen bằng màng plastic, để ở nhiệt độ phòng (22 - 27oC) ở nơi có ánh sáng nhẹ
trong vòng ít nhất là 1h. Dung dòch bền màu trong vòng 24h.............................................62
Dựng đường chuẩn: tiến hành tương tự như trên với các dung dòch chuẩn 0,1mg/L;
0,2mg/L; 0,3mg/L; 0,4mg/L và 0,5mg/L.............................................................................62
Cũng tiến hành tương tự với mẫu nước cất để hiệu chỉnh máy về 0................................62
Đo màu ở bước sóng 640nm..............................................................................................62
3.3.6 Hàm lượng tannin [4]............................................................................................63
xii
Luận văn tốt nghiệp
Xác đònh hàm lượng tannin bằng phương pháp so màu sử dụng thuốc thử Folin – Denis.
63
Tannin bò oxy hóa bởi acid phosphomolybdic tạo thành hợp chất có màu xanh..............63
Thuốc thử Folin – Denis: cho 100g Na2WO4.2H2O, 20g acid phosphomolybdic và 50mL
H3PO4 vào 750mL nước, cho chảy ngược dòng trong 2h, làm nguội, và pha loãng đến 1L.
63
Dung dòch Natri carbonate bão hòa: cho 35g Na2CO3 khan vào 100mL nước, hòa tan ở
70-80oC, sau đó để nguội qua đêm. Dung dòch quá bão hòa chứa các mầm tinh thể
Na2CO3.10H2O. Sau khi kết tinh, lọc tinh thể qua len thủy tinh.......................................63
Dung dòch chuẩn acid tannic: 0,1g/L. Hòa tan 0,1g acid tannic trong 1L. Chuẩn bò dung
dòch mới cho mỗi lần xác đònh.............................................................................................63

Hàm lượng mg sulfur dioxide tự do trong một lít rượu vang:............................................64
Hàm lượng mg sulfur dioxide tổng trên một lít rượu vang:..............................................64
xiii
Luận văn tốt nghiệp
3.3.8 Hàm lượng ethanol [4]..........................................................................................64
Cho 20mL mẫu vào bình cất 250mL, ghi lại nhiệt độ......................................................64
Thêm vào đó 20mL nước cất.............................................................................................64
Bình hứng được đặt trong chậu thủy tinh chứa hỗn hợp nước và đá để làm lạnh............64
Đun nhẹ bình cất (để tránh bọt không trào sang bầu bảo hiểm). Tăng nhiệt độ bình cất
khi bắt đầu sôi đều...............................................................................................................64
Chưng cất cho đến khi gần đạt 20mL, và pha loãng thành 20mL tại cùng nhiệt độ. ......64
Chuẩn bò bình tỷ trọng..................................................................................................65
Rửa sạch bình tỷ trọng, tráng 3 lần bằng nước cất, 2 lần bằng etanol 96%, hay 2 lần
bằng ete etylic hoặc aceton.................................................................................................65
Làm khô ngoài không khí hoặc sấy nhẹ ở 50oC trong 30 phút. Sau đó cân để biết khối
lượng bình.............................................................................................................................65
Xác đònh khối lượng bình và nước cất..........................................................................65
Từ từ cho nước cất vào bình tỷ trọng. Rót nhẹ theo thành bình để tránh tạo thành bọt
khí. Rót đầy đến miệng bình. ..............................................................................................65
Đậy nút bình tỷ trọng và ngâm trong bể điều nhiệt sao cho mực nước của bể trên vạch
mức của bình tỷ trọng..........................................................................................................65
Sau 30 phút, mở nút và dùng pipette hút bớt nước cất cho đến khi đáy của mặt khum
tiếp xúc với vạch mức..........................................................................................................65
Dùng giấy lọc lau khô bên trong cổ của bình tỷ trọng, nút và ngâm trong nước tại nhiệt
độ phòng trong vòng 15 phút...............................................................................................65
Đưa bình tỷ trọng ra khỏi nước. ........................................................................................65
Rửa bình tỷ trọng bằng bông thấm nước etanol 96% cho hết nước bám ngoài bình. Dùng
bông hoặc khăn sạch lau khô bình. Khi lau chỉ cầm ở cổ bình để tránh không gây ra sự
thay đổi nhiệt độ của dung dòch trong bình. Tránh không để sợi bông bám lại ở ngoài
thành bình. ...........................................................................................................................65

Đối với nấm men cố đònh: rã hạt bằng dung dòch EDTA 5%, sau đó pha loãng mẫu đến
nồng độ cần thiết rồi đếm trên buồng đếm Thoma............................................................66
KẾT QUẢ và BÀN LUẬN...........................................................67
3.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯNG ĐƯỜNG ĐẾN ĐỘNG HỌC QUÁ
TRÌNH LÊN MEN RƯU VANG SỬ DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG GEL
ALGINATE..........................................................................................................................67
3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình sinh trưởng
của nấm men....................................................................................................................67
Mật độ tế bào nấm men cố đònh cực đại ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần
lượt là 155,13.106 tế bào/mL và 222,5.106 tế bào/mL. Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại
của nấm men cố đònh ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 0,248 và
0,344 h-1. .............................................................................................................................67
Mật độ tế bào nấm men tự do cực đại ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần
lượt là 164,06.106 tế bào/mL và 240,63.106 tế bào/mL. Tốc độ sinh trưởng riêng cực đại
của nấm men tự do ứng với hàm lượng đường 200g/L và 240g/L lần lượt là 0,458 và
0,764 h-1. .............................................................................................................................67
Khi nồng độ cơ chất đạt đến một giá trò tới hạn nào đó, hoạt độ nước giảm và xảy ra sự
co tế bào chất làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men [12]................................67
Patterson và cộng sự (1995) cho rằng áp suất thẩm thấu cao làm bất hoạt các enzyme
quan trọng đảm nhiệm nhiệm vụ sao mã DNA [123].........................................................67
Cheftel (1995) thì cho rằng khi tế bào chòu áp lực thẩm thấu cao, pH nội bào giảm đi 0,2
đơn vò. Do đó, hoạt động của nấm men sẽ bò ức chế vì pH nội bào thấp [123].................67
Sự có mặt của chất mang đã bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu do
hàm lượng đường cao gây ra. Trong khi nấm men tự do phải tiếp xúc ngay với môi trường
có hàm lượng đường cao thì nhờ có lớp chất mang, nấm men cố đònh tiếp xúc chậm hơn,
do đường cần có thời gian để khuếch tán từ bên ngoài vào bên trong chất mang, nhờ đó
nấm men cố đònh ít bò ức chế hơn [12]................................................................................70
Theo Vieira và cộng sự (1989), khả năng chòu đựng đối với áp lực thẩm thấu của
glucose càng tăng khi môi trường chứa càng nhiều ion Ca2+ và/hoặc Zn2+ [198]. Như
vậy, do cố đònh trong gel Ca-alginate nên trong môi trường lên men của nấm men cố đònh

dòch lên men còn sót lại một ít nitơ ammonium (4,25mg/L) thì trong tất cả các trường hợp
còn lại, hàm lượng nitơ gần như bằng 0 sau 60h lên men...................................................79
Đối với nấm men tự do, khi hàm lượng đường nằm trong khoảng 200 – 240g/L thì sau
60h lên men, hàm lượng nitơ ammonium gần bằng 0. Khi hàm lượng đường tăng lên đến
280g/L thì thời gian để hàm lượng nitơ ammonium được sử dụng hết bởi nấm men là 84h,
còn khi hàm lượng đường là 320g/L thì thời gian này là 108h. Đặc biệt, khi dòch nho chứa
360g/L đường, nitơ ammonium không được sử dụng hết, hàm lượng nitơ ammonium còn
sót lại trong môi trường là 13mg/L......................................................................................79
3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình tạo sản phẩm
81
Được bao bọc và bảo vệ bởi lớp vật liệu gel [113, 150, 206, 117, 133]...........................82
Có sự thay đổi về khả năng vận chuyển các chất qua màng, do đó làm tăng khả năng
giải phóng ethanol nội bào ra ngoài môi trường [150, 163, 206].......................................82
Có hoạt tính enzyme ADH cao hơn [59]...........................................................................82
xvi
Luận văn tốt nghiệp
Nấm men cố đònh có khả năng sử dụng đường tốt hơn so với nấm men tự do nên hàm
lượng đường sót trong dòch lên men còn thấp, do đó nấm men cũng như vi khuẩn ít có khả
năng sử dụng đường để chuyển hóa thành các loại acid dễ bay hơi (acid acetic là acid dễ
bay hơi chiếm ưu thế)...........................................................................................................89
Quá trình cố đònh ảnh hưởng đến hình thái và hoạt động trao đổi chất của nấm men nên
đã làm giảm khả năng chuyển hóa đường thành acid acetic của nấm men.......................89
Dòch lên men bằng nấm men cố đònh có pH thấp hơn so với dòch lên men bằng nấm men
tự do. Mà như chúng ta đã biết, rượu vang pH thấp có độ bền sinh học và độ bền hóa lý
cao hơn rượu vang pH cao, đồng thời cường độ màu và độ bền màu cũng cao hơn [59].
Khi pH thấp, SO2 ở dạng tự do nhiều hơn, do đó mà khả năng ức chế vi khuẩn và nấm
men dại cũng tốt hơn............................................................................................................90
Dòch lên men bằng nấm men cố đònh có hàm lượng acid dễ bay hơi thấp hơn so với nấm
men tự do. Mà như chúng ta cũng đã biết, acid dễ bay hơi là hợp chất không mong muốn
trong sản xuất rượu vang. Dựa trên quan điểm này chúng tôi cho rằng nấm men cố đònh

Luận văn tốt nghiệp
Wauters và cộng sự (2001b) thì cho rằng acid tannic ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp
chuỗi hô hấp (functional respiratory chain), dẫn đến hiện tượng thiếu hụt sắt, do đó làm
giảm tốc độ sinh trưởng của nấm men [204].......................................................................91
Một giả thuyết khác là acid tannic ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp các acid béo không
no và/hoặc sterol, do đó làm giảm khả năng hấp thu O2 của nấm men, vì thế tốc độ sinh
trưởng của nấm men giảm. Hoặc cũng có thể acid tannic liên kết mạnh với các thành
phần này (đây là các lipid màng) nên đã làm giảm khả năng hấp thu O2 (Wauters và
cộng sự, 2001a,2001b; Mazauric và Salmon, 2005) [95, 203, 204]....................................91
3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình sử dụng cơ
chất trong quá trình lên men............................................................................................95
Hàm lượng đường sót thấp hơn..........................................................................................99
Tốc độ sử dụng đường cực đại cao hơn và thời gian để tốc độ sử dụng đường đạt đến giá
trò cực đại cũng ngắn hơn.....................................................................................................99
Tốc độ sử dụng đường riêng cao hơn hẳn..........................................................................99
Tốc độ sử dụng đường trung bình cao hơn.........................................................................99
Thời gian lên men ngắn hơn..............................................................................................99
3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình tạo sản phẩm
102
3.5.4 Kết luận chung....................................................................................................110
Khi hàm lượng tannin thấp (1,8 – 2,8g/L) thì mật độ tế bào cực đại và tốc độ sinh trưởng
riêng cực đại của tế bào cố đònh thấp hơn so với tế bào tự do. Nhưng khi hàm lượng
tannin cao thì mật độ tế bào cực đại và tốc độ sinh trưởng riêng cực đại của tế bào cố
đònh lại cao hơn so với tế bào tự do. Như vậy, khả năng sinh trưởng của nấm men cố đònh
ít bò ảnh hưởng bởi hàm lượng tannin hơn so với nấm men tự do.....................................110
Tốc độ sử dụng đường cũng như tốc độ sinh tổng hợp cồn của nấm men cố đònh cao hơn
so với nấm men tự do nhưng hiệu suất sinh tổng hợp cồn thì không cao hơn. ................110
Khả năng sử dụng nitơ ammonium cũng như nitơ hữu cơ của tế bào cố đònh cao hơn so
với tế bào tự do. ................................................................................................................110
pH và acid tổng của dòch lên men bằng nấm men cố đònh thấp hơn, do đó làm tăng độ

Bảng 2.4: So sánh các kỹ thuật cố đònh tế bào (còn nữa)..................12
Bảng 2.5: Một số chất mang sử dụng để cố đònh nấm men trong sản
xuất rượu vang (còn nữa)............................................................14
Bảng 2.6: Tốc độ sử dụng cơ chất và hình thành sản phẩm của nấm
men cố đònh trong gel alginate và nấm men tự do [74].....................27
Bảng 2.7: Các hợp chất hương chính của rượu vang tạo bởi nấm men cố
đònh và nấm men tự do trong khoảng nhiệt độ 15 – 20oC [113]........30
Bảng 2.8: Thành phần của rượu vang trắng lên men bằng 4 loại nấm
men cố đònh trong gel alginate và nấm men tự do [208]....................31
Bảng 2.9: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến động học quá
trình lên men trong quá trình lên men tónh rượu vang ở 30oC bởi tế bào
cố đònh sấy thăng hoa (freeze-dried gluten supported biocatalyst – FGB),
tế bào tự do sấy thăng hoa (freef reeze-dried cells – ffdc) và tế bào cố
đònh chưa qua sấy (wet gluten supported biocatalyst – WGB) [93].......35
Bảng 2.10: Các nguyên nhân cơ bản gây ra hiện tượng kéo dài thời gian
lên men hoặc quá trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn
rất cao [85, 170, 26, 163]..........................................................45
Bảng 2.11: Năng suất sinh cồn trong quá trình lên men dòch nho bởi
nấm men cố đònh trên kissiris, γ-alumina và alginate tại 7, 13 và 27oC
[14] 48
Bảng 2.12: Các hợp chất dễ bay hơi tạo thành trong suốt quá trình lên
men liên tục rượu vang sử dụng nấm men cố đònh trên miếng táo và quá
trình lên men tónh sử dụng nấm men tự do. Quá trình lên men được thực
hiện ở 30oC [112].....................................................................49
Bảng 3.13: Thành phần của dòch nho sau khi ép.............................53
Bảng 3.14: Các chất bổ sung vào dòch nho khi khảo sát ảnh hưởng của
hàm lượng đường ban đầu đến quá trình lên men............................57
Bảng 3.15: Các chất bổ sung vào dòch nho khi khảo sát ảnh hưởng của
hàm lượng tannin ban đầu đến quá trình lên men............................57
xx

tổng hợp cồn trung bình của nấm men trong quá trình lên men rượu
vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate...85
Bảng 4.27: nh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hiệu suất sinh
tổng hợp cồn trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do
và nấm men cố đònh trong gel alginate...........................................87
xxi
Luận văn tốt nghiệp
Bảng 4.28: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh
trưởng riêng cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm
men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate............................94
Bảng 4.29: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến hàm lượng
đường sót trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và
nấm men cố đònh trong gel alginate...............................................96
Bảng 4.30: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử
dụng đường cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm
men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate............................97
Bảng 4.31: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử
dụng đường riêng cực đại (chỉ xét cho giá trò cực đại đầu tiên) trong quá
trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh
trong gel alginate.......................................................................98
Bảng 4.32: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến thời gian lên
men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố đònh trong gel
alginate. 99
Bảng 4.33: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử
dụng đường trung bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm
men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate..........................100
Bảng 4.34: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh
tổng hợp cồn cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm
men tự do và nấm men cố đònh trong gel alginate..........................104
Bảng 4.35: nh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh

Hình 2.11: Tốc độ sử dụng glucose cực đại (dS/st) ( ) và tốc độ tạo
thành ethanol cực đại (dP/dt) (ο) khi hàm lượng đường thay đổi [12]. .32
Hình 2.12: Sự thay đổi hàm lượng đường theo thời gian. Hàm lượng
đường ban đầu (g/L): .................................................................33
Hình 2.13: Sự sử dụng glucose trong suốt quá trình lên men. -ο ο- nấm
men tự do; -•-•- nấm men cố đònh trong gel agar [91]......................33
Hình 2.14: Khả năng tạo cồn của nấm men trong suốt quá trình lên
men. -ο ο- nấm men tự do; -•-•- nấm men cố đònh trong gel agar [91]34
Hình 2.15: nh hưởng của pH đến tốc độ lên men của nấm men cố
đònh () và nấm men tự do (o). Tốc độ lên men tương đối được tính
bằng phần trăm so với tốc độ lên men cực đại [98].........................36
Hình 2.16: nh hưởng của pH đến khả năng sống sót của nấm men cố
đònh () 36
Hình 2.17: nh hưởng của pH đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt
quá trình lên men: , pH 2,80;  pH 3,0;  pH 3,25;  pH
xxiii
Luận văn tốt nghiệp
3,50;  pH 3,70. Các ký hiệu rỗng và đặc lần lượt ứng với nấm men
cố đònh và nấm men tự do [208]..................................................37
Hình 2.18: nh hưởng của hàm lượng SO2 đến quá trình lên men rượu
vang trắng (được đặc trưng bởi độ lên men, tính theo % so với hàm
lượng chất khô ban đầu) [69]......................................................38
Hình 2.19: nh hưởng của SO2 đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt
quá trình lên men: , không bổ sung;  64mg/L;  101mg/L;
 192mg/L;  325mg/L. Các ký hiệu rỗng và đặc lần lượt ứng với
nấm men cố đònh và nấm men tự do [208].....................................39
Hình 2.20: nh hưởng của tannin đến hàm lượng cồn tạo thành trong
suốt quá trình lên men:  477mg GAE/L;  667 mg GAE/L; 
920 mg GAE/L;  1246 mg GAE/L;  2178 mg GAE/L. Các ký
hiệu rỗng và đặc lần lượt ứng với nấm men cố đònh và nấm men tự do