BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ðỖ VĂN TUÂN
PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG
MỘT SỐ VI KHUẨN VÀ NẤM BỆNH CỦA VI TẢO
SCENEDESMUS QUADRICAUDA

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN ðỨC BÁCH
HÀ NỘI - 2014
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp i

LỜI CAM ðOAN

- Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung
thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
- Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã
được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn
gốc.
Hà Nội, ngày 01 tháng 5 năm 2014
TÁC GIẢ LUẬN VĂN
iii

MỤC LỤC Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt và kí hiệu v
Danh mục các bảng vi
Danh mục hình vii
PHẦN I MỞ ðẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích và yêu cầu 2
1.2.1 Mục đích 2
1.2.2 Yêu cầu 2
PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu chung về vi tảo 3
2.1.1 Hình thái cơ thể, cấu trúc và sinh sản 3
2.1.2 Vai trò của vi tảo 4
2.2 Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo 7
2.2.1 Khả năng kháng vi khuẩn của vi tảo 7
2.2.2 Khả năng kháng vi nấm của vi tảo 10
2.3 Tổng quan về vi tảo Scenedesmus quadricauda 12
2.3.1 Vị trí phân loại 12
2.3.2 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và sinh sản của vi tảo Scenedesmus
quadricauda 12
2.3.3 Sự phân bố của vi tảo Scenedesmus quadricauda 13


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

S. quadricauda Scenedesmus quadricauda
X. oryzae pv oryzae Xanthomonas oryzae pv oryzae
R. solanacearum Ralstonia solanacearum
H. maydis Helminthosporium maydis
S. aureus Staphylococcus aureus
S. epidermidis Staphylococcus epidermidis
E. coli Escherichia coli
S. platensis Spirulina platensis
C. vulgaris Chlorella vulgaris
E. viridis Euglena viridis
C. reinhardtii Chlamydomonas reinhardtii
O. sancta Oscillatoria sancta
S. grantiana Spirogyra grantiana
D. olivaceous Desmococcus olivaceous
C. humicola Chlorococcum humicola
T. erythraeum Trichodesmium erythraeum
C. disperses Chroococcus disperses
C. ellipsoidea Chlorella ellipsoidea
C. grovesii Chara grovesii
C. callicoma Cladophora callicoma
H. reticulatum Hydrodictyon reticulatum
S. leibleinii Schizomeris leibleinii

3.2 Cấu tạo của máy chiết Soxhlet 22
3.3 Chiết rút phân đoạn bằng n- hexan và ethyl ether 23
4.1 Phân lập tảo Scenedesmus 28
4.2 Hình thái của chủng tảo Scenedesmus sp. 29
4.3 Đồ thị sinh trưởng của tảo Scenedesmus sp. 30
4.4 Kết quả nhân đoạn ITS1 của tảo Scenedesmus sp. 30
4.5 Kết quả đọc trình tự vùng ITS1 32
4.6 Kết quả BLAST đoạn ITS1 tảo Scenedesmus sp. với cơ sở dữ liệu
NCBI 33
4.7 Thành phần các nhóm chất trong dịch chiết 34
4.8 Biểu đồ khả năng kháng vi khuẩn R. solanacearum của dịch chiết tảo
S. quadricauda trong các dung môi 35
4.9 Khả năng kháng vi khuẩn R. solanacearum của dịch chiết tảo S.
quadricauda 35
4.10 Biểu đồ khả năng kháng vi khuẩn X. oryzae pv oryzae của dịch chiết
tảo S. quadricauda 36
4.11 Khả năng kháng vi khuẩn X. oryzae pv oryzae của dịch chiết tảo S.
quadricauda 36
4.12 Biểu đồ khả năng kháng nấm H. maydis của dịch chiết tảo S. quadricauda 37
4.13 Khả năng kháng nấm H. maydis của dịch chiết tảo S. quadricauda 37
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 1

PHẦN I
MỞ ðẦU

2

nay đã gây ra hiện tượng kháng thuốc, ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức
khỏe con người.
Với sự đa dạng lớn về các loài vi tảo nước ngọt, việc nghiên cứu khả năng
kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất tự nhiên tách chiết từ các loài vi tảo sẽ góp
phần phát triển các chế phẩm ứng dụng trong bảo vệ thực vật. Trong số các loài tảo
nước ngọt, tảo S. quadricauda phân bố ở hầu hết các thủy vực nước ngọt và nước
lợ, có tốc độ sinh trưởng nhanh dễ thích nghi với các điều kiện môi trường tự nhiên
[Đặng Thị Thanh Hòa et al., 2007; Dương Đức Tiến, Võ Hành, 1997]. Ngoài ra tảo
S. quadricauda có khả năng sinh trưởng trong môi trường dinh dưỡng đơn giản, kể
cả trong các thủy vực ô nhiễm và dễ dàng nuôi trồng ở quy mô lớn. Xuất phát từ
thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập và khảo sát khả năng kháng một
số vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo Scenedesmus quadricauda”.
1.2. Mục ñích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Nghiên cứu này nhằm phân lập và khảo sát khả năng kháng vi khuẩn X.
oryzae pv oryzae, R. solanacearum và nấm H. maydis của các loại dịch chiết vi tảo
S. quadricauda.
1.2.2. Yêu cầu
- Phân lập và định danh được vi tảo S. quadricauda
- Đánh giá được khả năng kháng vi khuẩn X. oryzae pv oryzae, R.
solanacearum, và nấm H. maydis của các loại dịch chiết vi tảo S. quadricauda.
- Phân tách được nhóm chất kháng khuẩn có trong dịch chiết bằng sắc ký
lớp mỏng.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 3
4

- Kiểu Tập đoàn: Các tế bào sống thành tập đoàn và giữa các tế bào có liên
hệ với nhau nhờ tiếp xúc trực tiếp hay thông qua các sợi sinh chất.
- Kiểu Sợi: Cấu tạo thành tản (thallus) đa bào do tế bào chỉ phân đôi theo
cùng một mặt phẳng ngang, sợi có phân nhánh hoặc không.
- Kiểu Bản: Tản đa bào hình lá do tế bào sinh trưởng ở đỉnh hay ở gốc phân
đôi theo các mặtphẳng cả ngang lẫn dọc. Bản cấu tạo bởi một hay nhiều lớp tế bào.
Vi tảo bao gồm hai nhóm: nhóm có cấu tạo tế bào Prokaryote hay còn gọi là
vi khuẩn lam (Cyanobacteria) và nhóm có cấu tạo tế bào Eukaryote, sống chủ yếu
bằng hình thức quang tự dưỡng, một số dị dưỡng. Tế bào tảo chứa sắc lạp
(chromoplast) có cấu tạo như ở thực vật, bên trong là các túi thylakoid chứa sắc tố
và các enzyme để thực hiện quang hợp. Sắc tố quang hợp của vi tảo là diệp lục
chlorophyll và carotene, tuy nhiên nhiều loài vi tảo còn có xanthophyll và
phycobillin.
Hình thức sinh sản của vi tảo chủ yếu là vô tính bằng cách phân đôi, sinh
dưỡng hoặc bào tử. Ngoài sinh sản vô tính thì nhiều loài vi tảo còn có khăng sinh
sản hữu tính bằng cách tiếp hợp.
2.1.2. Vai trò của vi tảo
Tảo nói chung và vi tảo nói riêng có vai trò rất quan trọng trong tự nhiên và
trong đời sống nhân loại. Hàng năm tảo có thể tổng hợp ra trong đại dương 70-280
tỷ tấn chất hữu cơ, trong các thủy vực nước ngọt tảo cung cấp ôxy và hầu hết thức
ăn cho cá và các động vật thủy sinh khác. Tảo góp phần bảo vệ môi trường nuôi
thủy sản bằng cách tiêu thụ bớt lượng muối khoáng dư thừa. Đối với đời sống con
người tảo có rất nhiều vai trò đang được khai thác ứng dụng cũng như những tiềm
năng đang được nghiên cứu.
a, Nguồn dinh dưỡng từ vi tảo
Có rất nhiều loài vi tảo đang được khai thác làm nguồn thực phẩm cho con

cộng, carbohydrat, và protein không được thể hiện rõ [Webb and Chu, 1981;
Brown, 2002], ví dụ 2 loài tảo Phaeodactylum tricornutum và Nannochloris atomus
giàu hàm lượng protein và carbohydrate nhưng các thành phần vitamin, lipid,
khoáng chất của chúng lại thấp.
Đến nay, tất cả các nghiên cứu đều xác định rằng mỗi loài tảo khác nhau thì
chúng có giá trị dinh dưỡng khác nhau. Một loài tảo có hàm lượng nhiều loại chất
dinh dưỡng cao nhưng có thể thiếu ít nhất là một thành phần dinh dưỡng cần thiết,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 6

nên việc khai thác dinh dưỡng từ vi tảo đang có sự tập trung khai thác vào đối tượng
cụ thể với các thành phần dinh dưỡng nổi trội của chúng như: protein (Spirulina),
lipid (Scenedesmus)…
b, Nhiên liệu sinh học từ vi tảo
Trong bối cảnh sự cạn kiệt dần của năng lượng hóa thạch, nhiều giải pháp đã
được đưa ra đó là sản xuất nhiên liệu từ ngũ cốc: ngô, sắn, khoai, đậu nành… tuy
nhiên gây ảnh tăng giá lương thực và làm ảnh hưởng đến an ninh lương thực.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh lipid có trong tảo có thể sử dụng làm nhiên liệu
sinh học, tuy nhiên việc chiết xuất lipid ra khỏi tế bào vi tảo gặp nhiều khó khăn.
Một số nước đã ứng dụng thành công sản xuất dầu sinh học từ vi tảo đó là Nhật Bản
và Mỹ.
Dầu sinh học sản xuất từ vi tảo có nhiều ý nghĩa to lớn và có tính phát triển
bền vững cao, một mặt sản xuất nhiên liệu làm năng lượng, một mặt tiêu hao lượng
khí thải CO
2
trong quá trình nuôi trồng. Một số chủng tảo có khả năng tổng hợp và
tích lũy lipid cao như C. vulgaris (40% trọng lượng khô), Scenedesmus (40 – 55% ),
Dunaliella salina (10 -20%) [Yusuf, 2007]. Ở một số điều kiện nuôi cấy, thành

bệnh. Tuy nhiên những năm gần đây, những chất kháng sinh cổ điển không còn hữu
dụng bởi sự gia tăng khả năng kháng lại kháng sinh của tác nhân gây bệnh. Phương
hướng giải quyết đó chính là tìm ra các loại kháng sinh mới, từ những nguồn cung
cấp mới thay vì sử dụng các nguồn cũ, và vi tảo là đối tượng đang được nhiều nhà
nghiên cứu quan tâm và ứng dụng trong việc sản xuất các chất kháng sinh mới.
2.2.1. Khả năng kháng vi khuẩn của vi tảo
Phát hiện về khả năng kháng vi khuẩn của vi tảo được Pratt công bố đầu tiên
vào năm 1944 khi ông nghiên cứu về tảo Chlorella. Pratt đã tiến hành sử dụng các
thành phần dịch chiết của tảo Chlorella và xử lý một số chủng vi khuẩn, kết quả cho
thấy một hỗn hợp các acid béo có trong tảo có khả năng đối kháng cả vi khuẩn
Gram – và Gram + [Pratt et al., 1944].
Đến năm 1994 đã phát hiện trên loài tảo Chlorococcum hs-101 chứa một
loại acid béo là linolenic có khả năng kháng lại vi khuẩn S. aureus. S. aureus là
loại vi khuẩn gây nhiễm trùng có khả năng kháng lại một số kháng sinh thông
thường [Ohta et al., 1994]. Cũng với nghiên cứu trên vi khuẩn S. aureus, một công
bố khác đã phát hiện thêm các acid béo có trong tảo Phaeodactylum tricornutum có
khả năng kháng với loài vi khuẩn này ở nồng độ rất nhỏ. Các acid béo đó là
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 8

palmitoleic, hexadecatrienoic và eicosapentaenoic [Desbois et al., 2008; Desbois et
al., 2009]. Dịch chiết bằng dung môi methanol từ Haematococcus pluvialis trong
giai đoạn đỏ (giai đoạn kích thích sinh tổng hợp astaxanthin) có hoạt tính chống lại
vi khuẩn E. coli và vi khuẩn S. aureus, điều này lại một lần nữa chứng minh có sự
hiện diện của acid béo chuỗi ngắn, cụ thể butanolic và methyllactic acid trong khả
năng kháng lại vi khuẩn [Santoyo et al., 2009].
Tuy nhiên không chỉ các acid béo có trong tảo mới có hoạt tính kháng khuẩn,
Rodríguez Meizoso đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng các hợp chất terpene

S. aureus, S.
epidermidis, Bacillus
subtilis, E. coli,
Salmonella typhi
[Ghasemi et al.¸2007] S. platensis

Methanol
S.aureus, E. coli,
Salmonella typhi,
Pseudomonas
aeruginosa
[Kaushik and
Chauhan, 2008]
Methanol
S. aureus, Proteus
vulgaris, Pseudomonas
mirabilis
Ethanol S.aureus
O. sancta
Hexane S.aureus
S. grantiana Ethanol
E. coli, Proteus
vulgaris, Pseudomonas
mirabilis
[Justella et al., 2011]
Scenedesmus sp.
Nước, ethanol,

S. aureus, S.
epidermidis, Bacillus
subtilis
[Ghasemi et al., 2007]
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 10

Ngoài việc thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết vi tảo, một số tác giả
còn so sánh với tác dụng của kháng sinh. Younes Ghasemi đã thử nghiệm và so
sánh khả năng kháng khuẩn của dịch chiết loài vi tảo Chroococcus disperses với hai
loại kháng sinh ampicillin và Gentamicin. Kết quả cho thấy dịch chiết methanol và
hexane của tảo có khả năng kháng mạnh hơn hai loại kháng sinh trên khi xử lý với
các chủng vi khuẩn S.aureus, S. epidermidis, Bacillus subtilis, E. coli, Samonella
staphy [Ghasemi et al., 2007].
2.2.2. Khả năng kháng vi nấm của vi tảo
Việc nghiên cứu về khả năng kháng nấm không có nhiều bước tiến so với
nghiên cứu về khả năng kháng vi khuẩn, nguyên nhân có thể là do những năm trước
đây các tác nhân gây bệnh bắt nguồn từ vi nấm không được công nhận là quan
trọng. Tuy nhiên càng về sau tác hại của nấm càng thể hiện rõ ràng trên người cũng
như cây trồng và vật nuôi, đặc biệt là sau khi con người sử dụng tràn lan các kháng
sinh phổ rộng và sự suy giảm miễn dịch do nhiễm virus HIV. Sự gia tăng các bệnh
liên quan đến vi nấm ngày một nhiều và khó điều trị hơn, đòi hỏi một nỗ lực tìm
kiếm những chất có khả năng ức chế nấm bệnh an toàn và hiệu quả hơn.
Khả năng đối kháng vi nấm của vi tảo mới được nghiên cứu rộng rãi trong
những năm gần đây, một số kết quả đáng chú ý được trình ở bảng 2.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Aspergillus niger,
Aspergillus flavus,
Penicillium herquei,
Fusarium moniliforme,
Helminthosporium sp.,
Alternaria brassicae,
Saccharomyces
cerevisiae, Cadida
albicans
(Abedin et al., 2008)
H. pluvialis
Acid butanoic và
methyl lactate
Cadida albicans [Santoyo et al., 2009]
C. grovesii, C.
callicoma, H.
reticulatum, S.
leibleinii, P.
corium
Dịch chiết bằng
nước
Altermaria altermate,
Aspergillus flavus,
Curvularia lunata,
Fussarium roseum,
Trichodema
harzianum
[Kamble et al., 2012]

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

thuộc bộ tảo lục Chlorococcales, bao gồm 3 phần chính: Thành tế bào, tế bào chất
và nhân tế bào. Thành tế bào tảo S. quadricauda được cấu tạo từ cellulose và không
phân lớp rõ ràng. Tế bào chất là nơi thực hiện các trao đổi chất giữa các phần sống
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 13

của tế bào, chứa hơn 50% là nước, hợp chất hữu cơ chính là protein, ngoài ra còn
chứa lipid, carbonhydrate, vitamin và một số chất vô cơ. Cũng giống như cấu tạo tế
bào nhân thực khác, tế bào chất tảo S. quadricauda chứa các bào quan: khung tế
bào, ty thể, thể golgi, lạp thể, ribosome, mạng lưới nội chất. Lục lạp là bào quan
thực hiện chức năng quang hợp của tảo, bên trong lạp lục chứa diệp lục Chlorophyl
a,b,c,d và e giống như ở thực vật bậc cao, chỉ khác về hình dạng bào quan và sự sắp
xếp của các lớp màng thylakoid trong lục lạp [Dương Đức Tiến, Võ Hành, 1997].
Tảo S. quadricauda sinh sản chủ yếu theo hình thức sinh sản vô tính bằng
các tự bào tử (autospore). Các tự bào tử ở trong tế bào mẹ tập hợp thành một
coenobium hoặc rời rạc thành các tế bào đơn. Sau khi màng tế bào mẹ vỡ ra toàn bộ
các tự bào tử chui ra ngoài thành các cơ thể mới giống tế bào mẹ. Các gai cũng
được hình thành ngay trong cơ thể mẹ trước khi các tự bào tử được giải phóng.
Hình thức sinh sản hữu tính rất hiếm khi xuất hiện [Francis, 1996].
2.3.3. Sự phân bố của vi tảo Scenedesmus quadricauda
Vi tảo S. quadricauda phân bố dưới dạng trôi nổi và đáy của các thủy vực
nước ngọt và nước lợ khắp nơi trên thế giới. Những nghiên cứu về sự phân bố của
tảo thuộc chi Scenedesmus nói chung và loài S. quadricauda nói riêng được thực
hiện từ những năm 80 của thế kỷ XX. . Ở Tây Ban Nha có nhiều nghiên cứu đã
công bố sự có mặt của loài tảo này trên các thủy vực nước ngọt [Aboal et al., 1984;
Aboal Sanjurjo et al., 1988]. Một số các nước khu vực Bắc Mỹ và Nam Mỹ có
thành phần vi tảo thuộc chi Scenedesmus phong phú, trong đó có sự có mặt của vi
tảo S. quadricauda [Smith et al., 2010; Helbling et al., 2001]. Nhiều vùng ở khu

coli and Candida albicans
Methyl este
[Ali et al.,
2012]
Scenedesmus sp.
Shigella sp., Pseudomonas
sp., Xanthomonas oryzae
Dịch chiết acetone,
methanol, ethanol,
diethyl ether,
dichloro methane,
hexane, nước nóng
và nước lạnh.
[Beena et al.,
2011]
S. obliquus 019
Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Salmonella
typhi, Candida kefyr,
Aspergillus fumigatus,
Aspergillus niger.
Dịch chiết
methanol
[Ghasemi et al.,
2007]
Scenedesmus sp.
S25;
Scenedesmus sp.
S39;
Scenedesmus sp.

neoformans với vòng kháng khuẩn là 33mm [Hussain, 2011]. Dịch chiết của chủng
tảo S. quadricauda phân lập tại sông Pennsilvania, Hoa Kỳ cũng được nghiên cứu
hoạt kháng in vitro vi khuẩn Bacillus thuringiensis [Stephens et al., 2004].
Nhiều báo cáo cho thấy khả năng kháng khuẩn của Scenedesmus có được là
do các acid béo, tuy nhiên bằng việc sử dụng các dung môi khác nhau để thu dịch
chiết nội và ngoại bào của tảo này thì vẫn cho kết quả kháng khuẩn. Như vậy ngoài
các hoạt chất kháng khuẩn là acid béo, tảo Scenedesmus còn chứa nhiều loại hoạt
chất khác có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn và nấm khác nhau.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 16

PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1. Vật liệu, thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Vi tảo S. quadricauda được phân lập ở xã Cổ Bi, huyện Gia Lâm, thành phố
Hà Nội.
Một số chủng vi khuẩn, nấm bệnh:
- Vi khuẩn X. oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá ở lúa và Nấm H. maydis gây
bệnh đốm lá ở ngô.
- Vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh ở cà chua được cung cấp
bởi Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học,
Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
Các vật liệu tác dòng bao gồm chủng vi khuẩn E. coli DH5α, vector tách
dòng pJET2.1.
3.1.2. ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu