BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH
PHẠM DUY
NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG
TINOPAL CBS-X TRONG THỰC PHẨM NỀN TINH BỘT
BẰNG THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Nghệ An, năm 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH
các phòng ban chức năng của trƣờng Đại học Vinh. Tôi xin bày tỏ sự chân
thành và lòng cảm ơn về sự giúp đỡ đó.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hoa Du, thầy
giáo trực tiếp hƣớng dẫn và chỉ bảo cho tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp của tôi đang công tác
tại Phòng Phân tích thử nghiệm thuộc Trung tâm Kỹ thuật Thí nghiệm và Ứng
dụng Khoa học Công nghệ Đồng Tháp và gia đình đã động viên, khích lệ, tạo
điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện hoàn thành luận văn
này.
Nghệ An, ngày tháng năm 2014
Ngƣời thực hiện
Phạm Duy
MỤC LỤC
Trang bìa phụ
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng, các hình vẽ và đồ thị
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 4
1.1. Sơ lƣợc về tinh bột gạo 4
1.2. Các sản phẩm làm từ tinh bột gạo 5
1.3. Chất làm trắng quang học hay chất làm trắng huỳnh quang 6
1.3.1. Giới thiệu 6
1.3.2. Đặc điểm chung và phân loại các chất làm trắng quang học 6
2.2.3. Phƣơng pháp làm sạch 33
2.2.4. Pha loãng mẫu 33
2.3. Kỹ thuật phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao – đầu
dò huỳnh quang (HPLC-RF). 33
2.3.1. Chọn điều kiện sắc ký. 33
2.3.2. Trình tự bơm mẫu, tính toán kết quả. 35
2.4. Lấy mẫu và xử lý sơ bộ mẫu phân tích 36
2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu 36
2.4.2. Xử lý sơ bộ mẫu phân tích 37
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 38
3.1. Tối ƣu hóa điều kiện tách và xác định tinopal CBS-X. 38
3.1.1. Chọn hệ dung môi pha động 38
3.1.2. Khảo sát chƣơng trình gradient. 39
3.1.3. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ pha động 40
3.2. Khảo sát qui trình chiết tối ƣu của tinopal CBS-X 41
3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích 44
3.3.1. Khoảng tuyến tính 44
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) 47
3.3.3. Độ chính xác của phƣơng pháp 48
3.4. Xác định tinopal CBS-X trong các mẫu thực 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
- HPLC (High Performance Liquid Chromatography): Sắc ký lỏng
hiệu năng cao.
- HPLC UV-VIS: Sắc ký lỏng hiệu năng cao - đầu dò tử ngoại – khả
Bảng 3.5: Độ lặp lại tại nồng độ 20 ug/L, 50 ug/L chất chuẩn tinopal
CBS-X trên sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dó huỳnh quang.
Bảng 3.6: Giới hạn phát hiện của chất chuẩn tinopal CBS-X trên sắc ký
lỏng hiệu năng cao đầu dó huỳnh quang.
Bảng 3.7: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền
mẫu bột gạo tại nồng độ 70 µg/kg.
Bảng 3.8: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền
mẫu bột gạo tại nồng độ 250 µg/kg.
Bảng 3.9: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền
mẫu bột gạo tại nồng độ 400 µg/kg.
Bảng 3.10: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền
mẫu bún tại nồng độ 70 µg/kg.
Bảng 3.11: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền
mẫu hủ tiếu tại nồng độ 70 µg/kg.
Bảng 3.12: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của tinopal CBS-X trên nền
mẫu bánh phở tại nồng độ 70 µg/kg.
Bảng 3.13: Tóm tắt đánh giá phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tinopal
CBS-X trên nền tinh bột gạo, bún, hủ tiếu, bánh phở,
Bảng 3.14: Thống kê số lƣợng mẫu và hàm lƣợng tinopal CBS-X trong
sản phẩm từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2013
Bảng 3.15: So sánh kết quả phân tích tinopal CBS-X giữa hai phòng thí
nghiệm.
Bảng 3.16: Thống kê số lƣợng mẫu và hàm lƣợng tinopal CBS-X trong
sản phẩm từ tháng 4 đến tháng 8 năm 2014
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Disodium
4,4'-bis[(4- anilino-6-
morpholino-1,3,5-triazin-2- yl)amino]stilbene-2,2'-disulphonate.
Hình 1.2: Công thức cấu tạo của 2,2’-([1,1’-biphenyl]-4,4’-diyldi-
2,1-
), (b) acetonitril có mặt axit
photphoric (H
3
PO
4
).
Hình 3.7: Đồ thị khoảng tuyến tính của chuẩn tinopal CBS-X.
Hình 3.8: Sắc ký đồ khoảng tuyến tính của tinopal CBS-X.
Hình 3.9: Đồ thị của đƣờng chuẩn tinopal CBS-X.
Hình 3.10: Sắc ký đồ các mẫu chuẩn tinopal CBS-X. 1
MỞ ĐẦU
Chất làm sáng quang học hoặc chất làm trắng huỳnh quang đƣợc sử
dụng nhiều trong ngành công nghiệp hóa chất và trong ngành công nghiệp
chất tẩy rửa, sản xuất giấy, bao bì để làm tăng độ trắng sáng cho sản phẩm.
Chất làm trắng huỳnh quang là những hợp chất có thể hấp thụ ở bƣớc sóng
350 - 365 nm của ánh sáng UV và sau đó phát ra ánh sáng màu xanh trắng ở
bƣớc sóng 400 - 440 nm
[16], [27]
. Chất làm sáng huỳnh quang đƣợc phát hiện
nhiều trong chất tẩy rửa gia dụng, nƣớc rửa chén, vải sợi, giấy vệ sinh,…
Tinopal CBS-X là một chất làm trắng quang học có tên khoa học là 4,4-
bis(2-sulfostyryl)biphenyl, công thức phân tử C
28
H
20
Na
Hiện nay, đã có nhiều phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng tinopal CBS-
X trong các đối tƣợng phân tích với nhiều kỹ thuật khác nhau. Phƣơng pháp
kiểm tra sàng lọc tinopal CBS-X bằng cách soi dƣới ánh sáng đèn tử ngoại
UV 366 nm trong buồng tối
[1] ,[12]
. Với thiết bị phân tích tinopal CBS-X là sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lƣợng, tùy thuộc vào đầu dò của mỗi
thiết bị mà có độ nhạy và độ chọn lọc khác nhau nhƣng đầu dò huỳnh quang
đƣợc xem là có độ chọn lọc, độ nhạy cao song chi phí đầu tƣ ban đầu rất tốt
kém. Tuy nhiên, khi áp dụng qui trình kiểm tinopal CBS-X đối tƣợng các loại
thực phẩm đƣợc làm từ tinh bột gạo có rất ít công trình nghiên cứu một cách
tỉ mỉ và chi tiết, cần phải thực hiện xác nhận, đánh giá phƣơng pháp tại địa
phƣơng, xây dựng và kiểm định phƣơng pháp trên thiết bị cụ thể.
Với những lý do trên tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phương pháp xác
định hàm lượng tinopal CBS-X trong thực phẩm nền tinh bột bằng thiết bị
sắc ký lỏng hiệu năng cao” làm luận văn tốt nghiệp.
Để đóng góp thêm phƣơng pháp phân tích cho các đối tƣợng các loại
thực phẩm nền tinh bột chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện định
lƣợng Tinopal CBS-X (chất phát huỳnh quang) trong bột gạo, hủ tiếu, bún và
bánh phở ở huyện Cao Lãnh bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao –
đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF).
Trong luận văn này, chúng tôi có các nhiệm vụ:
+ Nghiên cứu phƣơng pháp xử lý mẫu để tách, chiết hàm lƣợng tinopal
CBS-X trong tinh bột gạo, hủ tiếu, bún và bánh phở.
+ Nghiên cứu điều kiện định lƣợng hàm lƣợng tinopal CBS-X bằng
phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – đầu dò huỳnh quang (HPLC-RF).
3
Xác định các điều kiện sắc ký, xây dựng đƣờng chuẩn, đánh giá phƣơng pháp
phân tích định lƣợng.
Nấu gạo có nhiệt độ hồ hóa cao sẽ kéo dài thời gian vài phút so với gạo
có nhiệt độ hồ hóa thấp. Gạo có nhiệt độ hồ hóa thấp khi nấu sẽ bắt đầu hút
nƣớc và trƣơng nở ở nhiệt độ thấp hơn so với gạo có nhiệt độ hồ hóa cao.
Nhiệt độ hồ hóa cũng có thể phản ánh độ rỗng tƣơng đối của nội nhũ.
Tỷ lệ amiloza: Amilopectin xác định các tính chất của cơm. Hàm lƣợng
amiloza càng cao, các hạt tinh bột hút nƣớc càng mạnh, thể tích các hạt tinh
bột tăng nhƣng cấu trúc không bị phá hủy nhờ khả năng của amiloza tạo thành
các liên kết nƣớc ở mức cao. Độ chắc của cơm và độ bóng bề mặt của nó
đƣợc quyết định bởi tỷ số amiloza : amilopecin trong tinh bột.
5
Cách tách tinh bột gạo: Hạt tinh bột gạo có kích thƣớc nhỏ (3 – 8 µm)
đƣợc bao bởi một lớp vỏ protein cứng, chặt và không hoà tan trong nƣớc, nên
để tách đƣợc tinh bột cần phải xử lý hoá học để tách protein ra khỏi tinh bột.
Có thể ngâm gạo xay trong dung dịch kiềm loãng (0,25% - 0,35%)
trong một thời gian dài để làm mềm hạt. Tách hết kiềm, rửa bằng nƣớc, sau
đó gạo đƣợc nghiền để phá vỡ tế bào và giải phóng các hạt tinh bột. Tiếp đó
khối nghiền đƣợc khuấy đều với một lƣợng dƣ dung dịch kiềm loãng. Phần
lớn protein sẽ bị hoà tan và chuyển vào lớp trên của dung dịch kiềm nên có
thể tách ra bằng cách gạn.
Khuếch tán khối tinh bột vào nƣớc để tạo ra dịch sữa tinh bột rồi cho
qua rây có kích thƣớc nhất định để loại bỏ các tạp chất. Tinh bột đƣợc rửa và
lắng gạn, lặp đi lặp lại nhiều lần sẽ thu đƣợc tinh bột tinh sạch.
Có thể ngâm gạo xay trong dung dịch SO
2
ở một nhiệt độ và thời gian
nhất định (50
o
C, 72
h
FWAs) đƣợc dùng trong ngành công nghiệp
chất tẩy rửa,
là những hợp chất có thể hấp thụ ở bƣớc sóng 350 - 365 nm của
ánh sáng UV và sau đó phát ra ánh sáng màu xanh trắng ở bƣớc sóng 400 -
440 nm
. Electron trong phân tử huỳnh quang đƣợc kích thích lên một trạng
thái năng lƣợng cao hơn bằng cách hấp thụ photon ánh sáng thích hợp sau đó
phân tử chuyển một lƣợng nhỏ năng lƣợng thành nhiệt huỳnh quang, phần
còn lại phát xạ thành photon của bức xạ huỳnh quang khi các electron quay
trở lại trạng thái cơ bản của nó. Nhiệt huỳnh quang đƣợc tạo ra từ trạng thái
kích thích thứ nhất có thể đƣợc đo đƣợc bằng thiết bị nhƣng rất phức tạp và
tốn kém. Bức xạ huỳnh quang trong trạng thái kích thích thứ hai đƣợc đo
bằng thiết bị gọi là fluorometers.
1.3.2. Đặc điểm chung và phân loại các chất làm trắng quang học
[6],
[7], [8], 26], [27]
.
Các chất làm trắng quang học có thể đƣợc phân loại dựa trên cấu trúc
và thuộc tính, vào khoảng 11 nhóm chất lớn, mỗi thành phần có chứa gốc
khác nhau, hàng trăm hợp chất, và hàng ngàn công thức khác nhau. Tất cả
OBs đa vòng hydrocarbon thơm, cấu trúc có chứa nhiều liên kết đôi có thể
đƣợc kích hoạt bằng ánh sáng tia cực tím. Hàng ngàn công thức OBs đã đƣợc
dùng nhiều trong các ngành công nghiệp chất tẩy rửa, nhƣng tƣơng đối ít đáp
ứng đƣợc yêu cầu của ngành công nghiệp, và chất tẩy rửa làm trắng huỳnh
7
quang (FWAs) đã đƣợc nghiên cứu sử dụng.
FWAs đƣợc sử dụng nhiều trong các chất tẩy rửa bao gồm các hợp chất
stilben nhƣ:
2, 1 - ethenediyl) bis, dạng muối đinatri
[8]
.8
1.3.3. Tinopal CBS-X.
1.3.3.1. Khái niệm
[8], 26], [27]
.
Tên thƣờng đƣợc gọi là DSBP (Distyrylbiphenylsulfonate).
Tên hóa học: 2,2’-([1,1’-biphenyl]-4,4’–diyldi-
2,1-ethenediyl)bis, dạng
muối đinatri.
Công thức phân tử:
C
28
H
20
Na
2
O
6
S
2
Công thức cấu tạo hóa học: xem hình 1.2.
1.3.3.2. Tính chất
[8], [26]
.
Categories”, (1997)
[8]
.
Theo [Ullann’s 1991] Enzyclopediaof Industrial Chemistry, sản xuất
Distyrylbiphenylsulfonate bắt đầu với biphenyl, đƣợc sản xuất cùng với các
hợp chất thơm khác trong tinh chế dầu thô. Nó phản ứng nhanh với hydrogen
chloride và formaldehyde và tạo thành 4, 4’–bis(chloromethyl)biphenyl, sau
9
đó phản ứng với trimethylphosphite cho ra 4,4’-bis(dimethoxyphosphono-
methyl)biphenyl. Biphenylphosphonate đối xứng này đƣợc phản ứng với hai
phân tử benzaldehyde-2-sulphonic axit, đƣợc sản xuất từ một hợp chất là 2-
chlorbenzaldehyde và natri sunfit. Thành phần sản phẩm hoạt chất sinh ra là
xấp xỉ 90 %, các tạp chất khác < 1,2 % bao gồm các sản phẩm và số dƣ là
natri clorua và nƣớc.
1.3.3.3. Phạm vi ứng dụng của các chất làm trắng quang học
[6],
[7], [8],
[16], [26], [27]
.
Chất làm trắng quang học và chất làm trắng huỳnh quang đƣợc sử dụng
trong dệt may, nhiều loại giấy, nhựa, và sợi tổng hợp, cộng với sử dụng rộng
rãi trong một số y tế, hóa chất, dầu khí. Các nhóm này bao gồm các công thức
hóa học OBs đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong ngành công nghiệp chất tẩy
rửa là carbocycles (chủ yếu là distyrylbiphenyls), và triazinylaminostilbenes.
FWA-1 đƣợc sử dụng trong các chất tẩy rửa nhà khoảng nồng độ từ
0,05% đến 0,15% và phân hủy > 50 % trong 12 tháng. FWA-5 đƣợc sử dụng
chất tẩy rửa gia dụng ở khoảng nồng độ 0,02% đến 0,10% và phân hủy > 70
% trong 28 ngày. OBs đƣợc dùng nhiều các ngành công nghiệp chất tẩy rửa,
phát huỳnh quang.
Đƣợc biết, tinopal CBS-X sẽ bị mất tính chất huỳnh quang theo các
điều kiện khác nhau khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời. Nghiên cứu tại Thụy
Sĩ trên hồ Greifensee và sông Glatt chứng minh quy mô và tốc độ quang phân
trong điều kiện một khu vực đông dân cƣ. DSBP có trong hồ Greifensee vào
mùa hè chứng tỏ phân hủy quang đáng kể và ở sông Glatt sự phân hủy quang
70% trong vòng 28 ngày xảy ra vào mùa đông. Vào mùa hè phân hủy quang
là 70% chỉ sau 1,5 ngày.
Sự cân bằng khối lƣợng chỉ ra rằng 80% bị chuyển hóa bởi quang phân.
Còn lại 20% DSBP đƣợc phân bố đồng đều hấp phụ vào trong đất đá, trầm
tích [Stoll, 1999]
[8]
.
Sự phân hủy quang học ban đầu mang lại một sản phẩm 1a chính (muối
axit benzaldehyde-2 - sulphonic) và 1b trung gian hình ảnh không ổn định đó,
với tốc độ chậm, phá vỡ để tạo thành một 1c sản phẩm thứ hai chính
(diphenyl - 4, 4' - dialdehyde). Cả hai sản phẩm phân hủy quang học đƣợc
11
chứng minh là có thể dễ dàng phân hủy sinh học trong thử nghiệm OECD
301F. diphenyl-4,4'-dialdehyde là không ổn định và bị ôxy hóa để diphenyl-
4,4'-dicarboxylic acid (1c, oxit.) trong vòng 24 giờ. [Theo Richner, 1999]
[8]
.
Hình 1.3: Sự phân hủy quang học của tinopal CBS-X
[8]
.
Một trong những tầm quan trọng nhất phát hiện chính xác và xác định
OBs (hoặc FWAs) trong các nguồn bị ô nhiễm nhƣ nguồn nƣớc và một số sản
13
Hình 1.5: Sơ đồ huỳnh quang kế, nguồn kích thích và nguồn phát xạ
[27]
.
(Courtesy of R. David Holbrook, National Institute of Standards and
Technology)
[27]
.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với các đầu dò UV, huỳnh quang,
khối phổ cho độ chính xác và độ nhạy cao thích hợp cho việc phát hiện chất
cần phân tích của bất kỳ mẫu thử nào, nhƣng tƣơng đối tốn thời gian.
Dƣới đây sẽ trình bày chi tiết về phƣơng pháp phân tích bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao.
1.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
1.4.1. Cơ sở phƣơng pháp và phạm vi ứng dụng
[3]
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - performance liquid chromatography)
hoặc sắc ký lỏng cao áp (High - pressure liquid chromatography) là một kỹ
thuật sắc ký đƣợc sử dụng ngày càng phổ biến để phân tách một hỗn hợp
trong lĩnh vực hóa phân tích (analytical chemistry ) và sinh hóa
(biochemistry ) với mục đích xác định, định lƣợng và tinh sạch từng thành
phân riêng lẻ của hợp chất. Sắc ký lỏng hiệu năng cao cũng đƣợc xem là một
14
kỹ thuật đo đạc trong hóa phân tích, thay vì kỹ thuật trọng lƣợng (gravimetric
technique).
Sắc ký lỏng hiệu năng cao dựa trên áp lực của bơm cơ học lên một
.
Tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, quá trình tách sắc ký lỏng hiệu năng
cao có thể tiến hành theo các cơ chế sau:
+ Pha tĩnh là chất lỏng: đƣợc phủ lên trên bề mặt chất mang trơ nhồi
trong cột tách tạo thành một lớp màng mỏng có độ dày từ 2 – 3 µm. Cơ chế
quá trình tách là phân bố (sắc ký phân bố) của chất tan giữa hai pha không
trộn lẫn, còn đƣợc gọi là sắc ký chiết.
+ Pha tĩnh là chất rắn: cơ chế của quá trình tách là hấp thụ (sắc ký hấp
thụ).
+ Pha tĩnh là chất rắn chứa các nhóm chức có khả năng trao đổi ion với
mẫu phân tích, cơ chế quá trình tách là trao đổi ion (sắc ký trao đổi ion).
+ Pha tĩnh là các loại hạt rắn có kích thƣớc lỗ xốp khác nhau, khi đó
các phân tử mẫu có kích thƣớc nhỏ sẽ chui sâu vào bên trong lỗ xốp nên đƣợc
pha động rửa giải ra sau. Các phân tử có kích thƣớc lớn nằm ở bên ngoài nên
đƣợc rửa giải ra trƣớc, cơ chế quá trình tách là rây phân tử (sắc ký gel).
+ Pha tĩnh là chất rắn bất đối có khả năng tách chọn lọc các dạng của
đồng phân quang học, cơ chế của quá trình tách xảy ra các tƣơng tác khác
nhau giữa pha tĩnh bất đối với các dạng đồng phân quang học nhƣ liên kết
hydro, tƣơng tác π – π, tƣơng tác lƣỡng cực, (sắc ký các đồng phân quang
học).
Phƣơng pháp sắc ký hấp phụ hiệu năng cao là chất tan bị giữ trên bề
mặt pha tĩnh tức là chất hấp phụ và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ).
+Pha tĩnh: Pha tĩnh là các hạt nhỏ hoặc màng mỏng lỏng bám đều lên
bề mặt của chất mang trơ, thƣờng là những bột mịn, silicagen và nhôm
oxit,…. Nếu là hạt thì phải có kích thƣớc đồng đều, có thể dƣới dạng hình
cầu hoặc mảnh. Phải đảm bảo độ xốp nhất định, trơ và bền vững với điều kiện
Copyright: Tài liệu đại học ©