BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN LÊ BÌNH MAI ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG TRÌNH TỰ
ADN RIBOSOM ITS
CỦA BA LOÀI DƯỢC LIỆU CHỨA
BERBERIN HỌ RUTACEAE Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC
60720408 Người hướng dẫn khoa học: TS. Phùng Thanh Hương HÀ NỘI 2014
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới cô giáo hướng dẫn
luận văn của tôi, Tiến sĩ Phùng Thanh Hương, đã tạo mọi điều kiện, động viên và
giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn “Đánh giá sự đa dạng trình tự ADN ribosom ITS
của ba loài dược liệu chứa berberin họ Rutaceae ở Việt Nam”. Tôi cũng xin chân
thành cảm ơn tới Thạc sĩ Hà Thu. Trong suốt quá trình nghiên cứu, chị đã kiên nhẫn
hướng dẫn, trợ giúp và động viên tôi rất nhiều. Sự hiểu biết sâu sắc về khoa học, cũng
như kinh nghiệm của hai người thầy chính là tiền đề giúp tôi đạt được những thành
tựu và kinh nghiệm quý báu.
Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự

11
1.4. Ba loài dược liệu là đối tượng nghiên cứu của đề tài
15
1.4.1. Dấu dầu xoan (Tetradium glabrifolium)
15
1.4.2. Xít xa (Toddalia asiatica)
17
1.4.3. Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae) 19
Chương II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
21
2.1. Đối tượng nghiên cứu
21
2.2. Hóa chất, sinh phẩm
22
2.3. Trang thiết bị
23
2.4. Phương pháp nghiên cứu
23
2.4.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
25
2.4.2. Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR
25
2.4.3. Phương pháp điện di ADN trên gel agarose
27
2.4.4. Phương pháp tách dòng
27
2.4.5. Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào khả biến E.coli chủng
TOP10F’
28


48
3.2.3. Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN của các mẫu Xít xa
49
3.2.4. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của các mẫu Xít xa 51
3.2.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của các mẫu Xít xa
52
3.2.6. Cây phân loại trình tự ITS-rADN của 3 mẫu Xít xa
55
3.3. Kết quả giải trình tự ITS-rADN loài Dấu dầu xoan
55
3.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của các mẫu Dấu dầu xoan
55
3.3.2. Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR của các mẫu Dấu dầu xoan
57
3.3.3. Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN của các mẫu Dấu dầu xoan
58
3.3.4. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của các mẫu Dấu dầu xoan
60
3.3.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của các mẫu Dấu
dầu xoan
63
3.3.6. Cây phân loại trình tự ITS-rADN của 5 mẫu Dấu dầu xoan
66
Chương IV. BÀN LUẬN
68 4.1. Về quy trình xác định trình tự ITS-rADN
68
4.2. Về sự đa dạng di truyền của loài Muồng truổng ở Việt Nam

MCL-1 Myeloid cell leukemia – 1
NTS Non-transcribed spacer
PCR Polymerase Chain Reaction
rADN ADN mã hóa cho ARN ribosom
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
ROS Reactive oxygen species
SSU Small subunit TAE Tris - Acetic acid – EDTA
Taq Thermus aquaticus
TRAIL Tumor necrosis factor related apoptosis including ligand
X-gal 5-bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactosid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Kích thước và phần trăm G+C của vùng ITS1 và ITS2 của một số
loài thực vật hạt kín 5
Bảng 1.2. Các loài chứa berberin ở Việt Nam 12
Bảng 1.3. Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Tetradium
glabrifolium 16
Bảng 1.4. Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Toddalia asiatica 18
Bảng 1.5. Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Zanthoxylum
avicennae 20
Bảng 2.1. Danh sách địa điểm thu hái mẫu 21
Bảng 2.2. Cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 22
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR 26
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 26
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng tạo vector tái tổ hợp 27


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cấu trúc của vùng rADN 3
Hình 1.2. Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS 4
Hình 1.3. Dấu dầu xoan (Tetradium glabrifolium) 15
Hình 1.4. Xít xa (Toddalia asiatica) 17
Hình 1.5. Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae) 19
Hình 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu 24
Hình 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của 10 mẫu Muồng truổng 33
Hình 3.2. Sản phẩm PCR của 10 mẫu Muồng truổng 35
Hình 3.3. Ảnh điện di plasmid tách từ các khuẩn lạc của 10 mẫu Muồng truổng 36
Hình 3.4. Sản phẩm cắt plasmid bằng enzym giới hạn EcoRI của 10
mẫu Muồng truổng 37
Hình 3.5. So sánh gióng hàng trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của 10
mẫu Muồng truổng 42
Hình 3.6. Cây phân loại 10 mẫu Muồng truổng dựa trên so sánh trình tự
ITS-rADN 46

Berberin được phát hiện trong 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau,
trong đó ở Việt Nam có: họ Mao lương (Ranunculaceae), họ Hoàng liên gai
(Berberidaceae), họ Tiết dê (Menispermaceae), họ Cam (Rutaceae), họ Anh túc
(Papaveraceae). Với các giá trị làm thuốc rất lớn và tính chất quý hiếm của các loài
trên, chúng đã và đang được khai thác triệt để để làm thuốc, chiết xuất và buôn bán
ở thị trường trong nước cũng như xuất khẩu qua Trung Quốc, dẫn đến cạn kiệt
nguồn tài nguyên các loài thực vật cho berberin ở Việt Nam. Mặc dù nhiều loài
trong số này đã được ghi trong “Sách đỏ Việt Nam” như: Berberis julianae
Schneid, Berberis wallichiana DC., Mahonia baelii (Forti) Carr, Thalictrum
foliolosum DC,… nhưng cho đến nay, ngoài một số nghiên cứu quy mô nhỏ về nhân
giống và bảo tồn, vẫn chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu đánh giá, tư
liệu hóa ở mức độ phân tử về đa dạng di truyền các loài cây này một cách sâu rộng
và có hệ thống. Để tiến tới quản lý, bảo vệ và khai thác hợp lý nguồn tài nguyên các
dược liệu chứa berberin nói trên, một dự án đánh giá tiềm năng di truyền các nguồn
gen dược liệu chứa berberin ở Việt Nam được triển khai từ tháng 6 năm 2011 với
các nội dung chính: thu thập và lưu trữ mẫu, phân tích đặc điểm hình thái, chỉ tiêu
nông học; phân tích hàm lượng berberin; phân tích đa dạng di truyền nguồn gen.
Trong phạm vi đề tài luận văn cao học, chúng tôi tiến hành một phần nhỏ
trong dự án, tập trung vào phân tích đa dạng di truyền các loài chứa berberin họ
Rutaceae ở Việt Nam. Hiện nay, trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, quan hệ
tiến hóa trên thế giới, nhiều chỉ thị phân tử đã và đang được áp dụng rộng rãi làm
tiêu chí đánh giá, trong đó, một trong những chỉ thị được dùng phổ biến nhất là
trình tự vùng phiên mã nội thuộc ADN ribosom nhân (ITS-rADN) do nhiều ưu
điểm về cả giá trị khoa học và khả năng áp dụng thực tế. Do đó, trong đề tài này,
2chúng tôi tiến hành nghiên cứu về trình tự ITS-rADN nhân của 3 loài dược liệu
chứa berberin họ Rutaceae ở Việt Nam với mục tiêu:
- Xác định được trình tự ITS-rADN nhân của các mẫu thu hái thuộc 3 loài

Hình 1.1. Cấu trúc của vùng rADN [45]
4 Mỗi đoạn gen lặp lại của rADN gồm các vùng IGS, 18S, ITS1, 5,8S, ITS2 và
26S. IGS là vùng kém bảo tồn nhất của ADNr. Ở đầu kết thúc 5’ của 18S và đầu kết
thúc 3’ của 26S có một vùng được biết đến là vùng phiên mã ngoại ETS (external
transcribed spacer). Các vùng rADN 5,8S, 18S, 26S phiên mã thành các đoạn tiền
rARN riêng rẽ, nằm xen kẽ với các vùng phiên mã nội (ITS) và các vùng phiên mã
ngoại (ETS). Vùng phiên mã 18S tạo thành tiểu đơn vị nhỏ (SSU), vùng 26S cộng
với 5,8S tạo thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosom.
Trong các vùng này, vùng 18S và vùng ITS được coi là những marker phân
tử hiện đang được dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền và quan hệ tiến hóa [15,
45, 43].
1.1.2. Cấu trúc của ITS-rADN nhân
Vùng phiên mã nội (ITS) của ADN ribosom thường được sử dụng cho
nghiên cứu phân loại thực vật. Vùng ITS có 3 phần: ITS1, ITS2 và vùng có tính bảo
tồn cao là 5,8S nằm giữa (hình 1.2.).

Vùng ITS
Hình 1.2. Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS [15]
Ở một số loài thực vật có hoa, kích thước của vùng ITS1 và ITS2 thường nhỏ
hơn 300 bp (ITS1: 187-298 bp; ITS2 : 187-252 bp). Vùng tiểu phân 5,8S có kích
thước không đổi là 163-164 bp. Ở thực vật, kích thước của vùng ITS xấp xỉ 650-750
bp ở thực vật hạt kín và khoảng xấp xỉ 1500-3700 bp ở thực vật hạt trần [15, 39].
Vùng ITS1 thường có kích thước lớn hơn vùng ITS2, ví dụ 1 số loài sau:
Adoxaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Canellaceae, Malvaceae, Onagraceae,
Polemoniaceae, Ranunculaceae, Salicaceae, Saxifragaceae, Styracaceae, và
Winteraceae. Ngược lại, ở một số loài vùng ITS2 có kích thước lớn hơn vùng ITS1
5

Fabaceae, Vicia, 1 loài 235 52 208 50
Fabaceae, Vigna, 1 loài 205 60 220 59
Onagraceae, Epilobium, 22 loài 240-244 53-62 211-216 54-60
Malvaceae, Gossypium, 1 loài 287 58 229 60
Malvaceae 277-298 49-53 240 57
Poaceae, Pooideae,10 loài 217-223 55-64 213-221 59-67
6
Loài
ITS1 ITS2
Kích thước
(bp)
% G+C Kích thước
(bp)
% G+C
Poaceae, Sorghum, 1 loài 207 56 217 67
Poaceae, Oryza, 1 loài 194 73 233 77
Polemoniace, 38 loài 242-262 42-65 187-195 48-62
Ranunculace, 27 loài 214-246 198-216
Rosaceae, Fragaria, 1 loài 249 68 207 65
Rosaceae, Maloideae, 20 loài 208-221 65-72 211-224 67-72
Rosaceae, Prunus, 1 loài 242 62 209 69
Rosaceae, Rosa, 1 loài 249 60 207 57
Rosaceae, Spiraea, 1 loài 251 65 230 70
Salicaceae, Populus, 1 loài 214 67 207 70
Saxifragace, 28 loài 256-267 224-238
Scrophulariaceae,Mimulus, 8
loài

được nghiên cứu và công bố trong ngân hàng gen thế giới rất phong phú, thuận lợi
cho phân tích và so sánh trình tự gen [45].
Trong nghiên cứu di truyền, vùng phiên mã nội của rADN có một số ứng
dụng quan trọng như: xác định các điểm đột biến trong quá trình hình thành loài,
đánh giá sự tương đồng trình tự ADN, dùng các phần mềm chuyên dụng tạo ra các
cây tiến hóa loài, đánh giá đa dạng di truyền trong phạm vi một bậc phân loại [12].
1.1.4. Ứng dụng của ITS-rADN trong nghiên cứu cây thuốc
Với những ưu điểm nổi trội trên, giá trị dữ liệu về trình tự vùng ITS được sử
dụng phổ biến trong các nghiên cứu phát sinh loài, đánh giá đa dạng di truyền hay
nhận diện dược liệu.
Chi Zanthoxylum có hơn 200 loài như Zanthoxylum piperitum, Zanthoxylum
schinifolium và Zanthoxylum bungeanum. Trong nền y học cổ truyền của Trung
8Quốc, quả của các loài trong chi này được dùng làm thuốc để điều trị đau thượng vị
và thuốc bổ máu. Zanthoxylum là một chi phức tạp có nhiều điểm khác biệt giữa
các loài, vì vậy phương pháp dựa vào các đặc tính hình thái bên ngoài và các đặc
tính sinh lí không thể phân biệt một cách chính xác quan hệ của các loài. Để giải
quyết khó khăn này, ngày nay các nhà nghiên cứu đã sử dụng trình tự gen để xác
định hệ thống phát sinh loài. Trong nghiên cứu của Sun Yan-Lin đã lựa chọn vùng
ITS để phân biệt các loài trong chi Zanthoxylum. Kết quả nghiên cứu không những
cung cấp trình tự ITS của loài Zanthoxylum piperitum mà còn giúp phân biệt được
Zanthoxylum piperitum với loài Zanthoxylum schinifolium, qua đó giải thích quan
hệ giữa các loài trong chi Zanthoxylum [62].
Một số nghiên cứu ở Việt Nam gần đây trong lĩnh vực cây thuốc bắt đầu
hướng vào phân tích tính đa dạng sinh học ở cấp độ phân tử, dựa trên chỉ thị RAPD
hoặc ADN ribosom ITS. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Nga cho thấy trình tự
ADN vùng gen ITS của 12 mẫu dược liệu thuộc chi Đẳng Sâm có chiều dài giữa
các loài dao động từ 638 đến 650 bp, tỷ lệ GC trong vùng này khoảng từ 60,3% đến

berberin đem tiêm truyền cho những con thỏ thì không gây nên những triệu chứng
thổ tả. Điều đó chứng tỏ độc tố của vi khuẩn tả đã bị trung hòa hoặc bị bất hoạt.
Trên những thỏ còn non cho uống trước berberin, sau đó 18 – 24 giờ bơm vào ruột
thỏ một liều độc tố tả gây chết thì phòng ngừa được hiện tượng tiêu chảy do độc tố
gây nên và kéo dài được thời gian sống của thỏ dùng thuốc [1].
Về cơ chế tác dụng kháng khuẩn của berberin, một số tác giả cho rằng có
liên quan đến tác dụng ức chế sinh tổng hợp ARN, ADN và protein của thuốc đối
với vi khuẩn. Nhóm ammonium bậc 4 rất cần thiết cho tác dụng kháng khuẩn,
những dẫn chất không có ammonium bậc 4 như tetrahydroberberin có tác dụng
kháng khuẩn rất yếu [1].
10Một số nghiên cứu đã được thực hiện cho thấy berberin có thể sử dụng để
chống lại nhiễm khuẩn MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus -
Staphylococcus aureus kháng Methicillin) [64].
b. Tác dụng kháng nấm: Berberin sulfat với nồng độ 10 – 25 mg/ml ức chế sự
sinh trưởng của các nấm Alternaria spp. Aspergillus flavus, A. fumigates, Candida
albicans, Curvularia spp., Drechslera spp., Fusarium spp., Rhizopus oryzae,
Scophulariopsis spp.,… [1].
c. Tác dụng kháng đơn bào: Berberin trên ống kính với nồng độ 1:5000 và trên
chuột nhắt trắng đã gây nhiễm amip với liều 50mg/kg bằng đường uống có tác dụng
ức chế sự sinh trưởng của amip.
Berberin còn có tác dụng diệt Typanosoma brucei rhodesiense với nồng độ
ức chế 50% - IC
50
là 0,4 mg/ml [1].
d. Tác dụng chống ung thư: Berberin được chú ý nhiều nhất tới tác dụng chống
ung thư [53]. Trên in vitro berberin có thể ức chế nhiều loại tế bào ung thư, bao
gồm ung thư vú [32], bệnh bạch cầu, u ác tính [50], ung thư da, ung thư gan, ung

Berberin hydroclorid ở nồng độ 150mg/kg theo đường uống, dùng hàng
ngày, mỗi ngày 1 lần trong 3 tuần trên chuột gây đái tháo đường bằng
streptozotocin có tác dụng giảm nồng độ glucose trong máu, cải thiện chức năng
gan, thận, điều hòa nồng độ lipid ở chuột gây đái tháo đường bằng streptozotocin
[41].
1.3. Các dược liệu chứa berberin ở Việt Nam và thế giới
Trên thế giới có khoảng 150 loài thực vật có berberin đã được phát hiện,
thuộc 23 chi (Berberis, Coptis, Corydalis, Dicranostigma, Euodia, Glaucium,
Hydratis, Macleaya, Mahonia, Nandina, Papaver (Papaveraceae), Phellodendron,
Sanguinaria, Sankezhen, Thalictrum, Chelidonium, Cissampelos, Coscinium,
Cyclea, Toddalia, Xanthorhiza, Xylopia, Zanthoxylum) và 7 họ, bao gồm:
Annonaceae, Berberidaceae, Fumariaceae, Menispermaceae, Papaveraceae,
Ranunculaceae, Rutaceae, trong đó các họ chủ yếu là Berberidaceae,
Menispermaceae, Papaveraceae, Ranunculaceae và Rutaceae [2].
Ở Việt Nam thống kê cho thấy berberin có ở 20 loài thực vật thuộc 5 họ khác
nhau là Berberidaceae, Menispermaceae, Ranunculaceae, Rutaceae, Papaveraceae
(Bảng 1.2).
12
Bảng 1.2. Các loài chứa berberin ở Việt Nam
TT

Tên
cây
Tên khoa
học
Họ
Bộ phận

2
Hoàng
liên
Kloss
Mahonia
klossi Bak. f.

Berberidaceae [5]
3
Hoàng
liên lá
rộng
Mahonia
baelii (Forti)
Carr.
Berberidaceae Thân, vỏ0,35 -
2,5
[1, 2,
5]
4
Hoàng
liên Ô
rô
Mahonia
nepalensis
DC.
Berberidaceae Thân, lá 0,3 – 2,5