BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ ĐÔNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE
HUYẾT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
CỦA PHÂN ĐOẠN CHIẾT CHLOROFORM
TỪ THÂN CÂY Ý DĨ
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2013

Người hướng dẫn khoa học: TS. Phùng Thanh Hương

HÀ NỘI 2013
Lời cảm ơn
Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận
được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị, các em và các
bạn.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn
chân thành tới Ts. Phùng Thanh Hương, người thày luôn sát cánh tận tình
hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ cũng như động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu trường Trường đại học Dược Hà
Nội, trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, đã tạo điều kiện cho tôi
được học tập và nghiên cứu
Tôi xin gửi lời cảm ơn Bộ môn Hóa sinh, Bộ môn Dược lý, Phòng sau đại
học trường Đại Học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa dược trường Cao đẳng Dược
Trung ương Hải Dương, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá
trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn các thày cô giáo, anh, chị, em kỹ thuật viên Bộ môn Hóa
sinh, Bộ môn Dược lý trường Đại Học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa dược trường

1.1.3.2. Các thuốc làm tăng cường lượng insulin 9
1.1.3.3. Các thuốc tăng cường tác dụng của insulin ở mô đích 11
1.1.3.3. Các thuốc làm ức chế tiêu hóa hấp thu glucid 13
1.1.3.4. Các thuốc có tác dụng tương tự insulin trong điều hòa chuyển hóa
glucid 13
1.2. CÁC MÔ HÌNH GÂY TĂNG GLUCOSE HUYẾT THỰC NGHIỆM.14
1.2.2. Đái tháo đường do di truyền 15
1.2.3. Động vật đái tháo đường typ 2 do chế độ dinh dưỡng 15
1.3. CÂY Ý DĨ 16
1.3.1. Đặc điểm hình thái 17
1.3.2. Phân bố 17
1.3.3. Thu hái 18 1.3.4. Bộ phận dùng 18
1.3.5. Thành phần hóa học 18
1.3.6. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý 18
1.3.6.1. Các nghiên cứu trên thế giới về tác dụng dược lý của cây Ý dĩ 18
1.3.6.2. Các nghiên cứu trong nước liên quan đến tác dụng hạ glucose huyết
của thân cây Ý dĩ 19
Chương 2 21
ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 22
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu 22
2.1.2. Động vật thí nghiệm 22
2.1.3. Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 23
2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ 23
2.1.3.2. Hóa chất nghiên cứu 23
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.2.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu và điều chế mẫu thử 24

3.3.2. Kết quả định lượng insulin huyết thanh 46
3.3.3. Kết quả hoạt độ enzym G6Pase gan 47
3.3.4. Kết quả trên mô bệnh học tụy 48
3.4. Kết quả ảnh hưởng của HDCL trên khả năng dung nạp glucose của
chuột cống ĐTĐ typ 2 51
3.5. Kết quả đánh giá khả năng ức chế PTP1B in vitro 53
Chương 4 55
BÀN LUẬN 55
4.1. VỀ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT CỦA PHÂN ĐOẠN CHIẾT
CHLOROFORM THÂN CÂY Ý DĨ 55
4.2. VỀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA PHÂN ĐOẠN CHIẾT
CHLOROFORM THÂN CÂY Ý DĨ 59
ĐỀ XUẤT 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
DANH MỤC CÁC CHỮ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

CTLA-4

Cytotoxic T lymphocyte antigen-4
DM:

Dung môi
DPP4

Dipeptidyl-peptidase-4)

pHPS:

Para hydroxybenzen sulfonic acid
PPAR:

Peroxisome proliferator activator receptor
PTP1B:

Protein tyrosine phosphatase 1B
SGLT1:

Sodium-glucose linked transporter
STZ:

Streptozocin
TNF:

Tumor necrosis factor

DANH MỤC BẢNG TRANG

Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng trong khẩu phần ăn của chuột thí nghiệm.29
Bảng 2.2. Thành phần của các dung dịch insulin chuẩn……………… ………31
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng trên PTP1B 35
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của HDCL đến glucose huyết của chuột nhắt trắng bình
thường 37
Bảng 3.2. Nồng độ glucose huyết của chuột nhắt trắng tăng glucose huyết bởi

Hình 3.2. Mức độ hạ glucose huyết của các lô chuột nhắt trắng trên mô hình gây
tăng glucose huyết bởi STZ liều 150 mg/kg……………………………….…….…41
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang và nồng độ
insulin……………………………………………….……………… 42
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang và lượng phospho
vô cơ…………………………………… ………………………………… …… 43
Hình 3.5. Nồng độ insulin huyết thanh của chuột cống bị ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày
uống mẫu thử………………………….……………………………………… ….….46
Hình 3.6. Ảnh vi thể tụy của chuột ở lô chứng âm, ( nhuộm HE x 400
lần)…………………………………………………………………………………… 48
Hình 3.7. Ảnh vi thể tụy của lô thử (nhuộm HE x 400 lần)………………. ….…49
Hình 3.8. Ảnh vi thể tụy của chuột ở lô chứng dương (nhuộm HE x 400 lần).50
Hình 3.9. Ảnh vi thể tụy của chuột ở lô 4 (chuột bình thường ăn chế độ bình
thường (nhuộm HE x 400 lần)……………………… …………………………… 51
Hình 3.10. Sự thay đổi nồng độ glucose huyết của chuột cống ĐTĐ typ 2 trong
test dung nạp glucose…………………………………………………………………52 Hình 3.11. Khả năng dung nạp glucose của chuột cống ĐTĐ typ 2 sau 2 giờ
uống mẫu thử 53
Hình 4.1. Tiêu bản mô học tiểu đảo tụy của người bình thường, người bệnh béo
phì không ĐTĐ, người bệnh ĐTĐ typ 2……………… ………………………….61
1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh nội tiết đặc trưng bởi tình trạng tăng

chúng tôi đã chứng minh được tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết nước của
thân cây Ý dĩ trên chuột bị tăng glucose huyết thực nghiệm [3]. Khảo sát tiếp theo
cho thấy tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol
không có sự khác biệt. Từ dịch chiết ethanol, chúng tôi tiến hành chiết xuất và thử
tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết trên một mô hình thực
nghiệm. Kết quả sơ bộ cho thấy phân đoạn chloroform có tác dụng hạ glucose
huyết tốt nhất. Để tiếp tục nghiên cứu về tác dụng hạ glucose huyết và tìm hiểu cơ
chế tác dụng hạ glucose huyết của thân cây Ý dĩ chúng tôi tiến hành đề tài
"Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết trên động vật thực nghiệm của phân
đoạn chiết chloroform từ thân cây Ý dĩ" với 2 mục tiêu:
1. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của phân đoạn chiết chloroform
thân cây Ý dĩ trên động vật thực nghiệm.
2. Bước đầu tìm hiểu cơ chế hạ glucose huyết của phân đoạn chiết
chloroform từ thân cây Ý dĩ.

3

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
1.1.1. Định nghĩa, phân loại và tiêu chuẩn chẩn đoán

1.1.2.1. Bệnh sinh đái tháo đường typ 1
- ĐTĐ typ 1 là tình trạng thiếu insulin tuyệt đối do tế bào beta của đảo tụy
bị tổn thương gây nên [13], [34]. Hầu hết các trường hợp ĐTĐ typ 1 là hậu quả
của sự phá hủy tế bào beta đảo tụy tự miễn gây thiếu hụt không hồi phục nồng
độ insulin trong máu [29].
- Cơ chế bệnh sinh
Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 đầu tiên phải kể đến di truyền có liên
quan chặt chẽ với yếu tố kháng nguyên bạch cầu người (human leucocyte
antigen -HLA). HLA là những phân tử nằm trên bề mặt các tế bào trình diện
kháng nguyên. Hai tập hợp gen HLA có vai trò quan trọng đặc biệt là DR4-DQ8
và DR3-DQ2 được tìm thấy ở hơn 90% người bị ĐTĐ typ 1 [12]. Các cá thể có
kiểu gen chứa 2 tập hợp gen này có nguy cơ mắc ĐTĐ typ 1 cao nhất và khởi
phát bệnh từ rất sớm. Có nhiều giả thiết cho rằng các tập hợp gen HLA nguy cơ
cao nói trên có vai trò trình diện những đoạn peptid đặc hiệu của tiểu đảo tụy cho
lympho T. Gen có vai trò quan trọng thứ hai trong các yếu tố di truyền liên quan
đến bệnh ĐTĐ typ 1 là gen mã hóa insulin nằm trên nhiễm sắc thể số 11. Đầu 5’
của gen này có các đoạn polynucleotid lặp lại. Các nghiên cứu cho thấy độ dài
của các đoạn lặp này sẽ quyết định nguy cơ mắc ĐTĐ typ 1. Các đoạn lặp có độ
dài càng lớn thì nguy cơ mắc ĐTĐ càng thấp và ngược lại [12]. Trong thực tế, 5

nguyên nhân liên quan đến gen mã hóa insulin chiếm 10% tổng số các trường
hợp nhạy cảm về di truyền của bệnh ĐTĐ typ 1 [32], [55].
Các nghiên cứu sàng lọc về di truyền học đã chỉ ra ít nhất 15 vị trí gen
khác liên quan đến bệnh ĐTĐ typ 1 [25], trong đó, có 2 gen liên quan tới cơ chế
hoạt hóa lympho T. Đó là gen mã hóa kháng nguyên lympho T gây độc tế bào
(CTLA-4), thuộc nhiễm sắc thể số 2 và gen mã hóa lymphoid tyrosine
phosphatase (PTPN22), được biểu thị đặc hiệu ở tế bào lympho T [38].

trong huyết thanh người bệnh xuất hiện rất nhiều kháng thể kháng tiểu đảo tụy,
đây gọi là giai đoạn tiền ĐTĐ typ 1. Tế bào beta bị tổn thương làm cho quá trình
sản xuất insulin giảm dần, cho đến khi nồng độ insulin không đủ để duy trì nồng
độ glucose trong máu ở mức bình thường, bệnh ĐTĐ thật sự sẽ xuất hiện [14].
1.1.2.2. Bệnh sinh đái tháo đường typ 2
ĐTĐ typ 2 thuộc bệnh rối loạn chuyển với đặc hóa đặc điểm: có sự đề
kháng insulin ở mô đích [1],[34]
- Hiện tượng kháng insulin
Kháng insulin là tình trạng giảm hoặc làm mất tính nhạy cảm của cơ quan
đích với insulin [1]
Insulin sau khi được tiết ra từ tế bào β đảo tụy, gắn với tiểu đơn vị α của
insulin receptor (IR), thông tin sẽ được truyền qua màng tế bào tới vùng bào
tương của các tiểu đơn vị β, vùng này có hoạt tính tyrosin kinase nội tại. Tiểu
đơn vị β tự phosphoryl hoá tại các đuôi tyrosin gây ra hàng loạt các phản ứng
trong tế bào thể hiện trong hình 1.1.
7Hình 1.1. Con đường truyền tin nội bào của insulin ở gan và cơ [26]
Con đường truyền tin nội bào bị ức chế sẽ dẫn đến hiện tượng kháng
insulin. Trong thực tế, hiện tượng kháng insulin đã được chứng minh theo các cơ
chế sau:
Bất hoạt insulin receptor (IR) thông qua tăng hoạt tính của các enzym khử
phosphoryl của tyrosin trong con đường truyền tin nội bào của insulin. Một số
enzym đã được nghiên cứu như các protein tyrosin phosphatase (PTP) trong đó
chủ yếu là PTP1B. PTP1B có trong lưới nội chất và trong tế bào mô đích của
insulin với tác dụng tăng hoạt tính các enzym khử phosphoryl (ức chế quá trình

phì [64]. Theo Venables, khoảng 80% bệnh nhân ĐTĐ typ 2 liên quan đến béo
phì và lối sống ít vận động [67]. Theo báo cáo của trung tâm kiểm soát và phòng
bệnh Mỹ, khoảng 55% bệnh nhân ĐTĐ đồng thời mắc béo phì, 85% bệnh nhân
ĐTĐ bị thừa cân. Một trong các nguyên nhân gây béo phì là do chế độ ăn nhiều
chất béo và ít vận động. Ở những bệnh nhân béo phì, nồng độ acid béo tự do
(FFA) tăng cao cạnh tranh với glucose trong chuyển hóa tại cơ vân, gia tăng FFA
gây rối loạn sử dụng glucose ở ngoại biên. Sự gia tăng FFA gây đề kháng
insulin. FFA có vai trò trong việc điều hòa, phóng thích glucose ở gan và góp
phần làm kháng insulin ở gan trên người béo phì [34].
- Hiện tượng bù và sự suy kiệt tiếp theo của tế bào beta
Tình trạng kháng insulin làm giảm tác dụng điều hòa chuyển hóa của
insulin ở các mô đích, với biểu hiện rõ ràng nhất là sự tăng glucose huyết. Khi
nồng độ glucose huyết cao sẽ kích thích tế bào beta của đảo tụy tăng tiết insulin.
Bên cạnh đó, các yếu tố nguy cơ còn có tác động trực tiếp đến tế bào beta. Sự
kết hợp của hai tác động này đôi khi dẫn đến hiện tượng kích thích quá mức tế
bào beta, sau một thời gian sẽ dẫn đến sự suy giảm của tế bào beta. Ngoài ra,
nồng độ FFA và glucose trong máu tăng làm tăng chuyển hoá tại ty thể, tăng các
gốc tự do gây gia tăng tình trạng viêm. Mặt khác, tăng tổng hợp insulin ở tế bào
beta gây ra hiện tượng stress lưới nội chất. Cả hai nguyên nhân này đều dẫn đến
sự chết theo chương trình của tế bào beta. Ở giai đoạn này, sự sản xuất và bài tiết 9

insulin ở tụy giảm đi kèm theo hiện tượng kháng insulin sẵn có làm tình trạng
mất kiểm soát nồng độ glucose huyết tiếp tục xấu đi kèm theo nhiều biến chứng
nghiêm trọng [57].
1.1.3. Hướng tác dụng của thuốc điều trị đái tháo đường
Mục tiêu chung trong điều trị ĐTĐ là nhằm kiểm soát nồng độ glucose
huyết trong giới hạn cho phép, ngăn ngừa và hạn chế biến chứng, góp phần nâng

2, khi tụy vẫn còn khả năng bài tiết insulin [12]. Các thuốc này đã được đưa vào
sử dụng trên lâm sàng từ những năm 50 của thế kỷ trước. Hiện có 2 nhóm thuốc
đang được sử dụng rộng rãi trong điều trị ĐTĐ là nhóm sulfonylurea (gồm
khoảng 20 thuốc chia thành 2 thế hệ) và nhóm meglitinid (gồm 2 thuốc đã được
phép lưu hành là lepaglinid và neteglinid) [46].
- Một nhóm chất kích thích bài tiết insulin khác đang được chú ý là các
incretin như glucagon-like peptide-1 (GLP1). Các peptid này có khả năng làm
tăng bài tiết insulin sau bữa ăn thông qua receptor nằm trên màng tế bào beta
[50]. Ngoài ra, GLP1 còn kích thích sinh tổng hợp insulin qua con đường
AMPv-PKA. Nhược điểm chủ yếu của các peptid này là dễ bị phân huỷ, đặc biệt
dưới tác dụng của enzym dipeptidyl peptidase 4 (DPP4). Để khắc phục nhược
điểm này, các nhà khoa học đã tìm ra những dẫn chất tương tự cũng tác dụng
trên receptor của GLP-1 nhưng bền vững hơn và có khả năng kháng lại DPP4,
điển hình là exenatid. Thử nghiệm trên lâm sàng cho thấy exenatid có tác dụng
kéo dài hơn và hiệu quả điều trị tốt hơn chính GLP-1. Một giải pháp khác cho
người bệnh ĐTĐ theo hướng này là các thuốc ức chế DPP4, làm tăng thời gian
tồn tại và tác dụng của GLP-1. Hiện nay, một số chất ức chế DPP4 đã được sử
dụng rộng rãi cho bệnh nhân ĐTĐ typ 2 là sitagliptin và vildagliptin [50].
- Một trong những hướng nghiên cứu mới thu hút sự chú ý của nhiều nhà
khoa học là các chất đối vận với ghrelin trên receptor GHSR [28]. Ghrelin là một
peptid có 28 acid amin được bài tiết chủ yếu ở dạ dày và hoạt động trên receptor
GHSR để kích thích bài tiết hormon tăng trởng GH và làm tăng cảm giác thèm
ăn. Do đó, ban đầu các chất đối vận với ghrelin chủ yếu được nghiên cứu với tác
dụng điều trị béo phì. Tuy nhiên, từ năm 2001, người ta đã phát hiện ra ảnh
hưởng của ghrelin trên bài tiết insulin của tuyến tụy, cụ thể là ức chế bài tiết
insulin ở cả người và động vật thí nghiệm. Nồng độ ghrelin và insulin trong máu 11


hoà quá trình biểu hiện gen của một số protein quan trọng trong quá trình biệt
hoá tế bào cũng như chuyển hoá glucose và lipid. Một trong những đáp ứng sinh
học quan trọng nhất liên quan đến receptor PPAR là kích thích biệt hoá tế bào
mỡ, kích thích các enzym và protein vận chuyển của tế bào mỡ như lipoprotein
lipase, yếu tố vận chuyển acid béo trong việc thu nạp acid béo. Kết quả là làm
giảm nồng độ acid béo tự do trong huyết tương, tức là gián tiếp cải thiện nguyên
nhân gây kháng insulin ở mô đích. Bên cạnh đó, thiazolidinedion còn làm tăng
nhạy cảm với insulin thông qua sự thay đổi các hormon đặc hiệu do tế bào mỡ
sản xuất [41]. Một số chất chủ vận receptor PPAR mới được phát hiện và
nghiên cứu cũng đồng thời là chất chủ vận receptor PPAR, một receptor có vai
trò quan trọng trong chuyển hoá lipid. Do đó, bên cạnh tác dụng giảm kháng
insulin, các chất này còn có tác dụng giảm lipid máu, góp phần cải thiện tình
trạng của bệnh nhân ĐTĐ typ 2, đặc biệt ở thể béo phì [41].
Một trong những khâu quan trọng trong cơ chế truyền tin của insulin
thông qua receptor đặc hiệu ở tế bào đích là sự phosphoryl hoá tyrosin ở hậu thụ
thể. Quá trình này bị đảo ngược dưới tác dụng của enzym protein tyrosin
phosphatase – 1B (PTP1B). Do đó, PTP1B được coi là chất điều hoà âm tính đối
với hoạt động của insulin ở tế bào đích. Với nguyên lý đó, các chất ức chế
PTP1B có tác dụng làm tăng hoạt động của insulin và trong thực tế, các chất này
đang được nghiên cứu trong việc tìm kiếm thuốc điều trị kháng insulin [15].
Trên thực nghiệm, ức chế PTP1B làm giảm béo phì. Chuột nhắt gây đột biến
PTP1B đề kháng với béo phì, tăng nhạy cảm với insulin, loại chuột nhắt này
không bị béo phì ngay cả khi cho ăn chế độ ăn giàu chất béo [42]. 13

Một mục tiêu nghiên cứu khác của các nhà khoa học cũng theo hướng tăng
cường hoạt động của insulin ở mô đích là các chất ức chế glycogen synthase
kinase-3 (GSK3). GSK3 có vai trò quan trọng trong điều hoà hoạt động của tế

metformin còn có tác dụng ức chế tân tạo glucose trong cơ thể, do đó, góp phần
chống tăng glucose huyết. Tác dụng này của metformin thông qua cơ chế ức chế
glucose 6 phosphatase, enzym quan trọng nhất của con đường tân tạo glucose.
Ngoài ra, metformin còn có tác dụng tương tự insulin trong việc hoạt hoá protein
đặc hiệu vận chuyển glucose (GLUT) [51].
Tương tự như metformin, các muối của vanadium cũng có tác dụng ức chế
tân tạo glucose thông qua ức chế các enzym chủ chốt như PEPCK, glucose 6
phosphatase ở gan và thận. Ngoài ra, các dẫn chất này cũng có tác dụng ức chế
thoái hoá lipid tương tự như insulin và do đó, gián tiếp làm giảm tỷ lệ tân tạo
glucose/ thoái hoá glucose, tức là làm giảm glucose huyết. Để khắc phục độc
tính của các thuốc này do sự ức chế không đặc hiệu các phosphatase, người ta
đang thử nghiệm các muối hữu cơ của vanadium với hi vọng tìm ra những thuốc
điều trị ĐTĐ typ 2 có hoạt lực mạnh hơn và ít độc hơn [20].
1.2. CÁC MÔ HÌNH GÂY TĂNG GLUCOSE HUYẾT THỰC NGHIỆM
Có nhiều phương pháp khác nhau để gây tăng glucose huyết thực nghiệm
trên động vật, từ đơn giản nhất là cho uống glucose cho đến phẫu thuật cắt bỏ
tụy. Dưới đây xin trình bày một số nhóm phương pháp được sử dụng phổ biến
nhất trong các nghiên cứu thực nghiệm.
1.2.1. Tăng glucose huyết thực nghiệm do hóa chất
Các hóa chất thường dùng để gây tăng glucose huyết thực nghiệm thường
là những chất có thể gây phá hủy tế bào β đảo tụy như alloxan, streptozocin,
dithizon, gold-thioglucose, monosodium glutamat, 8-hydroxyl quinolon [30], 15

[36], [44]. Trong đó hay được sử dụng nhất là streptozocin (hay streptozotocin -
STZ), một chất có cấu trúc gần giống glucose và tác dụng chọn lọc lên tế bào β
đảo tụy. Sau khi xâm nhập vào tế bào, STZ sẽ tách thành 2 thành phần là glucose
và methylnitrosourea. Methylnitrosourea là tác nhân alkyl hóa mạnh gây biến đổi