 

 


XANTHIN OXIDASE IN VITRO 



H3

LỜI CẢM ƠN

 lun  c s  rt nhiu ca thy

 c ti TS. Nguyễn Thuỳ Dương
TS. Nguyễn Quỳnh Chi, TS. Nguyễn Hoàng Anh nhi th 
ng d






  k thun sinh
 B  c l    u ki    
c hi 
 o 
a Ti hi.
Li cui li c ng nghip
nh 

2.2.  27
2.3.  28
2.3.1. Te in vitro
UV  Costar 3635 28
2.3.2.          UV 96
Costar 3635  32
2.3.3. in vitro 
 34
2.3.4.  35
 3.  36
 xanthin
oxidase in vitro UV  Costar 3635 36
3.1.1. K 36
3.1.2.  36
3.1.3.  in
vitro  37
3.2.         acid uric     
oxidase in vitro 40
3.2.1.  xanthin oxidase in vitro 
 40
3.2.2. 
50
 47
in vitro 
Archidendron clyearia) 48

50
 48

50

IXP
Isoxanthopterin
OXH

PRPP
Phosphoribosyl pyrophosphate


SLC2A9
Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 9
protein
URAT1
Urate transporter 1
XO
Xanthine oxidase



Trang
1.1
 
max



        
50
     

49
3.6
            
ACE8
51




Trang
1.1
acid uric
3
1.2
acid uric
4
1.3
acid uric
5
1.4

9
1.5

10
1.6

      Burk   

50
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Acid uric là sản phẩm của quá trình chuyển hóa protein có nhân purin
trong cơ thể. Acid uric có vai trò quan trọng với cơ thể con người liên quan tới
duy trì huyết áp, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch [39], [44], [53], [74]. Tuy
nhiên, tăng acid uric máu, đặc biệt tăng acid uric máu mạn tính, lại là nguyên
nhân dẫn tới nhiều vấn đề về sức khỏe như gút, tăng huyết áp, bệnh tim mạch,
bệnh thận, bệnh đái tháo đường typ II [44], [74], [84]. Trong đó gút là bệnh viêm
khớp phổ biến nhất, ảnh hưởng đến 2,13% dân số Mỹ trong năm 2009 [23]. Theo
các nghiên cứu gần đây, gút và các bệnh liên quan tới tăng acid uric máu ngày
càng trở nên phổ biến không chỉ ở các nước phát triển mà cả các nước đang phát
triển [24], [34], [86], [109]. Theo một nghiên cứu năm 2000, tỷ lệ mắc bệnh gút
ở Việt Nam ước tính là 0,14% dân số và tỷ lệ này ngày một tăng cao [10], [73].
Hạ acid uric là mục tiêu hàng đầu trong phòng, điều trị gút và các bệnh
liên quan đến tăng acid uric máu [39]. Hiện nay, hai nhóm thuốc hạ acid uric
máu gồm các thuốc làm tăng thải acid uric qua thận và nhóm thuốc làm giảm
tổng hợp acid uric. Các thuốc gây tăng thải acid uric như probenecid,
sulfinpyrazon có hiệu quả tốt trong việc làm hạ acid uric máu, đặc biệt làm giảm
kích thước cũng như số lượng các hạt tophi. Tuy nhiên, thuốc tỏ ra kém hiệu quả
trên bệnh nhân suy giảm chức năng thận và có thể gây ra sỏi thận urat cũng như
nhiều tác dụng phụ khác [2], [72], [83], [107]. Các thuốc làm giảm tổng hợp acid

3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ACID URIC VÀ SỰ TĂNG ACID URIC MÁU
1.1.1. Acid uric
Acid uric có công thức phân tử là 2,6,8 - trioxypurin (C
5
H
4
N
4
O
3
), là chất
chuyển hóa của purin [78].
1.1.1.1. Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể
Acid uric là sản phẩm của quá trình thoái giáng các nucleo-protein có
chứa nhân purin (adenin, guanin) trong cơ thể với sự tham gia của các enzym:
phosphoribosyl pyrophosphatase (PRPP), nucleoside phosphorylase, xanthin
oxidase (XO) [37], [78] (hình1.1).

Hình 1.1: Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể [37]

cùng với việc thừa nhận vai trò quan trọng của con đường đào thải acid uric qua
đường tiêu hóa, các nhà khoa học Nhật Bản đã đề xuất chia các nguyên nhân gây
tăng acid uric máu thành 2 nhóm lớn như sau: nhóm A gồm các nguyên nhân
ngoài thận (trong đó gồm 2 nhóm nhỏ, A1: tăng sản xuất acid uric, A2: giảm đào
thải qua con đường ngoài thận), nhóm B gồm các nguyên nhân giảm đào thải
acid uric qua thận [53]. (Hình 1.3)

Hình 1.3: Các nguyên nhân gây tăng acid uric máu [53]
6
 Tăng sản xuất acid uric
Các nguyên nhân gây tăng sản xuất acid uric gồm có: tăng các chất có
nhân purin, rối loạn hoạt động các enzym.
- Các chất có nhân purin là nguồn để tạo thành acid uric, được cung cấp
do ba nguồn: thức ăn giàu purin, tổng hợp nội sinh, tiêu hủy tế bào chết. Những
người thường xuyên ăn nhiều thức ăn giàu purin, sử dụng nhiểu rượu, bia có
nguy cơ tăng acid uric máu và mắc bệnh gút cao hơn những người khác. Tăng
purin nội sinh có vai trò chủ yếu trong việc tăng acid uric máu và gút [37], [78].
- Rối loạn hoạt động các enzym là nguyên nhân quan trọng gây tăng acid
uric máu. PRPP và xanthin oxidase tăng hoạt động làm tăng nồng độ acid uric
máu. Sự thiếu hụt một phần hay toàn phần HGPRT (HGPRT xúc tác cho phản
ứng nghịch chuyển acid guanylic thành guanin) làm tăng phản ứng chuyển
hypoxanthin thành xanthin và sau đó là acid uric [10], [37], [78].
 Giảm đào thải acid uric qua ruột
Giảm hoạt động của kênh ABCG2 (BCRP) làm tăng đào thải acid uric qua
thận nhưng lại làm giảm đào thải acid uric qua ruột và do đó làm tăng acid uric
máu [50], [53].
 Giảm đào thải acid uric qua thận

Tăng acid uric máu có mối liên hệ chặt chẽ với bệnh tăng huyết áp, bệnh
tim mạch [69]. Nồng độ acid uric máu cao làm thay đổi cấu trúc, chức năng của
vi mạch, từ đó làm rối loạn chức năng nội mô là nguyên nhân của bệnh động
mạch vành và bệnh tăng huyết áp. Mặt khác, tăng acid uric máu cũng làm tăng
nguy cơ béo phì và suy giảm chức năng thận dẫn đến tăng nguy cơ về bệnh tim
mạch [39], [84].
 Tăng acid uric máu và bệnh thận
Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy, tăng acid uric máu làm tăng nguy cơ
mắc bệnh thận. Acid uric máu cao không những làm tổn hại tới động mạch vành
mà còn ảnh hưởng tới mạch máu ở thận. Các nghiên cứu can thiệp gần đây cung
cấp bằng chứng cho thấy, giảm urat khi sử dụng allopurinol có thể làm chậm sự
tiến triển của bệnh suy thận mạn tính [39], [45], [84].
8
 Tăng acid uric máu với kháng insulin và béo phì
Những bệnh nhân có bệnh về chuyển hóa có tỷ lệ mắc bệnh gút cao hơn.
Tăng acid uric máu làm tăng nguy cơ kháng insulin, béo phì [83]. Nguy cơ mắc
đái tháo đường typ II của bệnh nhân gút tăng 35% đến 65% [84] so với người
bình thường.
Như vậy, tăng acid uric máu không chỉ là nguyên nhân gây bệnh gút mà
còn đóng vai trò quan trọng trong các bệnh khác như huyết áp, tim mạch, thận và
đái tháo đường typ II. Hạ acid uric máu là mục tiêu điều trị quyết định trong
bệnh gút và các bệnh khác liên quan tới tăng acid uric.
1.2. ENZYM XANTHIN OXIDASE
Xanthin oxidase (XO) là enzym xúc tác cho phản ứng cuối cùng trong
chuỗi phản ứng để tạo thành acid uric trong cơ thể. Bất kỳ tác động nào ảnh
hưởng đến hoạt động của xanthin oxidase cũng ảnh hưởng tới sự tạo thành acid
uric trong cơ thể.

OS(OH) với L là
đại diện cho đồng yếu tố pyranopterin chung cho các enzym molybden và
vonfram đơn nhân.
Cơ chế hoạt động của enzym như sau: proton từ nhóm Mo-OH tấn công
trung tâm ái nhân tại vị trí C-8 của cơ chất, đồng thời vận chuyển hydro giải
phóng từ vị trí C-8 tới nhóm Mo-S tạo ra LMo
IV
O(SH)(OR) – giai đoạn 1. Sản
phẩm trung gian này bị phá vỡ bởi sự vận chuyển electron giữa các trung tâm
oxy hóa khử khác trong enzym, giải phóng H
+
, tạo ra LMo
V
OS(OR) – giai đoạn
2. Sau đó, hydro từ dung môi thay thế nhóm R, quay về trạng thái ban đầu
LMo
VI
OS(OH) của enzym – giai đoạn 3 [32] (Hình 1.5).
10

Hình 1.5: Cơ chế hoạt động của xanthin oxidase
 Các thông số động học enzym
Thông số dược động học của enzym (K
m
và V
max
) được xác định bằng

enzym đạt tới tốc độ cao nhất [1]. Nhiệt độ cũng là một yếu tố trong quá trình
bảo quản enzym. Xanthin oxidase bảo quản ở nhiệt độ 4
o
C sẽ không bị giảm
hoạt tính trong vòng 6 tháng. Ở nhiệt độ -20
o
C, enzym ổn định trong ít nhất một
năm. Theo một số nghiên cứu so sánh giữa xanthin oxidase sữa bò với xanthin
oxidase sữa dê, nhiệt độ tối ưu cho xanthin oxidase từ sữa bò là 10
o
C và cho
xanthin oxidase từ sữa dê là 20
o
C [40], [54].
 pH
Enzym rất nhạy cảm với pH của môi trường, vì vậy pH có tác dụng rất lớn
đối với tốc độ phản ứng enzym. Mỗi enzym có một giá trị pH phù hợp nhất cho
hoạt động của enzym đó. Một sự thay đổi nhỏ so với pH tối ưu cũng dẫn đến sự
giảm hoạt độ enzym do nó làm thay đổi sự ion hóa của nhóm chức trong trung
tâm hoạt động enzym [1]. Với xanthin oxidase, pH thích hợp là 7,5 – 8. Cũng có
nghiên cứu khác cho thấy pH thích hợp từ sữa bò là 7,5 và từ sữa dê là 7,2 – 7,4
[54].
 Ion kim loại
Các ion kim loại nặng có thể ức chế xanthin oxidase (Ví dụ: Hg
2+
,
Ag
+
…). Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn ảnh hưởng tới cả trung
tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzym [1].

B
C
Hình 1.6:
Đồ thị hàm số ngược 1/v đối với [S]
Trong đó, A: Cơ chế ức chế cạnh tranh ; B: Cơ chế ức chế không cạnh tranh
C: Cơ chế ức chế hỗn hợp [62]

Bảng 1.1: Mối liên quan giữa cơ chế ức chế và các thông số V
max
biểu kiến,
K
m
biểu kiến [62]
Kiểu ức chế V
max
biểu kiến K
m
biểu kiến
Không ức chế V
max
K
m

Ức chế cạnh tranh (competitive) V
max
αK
m

Ức chế không cạnh tranh (uncompetitive) V
max

2
O Acid uric + H
2
O
2

Lượng acid uric tạo thành được định lượng bằng phương pháp đo quang ở
bước sóng 290nm.
Hỗn hợp phản ứng (gồm dung dịch đệm, dung dịch EDTA, dung dịch
xanthin, enzym xanthin oxidase với mẫu trắng, các mẫu đối chiếu thêm dung
dịch với các nồng độ khác nhau, các mẫu thử thêm cao dược liệu ở các nồng độ
khác nhau) được ủ ấm ở nhiệt độ thích hợp, trong thời gian thích hợp. Sau khi
phản ứng kết thúc, đem các hỗn hợp đo quang ở bước sóng 290nm [77].
Phương pháp này được nhiều nhà nghiên cứu áp dụng và điều chỉnh thiết
kế nghiên cứu nhằm phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Thí nghiệm
thường được tiến hành trên ống nghiệm, sử dụng máy quang phổ UV thông
thường [7]. Tuy nhiên, cách này chỉ phù hợp với số lượng mẫu đo không quá
nhiều. Khi số lượng mẫu thử tăng lên, việc tiến hành thử từng mẫu trên ống
nghiệm sẽ có nguy cơ gặp sai số do sai khác về điều kiện phản ứng giữa các lần
Xanthin oxidase

15
đo, đồng thời bị hạn chế do thời gian nghiên cứu kéo dài và chi phí cao. Có thể
tiến hành thí nghiệm trên đĩa UV 96 giếng, sử dụng hệ thống ELISA để giảm sai
số, rút ngắn thời gian nghiên cứu và giảm chi phí [59], [75].
 Phương pháp đo quang dựa trên chất ABT
(2,2’-azino-di (3ethylbenzthiazoline-6-sulphonate))

của ATBS
ox
tạo thành sau 10 phút ở bước sóng 410nm [70].
Phương pháp này có độ nhạy khá cao, có thể định lượng được hoạt độ lên
tới 20 U/ml, và còn được áp dụng để định lượng hoạt độ enzym trong cả nghiên
cứu in vivo, tránh được sai số do enzym uricase so với phương pháp đo quang
dựa trên định lượng acid uric [70].
1.3.2. Phương pháp đo áp
Xanthin oxidase là một chất cho electron nên có thể xác định hoạt độ
enzym thông qua việc đánh giá sự khử của các chất nhận electron phù hợp như
oxy, xanh methylen và cytocrom C.
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên việc xác định tỷ lệ oxy tiêu thụ
bằng phương pháp đo áp ở 37
o
C [36].
Xanthin
oxi
dasse

Uricase

Peroxidase

16
1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên phản ứng oxy hóa 2-amino-4-
hydroxypteridin (AHP) thành isoxanthopterin (IXP) dưới sự xúc tác của xanthin

dịch chiết loài Stemodia grossa có tác dụng mạnh nhất [94]. Một số nghiên cứu
của Ấn Độ, Phillipine, Jordani cũng tiến hành theo hướng này [20], [52], [97].
Dược liệu thuộc các họ được sử dụng nhiều trong Y học Cổ truyền với tác
dụng chống viêm, giảm đau cũng được các nhà khoa học trên thế giới đưa vào
sàng lọc như các dược liệu họ Sim (Myrtaceae) [95], họ Dây gối (Celastraceae)
và họ Hoa môi (Lamiaceae) [46], chi Lychnophoras họ Cúc (Asteraceae) [42].
Dược liệu thuộc các họ này được sử dụng phổ biến với tác dụng chống viêm,
giảm đau đồng thời có chứa flavonoid, nhóm hợp chất có nhiều hoạt tính sinh
học trong đó có tác dụng chống oxy hóa.
Các nhóm hợp chất có tiềm năng ức chế xanthin oxidase như flavonoid,
polyphenol, coumarin hay tanin đã được sàng lọc tác dụng trên mô hình in vitro
để tìm kiếm các chất có tác dụng ức chế mạnh nhất [27], [28], [35], [89]. Kết
hợp với nghiên cứu cấu trúc, đánh giá tương tác không gian giữa phân tử hợp
chất với enzym, liên quan cấu trúc – tác dụng, đã tìm ra một số chất có tác dụng
tốt như apigenin, myricetin và luteolin [65], [67].
Phối hợp với các nhà khoa học Nhật Bản, Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng
sự đã thực hiện nghiên cứu sàng lọc 288 dịch chiết từ 96 dược liệu thu hái ở
miền Nam Việt Nam để phân lập các hoạt chất có hoạt tính ức chế mạnh nhất.
Kết quả cho thấy 21 dịch chiết có tác dụng ức chế hoạt tính enzym trên 50% ở
nồng độ 50 µg/ml, trong đó dịch chiết methanol của 4 loài Artemisia vulgaris,
Caesalpinia sappan, Blumea balsamifera, Chrysanthemum sinense và dịch chiết
trong methanol – nước của Tetracera scandens [75].
Trong đề tài này, các dược liệu được biết đến với tác dụng chống viêm,
chống oxy hóa, công dụng trị bệnh xương khớp thu thập được từ dự án ‘Bảo tồn
nguồn cây thuốc cổ truyền’ của Viện Dược liệu sẽ được đưa vào sàng lọc tìm
kiếm các dược liệu có tiềm năng hạ acid uric thông qua ức chế xanthin oxidase
in vitro.