BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THU TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DƯỢC LIỆU
CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
LIPOXYGENASE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO THU TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DƯỢC LIỆU
CÓ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
LIPOXYGENASE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Hoàng Quỳnh Hoa
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Thực vật MỤC LỤC
Trang
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ … ……………………………………….………………. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN………………… ………………………… 3
1.1. T
ổng quan về enzym Lipoxygenase ….…………………………… 3
1.1.1. Đị
nh nghĩa….…………………………………………………. ……3
1.1.2. P
hân loại enzym LOX ……………………………………… ……3
1.1.3. C
ơ chế phản ứngcủa enzym LOX và cơ chất……………….…… 4
1.1.4. V
ai trò của LOX trong động thực vật … ……………………….… 5
1.1.5. C
ác chất ức chế LOX ………………………………………… …6
1.1.6. C
ơ chế ức chế LOX….…………………………………………. … 7
1.2. C
ác mô hình thử tác dụng ức chế LOX……………………… 7
1.2.1. N
guyên lý của các mô hình thử tác dụng ức chế LOX………… 7

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AST Aspartate aminotransferase
ALT Alanine aminotransferase
DMSO Dimethylsulfoxid
LOX Enzym Lipoxygenase
LDL Low Density Lipoprotein
% ƯC Phần trăm ức chế
DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Số hình Tên hình Trang
1 1.1 Cơ chất thường gặp của LOX 3
2 1.2 Cấu trúc của 15-LOX ở thỏ 4
3 1.3 Cơ chế xúc tác của LOX 5
4 1.4
Phương pháp đo độ hấp thụ của
hydroperoxid
9
5 1.5 Mô hình đĩa 96 giếng của Cayman 11
6 1.6 Cấu trúc hóa học của rutin 14

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong cơ thể người, enzym lipoxygenase (LOX) đóng vai trò quan trọng
trong quá trình sinh tổng hợp các chất trung gian hóa học gây ra các phản ứng
viêm, dị ứng và phản ứng miễn dịch [17]. Sản phẩm xúc tác của LOX liên
quan nhiều bệnh như hen phế quản [23], xơ vữa động mạch [40], [48], ung
thư [56], viêm loét đại tràng [21], viêm khớp, viêm cầu thận [17] và bệnh vẩy
nến [32].
Các chất ức chế LOX đã được chứng minh có tác dụng ngăn cản nguy cơ
ung thư [59] và đã được sử dụng để điều trị ung thư tuyến tụy [36], ung thư dạ

enzym lipoxygenase của dịch chiết các dược liệu: chè dây, dâu tằm, lá móng,
kim ngân, cườm rụng, cúc áo, mã đề, xạ đen.
3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan vềenzym lipoxygenase
1.1.1. Định nghĩa
Lipoxygenases (LOX)là một nhóm các enzyme phức tạp. Thành phần
cấu tạo gồm có phần protein và phần nhóm ngoại chứa sắt. LOX xúc tác cho
phản ứnggắn phân tử oxy vào các acid béo có nhóm cis, cis-1,4-pentadien.
Hai acid béo acid linoleic và acid arachidonic là những cơ chất thường gặp
của LOX trong động thực vật [19], [26].

Hình 1.1. Cơ chất thường gặp của LOX
1.1.2. Phân loại enzym LOX
LOX có trong thực vật, động vật và nấm. Có nhiều loại LOX, nếu phân
loại dựa trên vị trí hydroperoxide hóa thì có các loại LOX sau: LOX-1, LOX-
3, LOX-5, LOX-9, LOX-12, LOX-13, LOX-15. Trong đó chỉ có LOX-5,

sinh tổng hợp các chất trung gian hóa học gây ra các phản ứng viêm, dị ứng
và phản ứng miễn dịch [17]. Sản phẩm xúc tác của LOX liên quan đến các
bệnh hen phế quản [23], xơ vữa động mạch do làm tăng sự oxy hóa LDL
6

trong máu [40],[48], ung thư [56],viêm loét đại tràng [21], viêm khớp, viêm
cầu thận [17] và bệnh vẩy nến [32].
Các chất ức chế LOX có tác dụng ngăn cản nguy cơ ung thư [59] và đã
được sử dụng để điều trị ung thư tuyến tụy [36], ung thư dạ dày [66], ung thư
vú [25],ung thư gan di căn [28], ung thư miệng [45], hen mạn tính [52], phổi
tắc nghẽn mạn tính, bệnh viêm đường hô hấp trên[15], viêm đại tràng [22],
[51],viêm khớp gối [29] và bệnh da liễu [15].
Bên cạnh đó, các chất ức chế LOX cũng có vai trò quan trọng trong
ngành công nghiệp thực phẩm. Sự xúc tác quá trình oxy hóacác acid béo trong
thực phẩm của LOX là một trong những nguyên nhân gây ôi thiu thực
phẩmvà làm thay đổi hương vị, màu sắc của thực phẩm. Nước chè đã được
ứng dụng để bảo quản cá do các hợp chất polyphenol trong chè có tác dụng ức
chế LOX tốt [61].
1.1.5. Các chất ức chế LOX
Cho tới nay, các nhà khoa học đã tìm ranhiều chất có tác dụng ức chế
LOX bao gồm cả các chất có nguồn gốc thiên nhiên và các chất tổng hợp hóa
học. Trong số các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên, flavonoid chiếm đa số,
bao gồm: Rutin [60], quercetin [30], baicalein, esculetin [54], artemitin và
casticin [20]. Ngoài ra còn có tanin như epigallocatechin gallate [31] và nhiều
hợp chất phenolic tự nhiên khác như acid boswellic [25], acid caffeic,
curcuminoid [39], eugenol [50], acid nordihydroguiaretic [64], daidzein và
genistein [63]. Các chất tổng hợp hóa học có tác dụng ức chế LOX
gồmzileuton, tebufelone, darbufelone, phenidone, docebenone và lonapalene
[18]. Các chất đã liệt kê ở trên đều đã được nghiên cứu trên invitro cho kết
quả ức chế LOX tốt, zileuton còn được ứng dụng trên lâm sàng dùng để điều

phương pháp sắc ký [16]. Phương pháp này phức tạp và không nhanh.
- Dựa trên lượng sản phẩm hydroperoxide tạo thành:
8

Sản phẩm đầu tiên của phản ứng biến đổi acid linoleic dưới xúc tác của
lipoxygenase là một acid béo chưa no có chứa 4-hydroperoxy-cis, trans-1,3-
pentadien liên hợp [19], [26].Việc xác định lượng hydroperoxid tạo thành
được thực hiện dựa trên 2 nguyên tắc đo màu và đo độ hấp thụ.
o Phương pháp đo màu: sản phẩm hydroperoxid tạo thành phản ứng
với I
–
giải phóng I
2
, thêm hồ tinh bột, định lượng sản phẩm có màu tạo
thànhdo hồ tinh bột kết hợp với I
2
bằng phương pháp đo màu [65].Một số tác
giả khác cho sản phẩm hydroperoxide oxy hóa Fe
2+
thành Fe
3+
, sau đó cho
Fe
3+
phản ứng với thiocyanat và định lượng sản phẩm có màu tạo thành bằng
phương pháp đo màu [38]. Bên cạnh đó, một số tác giả lại cho hydroperoxid
oxy hóa cặp 3-methyl-2-benzothiazolinon và 3-(dimethylamino)benzoic acid
dưới xúc tác của hemoglobin tạo thành sản phẩm có màu rồi định lượng bằng
phương pháp đo màu [27]. Phương pháp đo màu đơn giản, tuy nhiên không
phù hợp với các mẫu có màu.

Mô hình của Sigma – Aldrich sử dụng máy quang phổ
spectrophotometer UV – VIS và cuvet thạch anh, đọc độ hấp thụ ở bước sóng
234nm.
Đơn vị hoạt tính enzym được sử dụng là Unit, được định nghĩa như sau:
1 unit enzym tương ứng sự tăng của độ hấp thụlà 0,001mỗi phút ở bước sóng
234nm, pH9,0, nhiệt độ 25
o
C, cơ chất sử dụng là acid linoleic, tổng thể tích
dung dịch trong cuvet là 3ml, bề dày dung dịch là 1cm, 1unit tương ứng với
sự oxy hóa 0.12µmol acid linoleic.
Có cis, cis-1,4-pentadien
Acid béo chưa no có chứa 4-hydroperoxy-
cis,trans-1,3-pentadien liên hợp
Có nối đôi liên hợp hấp thụ
ánh sáng mạnh nhất ở bước
sóng 234 nm [27] → Đo
được hydroperoxid tạo
thành bằng phương pháp
quang phổ hấp thụ UV
10

Phương pháp xác định hoạt tính enzym là phương pháp đo quang. Phản
ứng thực hiện trong cuvet. Có 2 cuvet: cuvet chứa mẫu thử và cuvet chứa mẫu
trắng. Mẫu thử bao gồm 900µl đệm borat, 2ml dung dịch cơ chất, 100µl dung
dịch enzym. Mẫu trắng bao gồm 1ml đệm borat và 2ml dung dịch cơ chất.
Nồng độ dung dịch cơ chất là 536µM, nồng độ dung dịch enzym là 5000 –
10000U/ml và đệm borat pH9,0. Ở 25
o
C, bước sóng 234nm, đo độ hấp thụ
của mẫu thử so với mẫu trắngtại thời điểm 5 phút.
90µl 15-LO
90µl 15-LO
90µl 15-LO

10µl
chất ức chế
Bắt đầu
phản ứng
10µl cơ chất 10µl cơ chất 10µl cơ chất 10µl cơ chất
Lắc đĩa trong 5 phút
Ngừng
phản ứng
100µl
chromogen
100µl
chromogen
100µl
chromogen
100µl
chromogen
Lắc đĩa trong 5 phút
Đọc độ hấp thụ ở 490 – 500nm 12

trong đệm borat pH9,0. Thêm 0,25ml dung dịch enzym (20 000U/ml). Ủ 5
phút ở 25
o
C rồi thêm 1ml dung dịch acid linoleic 0,6mM. Đo độ hấp thụ ở
234nm. Song song thực hiện với mẫu indomethacin chuẩn.
b. Mô hình của Veronica Sanda Chedea[62]
Veronica Sanda Chedea và cộng sự đã thử tác dụng ức chế LOX theo
quy trình sau: Ủ 160µl dung dịch LOX (2300U/ml) với 50µl chất ức chế trong
5 phút. Thêm 8,4µl dung dịch cơ chất 2,2mM. Đo độ hấp thụ ở 234nm. Song
song làm một mẫu trắng gồm 840µl đệm borat pH9,0 và 160µl dung dịch
LOX.
c. Mô hình của Ali Shah S.M.[13]
Ali Shah S.M. dùng methanol để chiết xuất dược liệu. Cắn thu được sau
khi cất thu hồi dung môi được hòa tan trong Tris-buffer pH7,4. Ủ dung dịch
ức chế tạo thành với enzym trong 10 phút ở 25
o
C, thêm cơ chất. Đo độ hấp
thụ sau 6 phút. Song song làm với baicalein chuẩn để so sánh.
d. Mô hình của Sekhar Rao [53]
Sekhar Rao và cộng sự dùng ethyl acetat để chiết xuất dược liệu, thu hồi
dung môi thu cắn, hòa tan cắn trong DMSO. Quy trình thí nghiệm như sau:
Phối hợp 60µl dung dịch cơ chất 10mM với 10µl dung dịch chất ức chế, thêm
2,91ml đệm borat, bắt đầu phản ứng bằng cách thêm 20µl enzym. Đo độ hấp
thụ sau 3 phút. Song song làm mẫu trắng, thay 10µl dung dịch chất ức chế
bằng 10µl DMSO.
e. Mô hình của Uma Sankar Akula [60]
Uma Sankar Akula và cộng sự đã công bố phương pháp chiết xuất
dược liệu bằng methanol, cất thu hồi dung môi thu được cắn, hòa tan cắn
trong DMSO. Dung môi hòa tan enzym và cơ chất là đệm phosphate pH9,0.
Chất chuẩn được sử dụng là rutin và nordihydroguaiaretic acid.Phối hợp 50µl

15

Chè dây có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, khu phong, lợi thấp, giảm đau,
chống viêm[1].Chè dây có tác dụng tốt trong điều trị viêm loét dạ dày – hành
tá tràng, có tác dụng kháng khuẩn khá và tác dụng chống oxy hóa mạnh [12].
Cao khô chè dây có hoạt tính chống oxy hóa, ức chế sự phát triển của
một số chủng vi khuẩn, điều trị hiệu quả bỏng và loét dạ dày tá tràng, ức chế
đột biến gen gây nên bởi một số tác nhân độc hại [43].
1.3.3. Dâu tằm(Morus alba L.), họ Dâu Tằm (Moraceae)
Lá dâu tằm chứa 4 flavonol là quercetin-3-β-D-glucose, quercetin-3-O-
glucose-6″-acetate, rutin và quercetin[37]. Ngoài ra còn có caroten, tanin, rất
ít tinh dầu, vitamin C, cholin, adenin, trigonellin, pentozan, đường, canxi
malat và canxi cacbonat [8].Các flavonol khử các gốc peroxyl, gốc hydroxyl
nên chống oxy hóa mạnh [37].
1.3.4. Lá móng(Lawsonia inermis L.), họ Tử Vi (Lythraceae)
Trong lá và rễ cây lá móng chứa flavonoid, saponin, acid hữu cơ, đường
khử, chất béo, hợp chất steroid và polysaccharid [3]. Ngoài ra còn có tannin,
tinh dầu, chất nhựa, chất màu, glucose, manitol. Rễ chiết được chất sterol là
lawsaritol và dihydroxysterol là lawsaritol A. Hoa chứa tinh dầu có ionon. Hạt
chứa protein, chất béo và hydratcarbon.Vỏ cành cây chứa một naphtoquinon
gọi là isoplumbagin [8], [2]. Lá chứa anthranoid. Từ lá đã phân lập được 6
chất sau: 2β, 3β–dihydroxy–12–oleanen–28–oic acid; 1β, 2α, 3α, 19α–
tetrahydroxy–12–ursen–28–oic acid; Suavissimoside R1; Afzelin; Catechin;
và Rubinaphthin [3]. Ngoài ra, lá móngcòn chứa một oxynaphtoquinon gọi là
Lawsone, một hydrocarbon no là 3–methylnonacosan–1–ol, một lawsoniasid
có cấu trúc 1,2,4–trihydroxynaphtalen–1,4–dibeta–D–glucopyranosid và một
laliosid là 2,3,4,6–tetrahydroxyacetophenol–2–beta–D–glucopyranosid[8],
[2].
16