BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LẠI THỊ THẮM

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN
HÓA HỌC CỦA RỄ CÂY
ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza Bunge)
TRỒNG Ở TỈNH LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI- 2015BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LẠI THỊ THẮM

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN
HÓA HỌC CỦA RỄ CÂY
ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza Bunge)
TRỒNG Ở TỈNH LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ


Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Vị trí phân loại chi Salvia L. 2
1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Salvia L. 2
1.2.1. Đặc điểm thực vật 2
1.2.2. Phân bố và sinh thái 3
1.3. Thành phần hóa học của chi Salvia L. 4
1.3.1. Diterpenoid 4
1.3.2. Các dẫn xuất của Acid phenolic 6
1.3.3. Flavonoid 7
1.3.4. Một số thành phần khác 8
1.4. Tác dụng sinh học của chi Salvia L. 9
1.5. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền 10
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.1. Nguyên liệu và thiết bị 12
2.1.1. Nguyên liệu 12
2.1.2. Hóa chất, trang thiết bị 13

2.2. Phương pháp nghiên cứu 13
2.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong rễ đan sâm 13
2.2.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc một số hợp chất
có trong rễ Đan sâm 15
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 18
3.1. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học 18
3.1.1. Định tính các nhóm chất bằng phương pháp hóa học 18
3.1.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 20
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
Bảng 3.1
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phương pháp
hóa học
19
Bảng 3.2
Kết quả phân tích SKĐ ở bước sóng 254nm khi chạy
SKLM với hệ 1
20
Bảng 3.3
Kết quả phân tích SKĐ ở bước sóng 366nm khi chạy
SKLM với hệ 4
21
Bảng 3.4
Kết quả phân tích SKĐ ở bước sóng 254nm khi chạy
SKLM với hệ 6
22
Bảng 3.5
Kết quả phân tích SKĐ ở bước sóng 254nm khi chạy
SKLM với hệ 11
23
Bảng 3.6
Phổ
1
H- và
13
C-NMR của hợp chất số 1 và


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình vẽ,
đồ thị
Tên hình vẽ, đồ thị Trang

Hình 1.1 Cấu trúc một số abietane diterpenoid 5
Hình 1.2. Cấu trúc một số chất thuộc nhóm clerodane diterpenoid 5
Hình 1.3
Cấu trúc một số chất thuộc nhóm labdane và pimarane
diterpenoid
6
Hình 1.4 Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi Salvia L. 8
Hình 2.1.
Một số hình ảnh cây Đan sâm ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào
Cai
12
Hình 3.1
SKĐ dịch chiết methanol ở bước sóng 254nm khi chạy
SKLM với hệ 1
20
Hình 3.2.
SKĐ dịch chiết methanol ở bước sóng 366nm khi chạy
SKLM với hệ 4
21
Hình 3.3
SKĐ dịch chiết methanol ở bước sóng 254nm khi chạy
SKLM với hệ 6
22
Hình 3.4

nước.
Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến thời điểm này chưa có nhiều nghiên cứu về
thành phần hóa học của dược liệu Đan sâm. Để góp phần cung cấp những cơ sở tiền
đề cho việc sử dụng, bảo tồn và phát triển loài Đan sâm làm thuốc ở Việt Nam,
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học
của rễ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) trồng ở tỉnh Lào Cai” nhằm
mục tiêu như sau:
1. Định tính các nhóm chất trong rễ cây Đan sâm.
2. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc một số chất từ rễ cây Đan sâm. 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Vị trí phân loại chi Salvia L.
Theo hệ thống phân loại thực vật Takhtajan (2009) [28], vị trí phân loại của
chi Salvia là:
Giới thực vật: Planta
Ngành Ngọc lan: Magnolyophyta
Lớp Ngọc lan: Magnolyopsida
Phân lớp bạc hà: Lamiidae
Bộ hoa môi: Lamiales
Họ hoa môi: Lamiaceae
Chi: Salvia.
1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Salvia L.
1.2.1. Đặc điểm thực vật
Các loài thuộc chi Salvia L. là cây cỏ hay cây bụi nhỏ. Lá đơn hay lá kép
lông chim, mọc đối dọc thân hay tập trung ở dưới gốc. Cụm hoa dạng chùm, dạng
chùy hay dạng bông ở đỉnh cành. Lá bắc có màu hay không, tồn tại hay sớm rụng.
Đài hình chuông, hình trứng hay có dạng ống, 2 môi: môi trên 3 thùy hay hàn liền
thành 1 thùy; môi dưới 2 thùy. Tràng có ống ít nhiều thò khỏi đài, 2 môi: môi trên 2

Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế [9, 13, 15, 32].
S. miltiorrhiza được phân bố rộng rãi ở miền Bắc Trung Quốc. Nó cũng có
mặt tại Nhật Bản [21]. Cây Đan sâm Việt Nam có nguồn gốc Trung Quốc [7] thích
hợp với đất cát ẩm, được trồng bằng rễ vào mùa xuân [6]. Cây trồng ở trại thuốc Sa
Pa (Viện Dược liệu) tỏ ra thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao.
Cây sinh trưởng phát triển tương đối tốt, ra hoa quả hàng năm, hạt giống thu được 4
đã gieo đi gieo lại nhiều năm. Một số cây đưa xuống trại thuốc Tam Đảo (Viện
Dược liệu) sinh trưởng kém hơn [7]. Cây trồng tốt nhất vào tháng 2-3 để đến tháng
11-12 thu hoạch [7]. Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo), mùa quả tháng 6-9 [8]. Thu
hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [6].
1.3. Thành phần hóa học của chi Salvia L.
Cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học
của các loài thuộc chi Salvia L. Thành phần hóa học chính trong chi Salvia L. là
acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và một số thành phần khác. Bộ phận trên mặt
đất của những loài này có chứa flavonoid, triterpenoid và monoterpenoid đặc biệt là
trong hoa và lá. Trong khi đó, diterpenoid và acid phenolic lại được tìm thấy chủ
yếu ở rễ [22].
1.3.1.

Diterpenoid
Diterpenoid là nhóm thường xuyên có mặt ở chi Salvia L. bao gồm rất nhiều
chất có cấu trúc khác nhau được phân thành 4 phân nhóm là abietane diterpenoid,
clerodane diterpenoid, pimarane diterpenoid và labdane diterpenoid. Ngoại trừ các
loài Salvia L. ở Mỹ có chứa thành phần clerodane diterpenoid ở bộ phận trên mặt
đất, các loài còn lại có chứa chủ yếu là loài abietane diterpenoid ở trong rễ,
clerodane diterpenoid và labdane diterpenoid thì ít hơn [21].
Thành phần chính trong nhóm abietane diterpenoid là các tanshinone như

Hình 1.3. Cấu trúc một số chất thuộc nhóm labdane và pimarane diterpenoid
1.3.2. Các dẫn xuất của Acid phenolic
Các Acid phenolic là thành phần chính trong nhóm chất tan được trong nước
của các loài thuộc chi Salvia L. đặc biệt là trong các loài Salvia L. Trung Quốc.
Thành phần chính của nhóm này là acid rosmarinic và các acid salvianolic từ A- K
[23].
Acid caffeic đóng vai trò trung tâm trong tác dụng sinh hóa của họ Lamiaceae,
trong đó dạng dimer là quan trọng nhất như acid rosmarinic. Acid caffeic bao gồm 5
loại:
- Acid caffeic monomer: là thành phần thường xuyên có mặt trong chi Salvia L.
và đại diện là acid caffeic và acid 3-(3,4-dihydroxyphenyl) lactic. Sau đó phải
kể đến danshensu, acid isoferulic và nhiều chất khác nữa. 7
- Acid caffeic dimer: thành phần quan trọng nhất là acid rosmarinic. Ngoài ra còn
có acid przewalskinic A, acid salvianolic B, F, G.
- Acid caffeic trimer: bao gồm acid lithospermic, acid Salvianolic I, K, H và
nhiều chất khác nữa.
- Acid caffeic tetramer: điển hình là 3 methyl ester của acid lithospermic B có tên
là 9’- và 9’’’- monomethyl lithospermate B và dimethyl lithospermate B [23].
- Các acid oligomer caffeic cao hơn: ví dụ có acid yunnaneic A và B được tìm
thấy trong S. yunnanesis là acid caffeic hexamer.
Ngoài thành phần chính là các acid ceffeic, nhóm polyphenol còn bao gồm các
phenolic glycosid. Thành phần này có mặt không phổ biến ở trong chi Salvia L.
Một số chất thuộc nhóm này từ S. officinalis là 6-O-feruloyl-α- và β-glucose; 1-O-
(2,3,4-trihydroxy-3-methyl)butyl-6-O-feruloylglucoside; 6-O-caffeoyl-1-O-
fructosyl-α-glucoside; 1-O-caffeoyl-6-O-apiosylglucoside và 1-O-ρ-
hydroxybenzoyl-6-O-apiosylglucoside. Từ S. prionitis có prionitisides A và B [23].
1.3.3. Flavonoid

tanshinon IIA và cryptotanshinone. Tỉ lệ các tanshinon quinon là tanshinone I từ
0,12-0,32%, tanshinone IIA từ 0,02-0,32%, methylen tanshinquinon là 0,05-
0,15%. 9
- Các thành phần khác: β- sitosterol, tanin, vitamin E. Ngoài ra còn có thành phần
là polysaccarid [31].
1.4. Tác dụng sinh học của chi Salvia L.
Các dẫn xuất của acid caffeic và các diterpenoid là thành phần có mặt chủ
yếu trong các loài thuộc chi Salvia L. đều có hoạt tính sinh học. Các dẫn xuất của
acid caffeic có hoạt tính sinh học quan trọng là chống oxi hóa, chống đông máu,
chống thiếu máu cục bộ và tái tưới máu, chống tăng huyết áp, chống xơ hóa, kháng
virus và có tác dụng ức chế ung bướu. Diterpenoid có nhiều hoạt tính sinh học khác
nhau, bao gồm: chống oxy hóa, chống kết tập tiểu cầu, , làm tăng lưu lượng máu
mạch vành, bảo vệ cơ tim trong thiếu máu cục bộ, chống vi khuẩn, ức chế ung
bướu, chống ung thư [22].
Chi Salvia L. được sử dụng cho hơn 60 bệnh khác nhau từ đau nhức cho đến
động kinh và chủ yếu được dùng để điều trị cảm lạnh, viêm phế quản, bệnh xuất
huyết và rối loạn kinh nguyệt [22].
Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài Salvia
miltiorrhiza Bunge. Các tác dụng đã được chứng minh bao gồm:
- Làm giãn mạch vành, chống huyết khối, chống thiếu máu cục bộ. Các tác dụng
này do các thành phần tanshinone IIA, acid rosmarinic, danshensuan B, acid
salvinolic B, militrone và salvinone. Ngoài ra, Đan sâm còn được chứng minh
có tác dụng chống đau thắt ngực [7, 12, 16, 18, 21,

32].
- Tác dụng làm hạ đường huyết do có chứa thành phần là acid polyphenolic [18].
- Rễ đan sâm có tác dụng hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở tế bào

kinh, bế kinh, sau khi đẻ huyết ứ đọng gây đau bụng; các trường hợp do chấn
thương mà cơ gân sưng tấy đau đớn [5]. 11
- Dưỡng tâm an thần: dùng trong các bệnh tâm hồi hộp, mất ngủ, suy nhược thần
kinh; dùng trong bệnh co thắt động mạch vành tim, phối hợp với đương quy, táo
nhân [5, 7] .Ngoài ra còn dùng để chữa bệnh nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực,
tâm hư phiền nhiệt [21].
- Bổ huyết: có thể dùng đối với các bệnh thiếu máu, đặc biệt đối với các bệnh mặt
nhợt nhạt, xanh xao của phụ nữ chưa có chồng. Khi dùng với tính chất bổ huyết
thì dùng đan sâm dạng không qua chế biến [4, 5].
- Bổ can tỳ: dùng trong các trường hợp gan và lá lách bị sưng to, trị bệnh huyết
hấp trùng đều có hiệu quả [4, 5].
- Giải độc: dùng trong các trường hợp sang lở, mụn nhọt [5].
- Đây còn được xem là thuốc dùng tốt cho trường hợp đau dạ dày hay viêm vú [7,
21].
- Đan sâm còn được dùng để điều trị các bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận mạn
tính, tiểu đường và các biến chứng của tiểu đường [18].
Liều dùng: 8-20g [5].
Chú ý: không dùng chung với Lê lô [3].
12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị

- Máy Agilent 1200 HPLC- MS để đo phổ khối lượng.
- Máy JEOL ECX 400 NMR Spectrometer để đo phổ cộng hưởng hạt nhân.
- Hệ thống máy chấm sắc ký: thiết bị bơm mẫu tự động (CAMAG- LINOMAT5,
buồng chụp ảnh (CAMAG), bình triển khai sắc ký, bình phun sắc ký, máy tính với
phần mềm hỗ trợ Wincats và Video Scan.
- Pipet, ống nghiệm, bình nón, bình chiết…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong rễ đan sâm
2.2.1.1. Định tính bằng phương pháp hóa học 14
Chiết xuất lấy dịch chiết bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau
(nước, ethanol, ether) để định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học [1, 2].
2.2.1.2. Định tính bằng SKLM
Định tính các nhóm chất bằng phương pháp SKLM: Tiến hành thăm dò trên
các hệ dung môi để chọn ra các hệ cho kết quả tách tốt nhất.
- Mẫu nghiên cứu: Rễ Đan sâm thu hái tại thị trấn Bắc Hà, huyện Bắc Hà, tỉnh
Lào Cai vào tháng 5/2014.
- Dịch chấm sắc ký: Chuẩn bị dịch chiết toàn phần: Ngâm dược liệu trong MeOH
rồi cô quay chân không lấy cao, thu được dịch chiết tổng. Hòa tan dịch chiết
tổng vào MeOH, sau đó lọc, thu được dịch chấm sắc ký.
- Điều kiện sắc ký
 Pha tĩnh Bản mỏng SKLM Siliga gel GF
254
(Merck), kích thước 3×10 cm,
hoạt hóa ở 110
o
C trong 1 giờ.:
 Pha động: khảo sát các hệ dung môi sau:

2.2.2.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất
Rễ đan sâm sơ chế được ngâm chiết kỹ 3 lần bằng dung môi Ethanol 80% , sử
dụng thiết bị siêu âm ở 40
o
C. Lọc các dịch chiết ethanol qua giấy lọc, gộp dịch lọc
và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết tổng ethanol.
Phân tán cao chiết ethanol này trong nước cất và chiết phân bố bằng n- hexan
và ethyl acetat (3 lần). Các phân đoạn n- hexan, ethyl acetat được cất loại dung môi
dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng.
2.2.2.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp
chất 16
Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây cũng như phân lập các hợp
chất, các phương pháp sắc ký đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để
khảo sát), sắc ký cột (CC), sắc ký pha đảo.
Sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm Kieselgel
60 F
254
(Merck 1,05715), RP
18
F
254s
(Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai
bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H
2
SO
4
10% được

MSD ((Electrospray ionization source-ESI) của Khoa dược, Đại học Quốc tế
Nagasaki, Nhật Bản.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên
máy JEOL ECX 400 NMR Spectrometer của khoa Dược, Đại học Quốc tế
Nagasaki, Nhật Bản).