BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI


PHẠM HẢI HOA
CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ
HỢP CHẤT TỪ MỘT LOÀI
GIẢO CỔ LAM THU HÁI TẠI YÊN BÁI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
HÀ NỘI - 2015BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM HẢI HOA CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ
HỢP CHẤT TỪ MỘT LOÀI
GIẢO CỔ LAM THU HÁI TẠI YÊN BÁI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớng dẫn:
ThS. Thân Thị Kiều My
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược liệu


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 2
1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma 2
1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 2
1.2.1. Đặc điểm thực vật chi Gynostemma 2
1.2.2. Phân bố chi Gynostemma 3
1.2.3. Đặc điểm thực vật và phân bố một số loài trong chi Gynostemma tại
Việt Nam 3
1.3. Thành phần hóa học 6
1.3.1. Nghiên cứu về saponin 6
1.3.2. Nghiên cứu về flavonoid 10
1.3.3. Một số thành phần hóa học khác. 10
1.4. Tác dụng dƣợc lý 10
1.5. Độc tính 12
1.6. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học chi Gynostemma tại
Việt Nam. 13
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 16
2.1.1. Nguyên liệu 16
2.1.2. Thuốc thử, dung môi, hóa chất 17
2.1.3. Dụng cụ 17
2.1.4. Phương tiện và máy móc 17
2.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 17
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19
3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong lá, thân Giảo cổ lam
nghiên cứu 19

3.2. Chiết xuất phân đoạn các nhóm chất 21
3.2.1. Định lượng cắn các phân đoạn 23
3.2.2. Định tính cắn các phân đoạn 23

13
C – NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon
Dc Dịch chiết
DEPT Distortionless Enhancenment by Polarisation Tranfer
EtOAC Ethylacetat
EtOH Ethanol
G. Gynostemma
Glu Glucose
Rham Rhamnose
Xyl Xylose
1
H – NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
HPLC High-performance liquid chromatography
HPLC – MS Liquid chromatography–mass spectrometry
MeOH Methanol
MS Mass spectrometry
n-BuOH n-butanol
NXB Nhà xuất bản
STT Số thứ tự

TB Trung bình
TT Thuốc thử
Vanilin/ H
2
SO
4
Dung dịch vanilin 1% trong acid sulfuric 10%
UV Ánh sáng tử ngoại
UV
254

Kết quả định lượng saponin và flavonoid toàn phần trong
lá và thân G.pentaphyllum ở Cao Bằng và Hòa Bình
13
Bảng 1.3
Kết quả định lượng các phân đoạn trong lá và thân Giảo
cổ lam ở Sapa, Hòa Bình
14
Bảng 3.1
Kết quả định tính các nhóm chất trong lá và thân Giảo cổ
lam thu hái tại Yên Bái
19
Bảng 3.2
Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết lá và thân cây Giảo
cổ lam nghiên cứu
23
Bảng 3.3
Kết quả định tính cắn các phân đoạn
24
Bảng 3.4
Giá trị Rf và màu sắc của các vết quan sát được trên sắc
kí đồ cắn phân đoạn EtOAc .
25
Bảng 3.5
Số liệu phổ NMR của V1
34
Bảng 3.6
Số liệu phổ NMR của V2 và số liệu phổ của (22E)-
Stigmasta-5,2-dien-3yl-hexopyranoside đã công bố
36
Bảng 3.7

Hình 2.1
Ảnh của GS. Phạm Thanh Kỳ về Giảo cổ lam thu hái tại
Yên Bái
16
Hình 3.1
Quy trình chiết các phân đoạn trong lá, thân của cây
Giảo cổ lam tại Yên Bái.
22
Hình 3.2
Sắc kí đồ cắn phân đoạn EtOAc khai triển với hệ dung
môi CHCl
3
-MeOH-HCOOH (3 : 0,4 : 0,2)
25
Hình 3.3
Sắc kí đồ cắn phân đoạn P2 khi quan sát dưới UV
254
và
sau khi hiện màu bằng TT vanillin/H
2
SO
4.
28
Hình 3.4
Sắc kí đồ cắn phân đoạn P3 sau khi hiện màu bằng TT
vanillin/H
2
SO
4.



1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Giảo cổ lam là tên thường gọi của một số loài trong chi Gynostemma, họ bầu
bí - Cucurbitaceae. Đây là một dược liệu quý có nhóm hoạt chất chính là saponin và
flavonoid [44] với nhiều tác dụng nổi bật như làm hạ lipid máu [44], làm hạ đường
huyết [40], chống oxy hóa, bảo vệ gan [20], ức chế một số dòng tế bào ung thư [33],
[39], [51], Hiện nay, các sản phẩm từ Giảo cổ lam đang trở nên ngày càng phổ
biến và được nhiều người sử dụng.
Để có cơ sở cho việc sử dụng dược liệu Giảo cổ lam, năm 1997, Giảo cổ lam
lần đầu được nghiên cứu tại Việt Nam bởi nhóm nghiên cứu của GS.TS Phạm
Thanh Kỳ. Từ đó đến nay đã có thêm nhiều loài Giảo cổ lam được phát hiện. Song
song với đó là các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học đã và
đang được tiến hành để góp phần tiêu chuẩn hóa, kiểm nghiệm dược liệu cũng như
chứng minh các tác dụng sinh học của dược liệu trên lâm sàng .
Năm 2014, GS.TS Phạm Thanh Kỳ đã thu mẫu Giảo cổ lam tại Yên Bái để
tiếp tục nghiên cứu. Qua khảo sát sơ bộ, chúng tôi dự đoán đây là một thứ mới của
Gynostemma pentaphyllum (Thumb.) Makino. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài :
“Chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ một loài Giảo cổ lam thu hái tại Yên
Bái” với 3 mục tiêu:
1. Xác định các nhóm chất hữu cơ chính có trong mẫu nghiên cứu.
2. Chiết xuất, xác định hàm lượng cắn các phân đoạn chiết từ lá và thân cây
Giảo cổ lam nghiên cứu.
3. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được.
2


Hoa cái: Đài và tràng giống hoa đực. Nhụy 1 hoặc 2, bầu hình cầu nhỏ, 2-
5 ngăn, thường 3 ngăn, ít khi 2,4,5, đầu nhụy chia 2-3 đầu nhọn.
Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở. Quả có 2-3 hạt hình trứng, hơi
dẹt 2 bên hoặt có 3 góc. Hạt sần sùi [5], [24].
1.2.2. Phân bố chi Gynostemma
Chi Gynostemma chủ yếu được phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á và Đông
Nam Á, từ dãy Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và đảo New Guinea. Các loài
thuộc chi Gynostemma hầu hết sống ở miền tây nam Trung Quốc (Phía nam tỉnh
Thiểm Tây và nam lưu vực sông Trường Giang) [21], [24].
Hiện nay, trên thế giới đã nhận dạng 21 loài thuộc chi Gynostemma [25].
Ở Trung Quốc đã ghi nhận được 14 loài (với 9 loài đặc hữu) [24]. Tại Việt Nam đã
công bố 4 loài thuộc chi Gynostemma là G. pentaphyllum (Thumb.) Makino, G.
laxum (Wall.) Cogn [4], [5], G. longipes C.Y.WU [12], [17], G.pedeta Blume [6].
1.2.3. Đặc điểm thực vật và phân bố một số loài trong chi Gynostemma tại Việt
Nam
1.2.3.1. Gynostemma pentaphyllum (Thumb.) Makino
Tên gọi khác: Cổ yếm, giảo cổ lam, thất diệp đởm [5]
Đặc điểm thực vật:
Cây thảo mọc leo yếu, không lông hoặc lông thưa thớt ở mấu.
Lá kép có cuống chung dài 3-4cm; phiến do 5-7 lá chét với mép có răng
dài 3-9cm, rộng 1,5- 3cm. Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh [5], [6], [24].
Cụm hoa đực dạng chùm kép. Hoa có cuống mảnh cỡ 1-4mm, ống đài rất
ngắn, thùy đài hình tam giác, dài khoảng 0,7mm, đỉnh nhọn, thùy tràng hình bầu
dục hoặc mũi mác, đỉnh nhọn có một gân, nhị 5, bao phấn đính thành đĩa.
Cụm hoa cái dạng chùy ngắn hơn hoa đực. Hoa có đài và tràng giống hoa
đực, bầu hình cầu 2-3 ô, vòi nhụy 3, ngắn [24].
Quả khô, tròn, đường kính 5-9mm, khi chín màu đen. Hạt 2-3, treo, hình
trứng hoặc hình tim, đường kính 4mm, màu nâu [5], [24].
4


Hoa đơn tính khác gốc. Cụm hoa đực kép 3 lần chùm, mảnh. Hoa đực rất
nhỏ, màu trắng. Đài 5, rời, hình tam giác. Tràng 5, rời, hình tam giác. Nhị 5, chỉ nhị
đính thành 1 cột ở trung tâm, hình sao, bao phấn 2 ô. Cụm hoa cái kép 3 lần chùm.
Hoa cái có cuống dài 1,8 - 2,0mm. Đài và tràng giống hoa đực. Bộ nhụy cấu tạo bởi
3 lá noãn hàn liền, 2 - 3 vòi nhụy mập, rời, núm nhụy chia 2 - 3, bầu giữa, 3 ô, mỗi
ô có 1 hạt.
Quả mọng, khi chín màu xanh, đường kính 6 - 7mm, cuống quả dài 8 -
15mm.
Hạt hình tim, rộng 3 - 4mm, màu xám nhạt, viền hạt có răng cưa.
Mùa hoa tháng 8 - 10, mùa quả vào tháng 11 - 12 [17], [24], [27].
Phân bố: Độ cao khoảng 1400 - 3200m so với mặt nước biển [24]. Tại
Việt Nam, cây phân bố tại Hòa Bình, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng [27].
1.2.3.4. Gynostemma pedeta Blume
Đặc điểm thực vật:
Cây thảo, mảnh, nhẵn. Thân không tròn có góc cạnh, bề mặt nhăn.
Lá hình chân vịt kép, cuống dài 3 - 4cm, có 5 - 7 lá chét. Lá chét dài 35 -
60mm, rộng 15 - 25mm hình oval, đầu trên và gốc lá tù hoặc nhọn, có răng cưa, có
7 cặp gân lá. Tua cuốn đôi hoặc chẻ đôi, mảnh.
Cụm hoa đực ở nách lá, hình chùy mảnh, dài 11 – 16cm. Hoa nhỏ, nụ
hình cầu, khi nở hình sao cuống dài 2mm. Đài dạng ống, phiến đài hình tam giác,
dài 0,7mm. Tràng 5, hình oval dài 2mm. Nhị 1 bó, chỉ nhị hàn liền; bao phấn 5, có 1
ô. Hoa cái dạng chùy ngắn hơn hoa đực, đài và tràng như hoa đực. Nhụy bầu dưới,
hình cầu thóp ở đỉnh, 2 - 3 ngăn, 2 - 3 noãn treo trên, 2 - 3 vòi nhụy ngắn.
Quả gần như nang, không mở, hình cầu 5 - 6 mm, màu lục đen khi chín.
Hạt treo, hình tim dẹt 2 bên dài 4mm.
Phân bố: Tại Việt Nam, cây mọc ở Ba Vì, Lạng Sơn, Sa Pa, Hà Nội,
Ninh Bình, Hòa Bình [2], [6].
1.3. Thành phần hóa học
6


7

Rf. Những ginsenosid này chiếm 25% lượng gynosaponin toàn phần trong cây và
cũng là ví dụ đầu tiên về ginsenosid được tìm thấy ngoài họ Araliaceae [36].

Cấu trúc saponin trong G.pentaphyllum (thumb.) Makino được trình bày qua
hình 1.2, 1.3 và bảng 1.1 như sau:

OH
CH
2
O-glu
O
R
1
29
28
R
2
R
3
18
R
4
R
7
R
5
R
6

8

Bảng 1.1. Saponin thƣờng gặp trong G.pentaphyllum (Thumb.) Makino

Các nhóm thế
Ví dụ
R1
Đường glu., rham., xyl., có
thể 1 hoặc 2, 3 đường kết hợp
với nhau

R2
- H
- OH
Gypenosid I, Rb
1
Gynos TN1, gynos TN2
R3
-CH
3

-CH
2
OH
-CHO
Gypenosid I, Rb
1


Rb
1

R7
Có thể là a, b, c, d, e, f, g, h
hoặc i
Các ginsenosid đều có cấu trúc
a

Loại đường chính trong gypenosid (hầu hết là loại pyranose) là b-D-glucose,
b-D-xylose, a-L-arabinose và a-L-rhamnose nối ở C-3 và C-20. Nhóm chức tiêu
biểu là hydroxyl, methyl, aldehyd, alcol và ít phổ biến nhất là ceton nối vào C-19.
Một nhóm hydroxyl cũng có thể được đính vào C-2 và C-12 [44].
9

Các saponin dạng ocotillon có cầu nối epoxy tại vị trí C-17 cũng được phát
hiện với cấu trúc 3β, 12β, 23S, 24R- tetrahydroxy-20S, 25-epoxydammaran và
(20S, 24S)- 20, 24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [36].
O
OR
1
29
28
R
2
R
3
18
30

Gynostemma nhưng ít được nghiên cứu hơn saponin.
- Đã xác định được trong G.pentaphyllum có ombuin, ombuoside, rutin [26],
quercetin-di-(rhammo)-hexosid, quercetin-rhammo-hexosid, kaempferol- rhammo-
hexosid và kaempferol-3-O-rutinosid [30].
- Phương pháp chiết xuất flavonoid tối ưu là sử dụng phương pháp chiết hồi
lưu với dung môi ethanol 70% ở nhiệt độ 90 °C [41].
1.3.3. Một số thành phần hóa học khác
- Sterol: được xác định có mặt trong G. pentaphyllum và chiếm một lượng
nhỏ (khoảng 0,0001%) bao gồm ergostanol, sitosterol, stigmasterol [31], [44].
- Carotenoid: năm 2004, H. L. Liu và các cộng sự đã xác định 25 carotenoid
có mặt trong G.pentaphyllum bằng phương pháp HPLC, trong đó nhiều nhất là
trans- Lutein, kế đến là cis- Lutein [35].
- Polysaccharid: Đã phân lập được 1 heteropolysaccharid phi tinh bột điển
hình với thành phần chính là glucose (23,2%), tiếp theo là galactose (18,9%),
arabinose (10,5%), rhamnose (7,7%), acid galacturonic (4,7%), xylose (3,9%),
mannose (3,1%) và acid glucuronic(1,2%), [48].
- Chlorophyll và dẫn chất: bằng phương pháp HPLC-MS, đã tách và xác
định được trong G.pentaphyllum có 15 chlorophyll và dẫn chất [28].
- Alcaloid: được báo cáo là không có mặt trong G. pentaphyllum [19].
1.4. Tác dụng dƣợc lý
Các tác dụng của Gynostemma được cho là có được bởi saponin và
flavonoid, đặc biệt là saponin, thành phần này đã trở thành mục tiêu nghiên cứu của
các nhà nghiên cứu dược học tại Trung Quốc [44]. Trong các loài thuộc chi
11

Gynostemma được nghiên cứu, G.pentaphyllum là loài được nghiên cứu và công bố
nhiều nhất với các tác dụng dược lý đáng chú ý như sau:
1.4.1. Tác dụng hạ lipid máu
Tác dụng của gypenosid trên sự chuyển hóa lipid đã được nghiên cứu rộng
rãi trên cả người và động vật. Các kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng dịch chiết

loại nóng [44].
Với não chuột cống bị tổn thương do thiếu máu, gypenosid liều
100mg/kg hạn chế rõ rệt sự phá hủy AND và ARN [52].
1.4.5. Ảnh hưởng tới chức năng miễn dịch
Các gypenosid đưa vào dạ dày chuột nhắt liều 300mg/kg trong 7 ngày
gây tăng chức năng thực bào ở đại thực bào, tăng thành phần có hoạt tính trong
huyết thanh và giảm lượng kháng thể tiêu huyết. Lượng IgG huyết thanh tăng và
tăng thời gian sống sót của chuột được ghép cơ tim [44].
1.4.6. Tác dụng tới các tế bào ung thư
Một số hợp chất tinh khiết phân lập được từ G. pentaphyllum có tác dụng
gây độc tính với các dòng tế bào ung thư invitro: SGC-7901 (dạ dày), BEL-7402
(gan) [51], A549 (phổi) [33], [46], HT-29 (ruột kết) [39], [48], MCF-7 (ung thư
vú), SK-OV-3 (ung thư buồng trứng) [33],
Các gypenosid cũng ngăn chặn tác nhân gây đột biến cyclosphosphamid
ở chuột nhắt và đẩy mạnh quá trình hồi phục ADN [37].
1.4.7. Một số tác dụng bảo vệ khác
Gynostemma có một số tác dụng khác đã được nghiên cứu như: chống oxy
hóa, chống sốt, an thần, giảm đau, chống loét dạ dày [44],
1.5. Độc tính
13

Đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng việc sử dụng Gynostemma pentaphyllum
(Thumb.) Makino là khá an toàn và không có tác dụng phụ, không độc tính [20],
[22], [53].
1.6. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học chi Gynostemma tại Việt Nam
Tại Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về chi Gynostemma về sinh
học, thành phần hóa học và tác dụng. Trong đó, nhiều nhất là các nghiên cứu về
thành phần hóa học.
1.6.1. Định tính
Bằng các phản ứng hóa học đã xác định trong G.pentaphyllum và G.longipes
14

Bảng 1.3. Kết quả định lƣợng các phân đoạn trong lá và thân Giảo cổ lam ở
Sapa [2], Hòa Bình [13], [17]

Cắn n-hexan
Cắn CHCl
3
Cắn EtOAc
Cắn n-BuOH
Lá
Thân
Lá
Thân
Lá
Thân
Lá
Thân
Mọc hoang/Sapa
(%)
1,54
1,15
2,76
3,93
1,52
0,43
5,30
1,14

[14].
- Tinh chế saponin từ dịch chiết:
Saponin là nhóm chất được quan tâm nhiều nhất trong Giảo cổ lam, đã có
một số phương pháp nghiên cứu về việc loại tạp, tinh chế saponin như sau:
Phương pháp 1: Loại tạp bằng EtOH tuyệt đối, saponin từ dịch lọc được tinh
chế bằng phương pháp kết tủa trong aceton. Phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có
thể triển khai trên quy mô công nghiệp [14].
15

Phương pháp 2: Tinh chế saponin từ dịch chiết bằng phương pháp chiết lỏng-
rắn sử dụng nhựa hấp phụ D101, rửa giải bằng EtOH 80%. Đây là phương pháp có
quy trình đơn giản, dễ thực hiện, sử dụng dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, không độc hại,
loại được nhiều tạp mà không làm hao hụt saponin [16].
Phương pháp 3: Tinh chế saponin bằng phương pháp chiết lỏng - rắn sử dụng
nhựa hấp phụ Diaion HP-20, rửa giải bằng H
2
O và MeOH 20% để loại tạp và rửa
giải trong khoảng nồng độ MeOH từ 50-80% để thu saponin. Phương pháp loại
được hết chlorophyll và phần lớn flavonoid [15].
1.6.4. Phân lập
- Flavonoid
Đã phân lập được quercetin, rutin [1], ombuin, ombuosid, rhamnazin, 5,6-
dimethoxi-7,3’,4’-trahydroxyflavon; 3,3’,4’,5,7- pentahydroxyflavon [2].
- Saponin
GS.TS. Phạm Thanh Kỳ và cộng sự đã phân lập được 7 saponin mới có cấu
trúc dammaran từ G.pentaphyllum là: gypenosid VN1 (C
59
H
100
O

78
O
18
), gypenosid VN7
(C
47
H
78
O
18
) [33].
Từ loài G.longipes, năm 2010, Phan Thị Thảo đã phân lập được 1 saponin
mới vinagynostesid A [17].
- Acid hữu cơ
Acid benzoic và 4-hydroxy-3-methoxy benzoic acid (acid vanillic) [2]. 16

CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
- Nguyên liệu nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Giảo cổ lam mọc hoang
được GS.TS. Phạm Thanh Kỳ thu hái vào năm 2014 tại Yên Bái. Dược liệu sau khi
thu hái được phơi ở nơi thoáng mát, sấy ở nhiệt độ 50-60°C trong tủ sấy Shellab có
quạt thông gió. Dược liệu sau khi sấy khô được bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát.