BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HƢƠNG

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG
ỨC CHẾ ALPHA GLUCOSIDASE CỦA
4 LOÀI THUỘC CHI GYMENMA R.BR. Ở
VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ
ALPHA GLUCOSIDASE CỦA 4 LOÀI


Sinh Viên
Nguyễn Thị Hương

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ… 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Đái tháo đường ( Diabetes Melitus) 3
1.1.1. Định nghĩa 3
1.1.2. Phân loại 3
1.1.3. Dịch tễ 4
1.1.4. Các thuốc điều trị đái tháo đường. 6
1.2. Enzym alpha-glucosidase 8
1.2.1. Sơ lược về enzym alpha-glucosidase 8
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt động của enzym alpha glucosidase. 10
1.2.3. Các chất ức chế enzym alpha-glucosidase 11
1.3. Chi Gymnema R.Br. 13
1.3.1. Vị trí, phân loại 13
1.3.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 14
1.3.3. Thành phần hóa học 15
1.3.4. Tác dụng dược lí 17
1.3.5. Các nghiên cứu đã được tiến hành ở Việt Nam về chi Gymnema 19
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 21
2.1.1. Nguyên liệu 21
2.1.2. Hóa chất 22
2.1.3. Thiết bị 23

ADA American Diabetes Association - Hiệp hội đái tháo đường Hoa Kỳ
BCRP Breast Cancer Resistance Protein–Protein kháng thuốc điều trị ung
thư vú
CVD Cardivascular Disease – Bệnh tim mạch
CKD Chronic Kidney Disease – Bệnh thận mạn
ĐTĐ Đái tháo đường
GDM Gestational Diabetes Mellitus – Đái tháo đường thai kì
GLP-1 Glucagon like peptid 1
HbA1C Hemoglobin A1C
HDL High Density Lipoprotein – Lipoprotein tỉ trọng cao
IDF International Diabetes Federation – Liên đoàn đái tháo đường thế giới
INSR Insulin Receptor
LDL Low Density Lipoprotein – Lipoprotein tỉ trọng thấp
MeOH Methanol
MODY Maturity Onset Diabetes of the young – Đái tháo đường khởi phát trên
bệnh nhân trẻ tuổi
pNPG Para – nitrophenyl – α – D - Glucopyranosid
STZ Streptozotocin
SGLT2 Sodium glucose cotransporter 2
WHO World Health Organization – Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Các thuốc điều trị đái tháo đường……………………………………6
Bảng 1.2 Một số hợp chất có hoạt tính ức chế alpha glucosidase được cô lập từ
thiên nhiên………………………………………………………….12
Bảng 1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố của 4 loài thuộc chi Gymenma ở Việt
Nam…………………………………………………………………14
Bảng 2.1 Kí hiệu các mẫu dịch chiết dược liệu trong nghiên cứu…………….21
Bảng 2.2 Thể tích các hóa chất trong quy trình thử hoạt tính…………………28
Bảng 3.1 Hoạt tính ức chế alpha glucosidase của acarbose ở các nồng độ khác

Hình 3.5 Hoạt tính ức chế alphaglucosidase của các mẫu Gymnema latifolium
Wall. ex Wight…………………………………………………… 36
Hình 3.6 Hoạt tính ức chế alpha glucosidase của các mẫu Gymnema inodorum
(Lour.) Decne Wight……………………………………………… 38
Hình 3.7 IC
50
của các dược liệu và Acarbose…………………………………39
Hình P.1 Đặc điểm hình thái loài Gymnema Sylvestre (Retz.) R. Br. Ex Schult
Hình P.2 Đặc điểm hình thái loài Gymnema inodorum (Lour.) Dence Wight
Hình P.3 Đặc điểm hình thái loài Gymnema Latifolium Wall. ex Wight
Hình P.4 Đặc điểm hình thái loài Gymnema yunnanense Tsiang
Sơ đồ 2.1 Nội dung nghiên cứu 23

Sơ đồ 2.2 Quy trình thí nghiệm khảo sát động học enzyme………………….26
Sơ đồ 2.3 Quy trình đánh giá tác dụng ức chế alpha glucosidase của
Acarbose……………………………………………………………27
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
“Thế kỉ 21 là thế kỉ của các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa” – đó là
những dự báo của các chuyên gia y tế từ những thập niên 90 của thế kỷ XX. Dự báo
này đã và đang trở thành hiện thực. Theo ước tính của liên đoàn đái tháo đường
quốc tế (IDF), năm 2013 số bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) là 382 triệu
người và gây ra tổng thiệt hại lên đến 548 tỉ USD [36]. Đáng chú ý là có tới 80%
bệnh nhân ĐTĐ đang sống ở các quốc gia có thu nhập bình quân trung bình hoặc
thấp. Bệnh nhân đái tháo đường cần được điều trị suốt đời, trong khi đó các thuốc
điều trị ĐTĐ hiện nay đều có giá thành cao và nhiều tác dụng phụ gây ra nhiều khó
khăn trong quá trình điều trị và chăm sóc bệnh nhân. Do đó, việc tìm ra các thuốc
mới có hiệu quả cao, ít tác dụng phụ và giá thành hợp lí đang là vấn đề cấp thiết, thu
hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Có nhiều hướng

trên mô hình in vitro.
2. Xác định IC
50
của các mẫu dược liệu tiềm năng. 3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đái tháo đƣờng ( Diabetes Melitus)
1.1.1. Định nghĩa
Theo hiệp hội đái tháo đường Mỹ (American Diabetes Association-ADA)
[20]: “ĐTĐ là một nhóm bệnh chuyển hóa, có đặc điểm là tăng glucose máu, là hậu
quả của sự thiếu hụt insulin hoặc khiếm khuyết trong các hoạt động của insulin hoặc
cả hai. Tăng glucose máu mạn tính thường dẫn đến sự hủy hoại, rối loạn chức năng
và suy yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt là mắt, thận, tim và mạch máu”.
1.1.2. Phân loại
Theo ADA, đái tháo đường được chia thành 4 loại chính [20]:
 ĐTĐ týp 1:
 ĐTĐ týp 1 qua trung gian miễn dịch: trước đây còn gọi là ĐTĐ phụ thuộc
insulin. Chiếm khoảng 5-10% tổng số bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ. Nguyên
nhân là do sự phá hủy tế bào β tự miễn qua trung gian tế bào, thường dẫn đến
thiếu hụt insulin tuyệt đối.
 ĐTĐ týp 1 vô căn: Một số dạng ĐTĐ týp 1 không rõ nguyên nhân. Bệnh
nhân có insulin thấp trường diễn và có nguy cơ nhiễm toan ceton nhưng
không có bằng chứng về sự tự miễn.
 ĐTĐ týp 2: Trước đây còn được gọi là ĐTĐ không phụ thuộc insulin. Chiếm
khoảng 90-95% tổng số bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ. Nguyên nhân là do thiếu
hụt insulin tương đối trên nền kháng insulin.
 ĐTĐ thai kì (GDM): ĐTĐ thai kì được định nghĩa là bất cứ rối loạn dung

Theo ước tính của liên đoàn đái tháo đường quốc tế (IDF), năm 2013 có
khoảng 382 triệu người lớn bị ĐTĐ và con số này sẽ tiếp tục tăng 55% và chạm
mốc 592 triệu người trong vòng 25 năm tới [36]. Tỉ lệ mắc ĐTĐ khác nhau ở các
châu lục và các vùng lãnh thổ. Bờ tây Thái Bình Dương là khu vực có nhiều bệnh
nhân ĐTĐ hơn khu vực khác. Châu Phi là khu vực có số lượng bệnh nhân ĐTĐ
thấp nhất. Trung Quốc đứng đầu về số bệnh nhân ĐTĐ (20-79 tuổi) với 98,4 triệu
người, tiếp sau đó là Ấn Độ và Mỹ với 65,1 và 24,4 triệu người. Năm 2013, ĐTĐ
đã cướp đi sinh mạng của 5,1 triệu người trên thế giới và theo ước tính cứ mỗi 6
giây có 1 người chết do ĐTĐ [36].
Đái tháo đường gây ra gánh nặng khổng lồ về chi phí điều trị cho người
bệnh, tạo ra áp lực to lớn đối với nền y tế các nước. Theo thống kê của IDF, ước
tính tổng chi phí cho ĐTĐ trên toàn thế giới là 548 tỉ USD vào năm 2013 và dự
kiến tăng lên 627 tỉ vào năm 2035 [36].
Ở Việt Nam, các nghiên cứu có quy mô lớn về dịch tễ ĐTĐ đã được tiến
hành, cung cấp một cái nhìn cụ thể hơn về tình hình ĐTĐ ở nước ta. Năm 2001,
điều tra dịch tễ học bệnh ĐTĐ theo tiêu chuẩn quốc tế mới với sự giúp đỡ của các
chuyên gia hàng đầu của WHO, được tiến hành ở 4 thành phố lớn: Hà Nội, Hải
Phòng, Đà Nẵng, Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ tại 4 thành phố này ở
6

đối tượng lứa tuổi 30-64 tuổi là 4,9%, tỉ lệ rối loạn dung nạp glucose máu là 5,9%
[3]. Năm 2013, trong kết quả công bố của “Dự án phòng chống Đái tháo đường
Quốc gia” do Bệnh viện Nội tiết Trung ương thực hiện trên 11.000 người tuổi 30-69
tại 6 vùng gồm: Miền núi phía Bắc, Đồng bằng sông Hồng, Duyên hải miền Trung,
Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Tây Nam Bộ đã cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ cao
nhất ở Tây Nam Bộ là 7,2%, thấp nhất ở khu vực Tây Nguyên 3,8% [1].
Cho đến năm 2013, theo thống kê của liên đoàn đái tháo đường quốc tế, Việt
Nam có khoảng 3,3 triệu người lớn (30-79 tuổi) mắc bệnh ĐTĐ, chiếm khoảng
5,37% tổng dân số, và có khoảng 54.953 người chết liên quan đến ĐTĐ [36].
1.1.4. Các thuốc điều trị đái tháo đƣờng.

Tăng tiết insulin
-Hạ đường huyết
-Tăng cân
-Thiếu máu cơ tim cục bộ
Meglitinid
-Repaglinid
-Nateglinid
Tăng tiết insulin
-Hạ đường huyết
-Tăng cân
-Thiếu máu cơ tim cục bộ
Thiazolidind
ion
-Pioglitazone
-Rosiglitazon
Tăng độ nhạy cảm
của insulin
-Tăng cân
-Suy tim
-Loãng xương
-Tăng LDL
-Tăng nguy cơ nhồi máu
cơ tim.
Các chất ức
chế alpha
glucosidase
-Acarbose
-Miglitol
-Voglibose
Làm chậm quá trình

-Dapagliflozin
-Empagliflozin

-Ngăn cản tái hấp thu
glucose ở thận
-Tăng thải glucose
qua nước tiểu
-Nhiễm khuẩn đường tiết
niệu.
-Đi tiểu nhiều
-Hạ huyết áp
-Mệt mỏi
-Tăng LDL
-Tăng creatinin
Chủ vận
receptor
GLP-1
-Exenatid
-Liraglutid
-Albiglutid
-Dulaglutid

-Tăng tiết insulin (phụ
thuộc glucose)
-Giảm tiết glucagon
(phụ thuộc glucose)
-Chậm làm rỗng dạ
dày
-Tạo cảm giác no
-Buồn nôn,nôn, tiêu chảy

(Rehmania glutinosa), bông ổi (Lantana camara) [12], mướp đắng (Momordica
charantia) [15], ý dĩ (Coix lachryma jobi) [6], bằng lăng nước (Lagerstroemia
speciosa L. Pers. ) [10]
1.2. Enzym alpha-glucosidase
1.2.1. Sơ lƣợc về enzym alpha-glucosidase
1.2.1.1. Danh pháp
Alpha glucosidase (EC.3.2.1.20) có nhiều tên gọi khác nhau như:
Glucoinvertase, glucosidoinvertase, maltase glucoamylase, glucosidosucrase,
nitrophenyl–α–D-glucosidase, transglucosidase, glucosidoinvertase, α-D-
glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, maltase.
1.2.1.2. Phân bố
Alpha-glucosidase (EC.3.2.1.20) có trên màng bản chải ruột non và chiếm
khoảng 2% tổng số protein [68]. Enzym này phân bố trên toàn bộ chiều dài ruột
non, với hoạt tính tăng chậm dần và đạt đỉnh ở hồi tràng [26]. Ngoài ra, alpha
glucosidase còn được tìm thấy ở biểu mô thận [68].
9

1.2.1.3. Cấu trúc
Enzym alpha glucosidase có 2 tiểu phần: tiểu phần N tận và tiểu phần C tận
(hình 1.2) [50]. Cả 2 tiểu đơn vị này đều có trọng lượng phân tử ~100 kDa và thuộc
gia đình GH31 phân nhóm 1 do có chuỗi WiDMNE trong trung tâm xúc tác [44],
[56].

Hình 1.2: Cấu trúc tiểu phần N tận (A) và C tận (B) của phân tử alpha
glucosidase [44], [56]
1.2.1.4. Vai trò
Alpha glucosidase (EC.3.2.1.20) có vai trò xúc tác cho phản ứng
chuyển oligosacarid thành các phân tử đường nhỏ hơn để được hấp thu vào
máu. Cơ chế của nó là cắt đứt liên kết α-D-1,4 glucose đầu không khử.
Cụ thể, khi thức ăn là các carbohydrat được đưa vào cơ thể, dưới tác

Enzym rất nhạy cảm với pH của môi trường, vì vậy pH có tác động rất lớn
tới tốc độ phản ứng enzym. Một sự thay đổi nhỏ so với pH tối ưu cũng dẫn đến sự
giảm hoạt độ enzym do nó làm thay đổi sự ion hóa của nhóm chức trong trung tâm
hoạt động enzym. Vì vậy việc lựa chọn pH tối ưu để thực hiện thực nghiệm rất quan
trọng. Với alpha glucosidase, khoảng pH tối ưu là 6–7 [31], [34],[38],[47],[48],[55].
1.2.2.5. Ion kim loại
Các ion kim loại nặng có thể ức chế enzym alpha glucosidase (Ví dụ:
Hg
2+
,Ag
+
,Zn
2+
,…). Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn ảnh hưởng tới
cả trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzym [4].
11

1.2.2.6. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế
Chất hoạt hóa là những chất làm tăng khả năng xúc tác chuyển hóa cơ chất
thành sản phẩm. Thông thường là những cation kim loại hay những hợp chất hữu cơ
như các vitamin tan trong nước.
Chất ức chế là những chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hoặc làm enzym
không còn có khả năng xúc tác biến cơ chất thành sản phẩm. Các cơ chế ức chế
enzym bao gồm ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh. Chất ức chế cạnh tranh
là những chất có cấu trúc tương tự cơ chất, kết hợp với enzym ở trung tâm hoạt
động, ngăn chặn enzym kết hợp với cơ chất. Trong cơ chế ức chế không cạnh tranh,
chất ức chế gắn với trung tâm điều hòa của enzym làm giảm hoặc mất khả năng
hoạt động của enzym [4].
1.2.3. Các chất ức chế enzym alpha-glucosidase
Vào đầu những năm 1990, Acarbose lần đầu tiên được đưa vào thị trường

Kojibiose

[58]

Hạt
Mormodica
charantia và
từ trái
Grifola
frondosa
D-(+)-trehalose

[45]
Iminosugar

Lobelia
sessifolia
7-O-(β-D-
glucopyranozyl)
-α-
homonojirimyci
n
(DAB-1)

[25]
Carbasugar
và
pseudoamin
osugar
Vỏ của quả
nho
Marsdenia
condurango

Conduritol A

[46]
13

Thiosugar

Salacia
reticulata
Wight
Salacinol


glucopyranosid
[51]
Quercetin 3-O-
β-D-
xylopyranosyl(1
’’’2’’)-β-D-
galactopyranosi
d 1.3. Chi Gymnema R.Br.
1.3.1. Vị trí, phân loại
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (2009). Vị trí phân loại của chi
Gymnema R.Br. như sau: ngành ngọc lan (magnoliophyta), lớp ngọc lan
(magnoliopsida), phân lớp hoa môi (lamiidae), bộ long đởm (gentianales), họ trúc
đào (apocynaceae), phân họ thiên lý (asclepiadoideae), chi: Gymnema R.Br.
14

1.3.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Một số đặc điểm của 4 loài thuộc chi Gymnema R.Br. được trình bày trong bảng
1.3: (xem thêm phụ lục)
Bảng 1.3: Đặc điểm thực vật và phân bố của 4 loài thuộc chi Gymenma
ở Việt Nam


dọc theo gân.
Hình trứng
thuôn hoặc hình
trứng rộng
Phiến hình trứng,
bầu dục hoặc
trứng ngược. Bề
mặt và gân lá có
phủ lông sét nâu
Hoa
-Cụm hoa xim,
cọng hoa mảnh,
có lông mịn,
hoa nhỏ.
-Đài có lông,
mịn và rìa lông.
-Tràng phụ 5
răng. Tràng
không có lông
mặt ngoài.
-Cụm hoa xim, cao
đến 4 cm. Tràng
màu vàng, cao 6-7
mm, mặt ngoài có
lông.
-Tràng phụ đơn,
vảy tràng phụ dính
ở tràng, có hàng
lông xếp dọc theo
tràng phụ.

lá noãn rời nhau
Quả
Quả đại dài 5,5
cm, rộng ở nửa
dưới
Quả đại, hình mác,
vách dày và hơi có
sợi.
Quả 2 đại, hình
mác, Vỏ quả
nhẵn
Quả đại
Hạt
Hạt dẹp, mào
lông dài 3 cm
Hạt cỡ khoảng
1,5×1 cm, mào
lông dài 4 cm
Hạt khoảng
1,5×1cm, mào
lông khoảng 4
cm
Hạt hình trứng
thuôn dài, mào
lông 2,5 cm
15

Phân
bố
-Trên thế giới:

-Ở Việt Nam: Tây
Nguyên, Kiên
Giang
1.3.3. Thành phần hóa học
Cho đến nay, các nghiên cứu sâu về thành phần hóa học được tập trung vào
loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Schult với các nhóm chất triterpen saponin
thuộc 2 nhóm olean và dammaran. Saponin khung Olean có các acid gymnemic và
gymnemasaponin. Trong khi đó saponin khung dammaran là các gymnemasid [67].
Trong lá còn xác định có resin, albumin, chlorophyl, carbohydrat, acid tartaric, acid
formic, acid butyric, anthraquinon, alkaloid inositol, acid hữu cơ, parabin, calci
oxalat, lignin, cellulose [62].
Thành phần tác dụng chính được xác định là acid gymnemic [49], [62]. Các
acid gymnemic là các dẫn chất thế acyl (Tiglolyl, Methyltutylroyl,…) của acid
deacylgymnemic (DAGA). DAGA tương ứng là dẫn xuất thế 3-O-beta-glucoronide
của gymemagenin [23]. Cấu trúc của Gymnemagenin và 17 loại acid gymnemic
được minh họa trong hình 1.3: 16

Acid Gymnemic XVI
Hình 1.3: Cấu trúc của các acid gymnemic và gymnemagenin phân lập đƣợc
từ Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult [64]
Thành phần thứ hai được quan tâm nghiên cứu liên quan đến cơ chế hạ R

Mba
5.
Acid gymnemic IV
β- gla
Tga
Tga
Tga
6.
Acid gymnemic V
β- gla
Tga
Tga
Tga
7.
Acid gymnemic VI
β- gla
3
-β- glc
Tga
Tga
Tga
8.
Acid gymnemic VIII
β- gla
3
-β- OG
Mba
Mba
Mba
9.

H
H
H
14.
Acid gymnemic XIV
β- gla
H
H
H
15.
Acid gymnemic XV
H
Mba
Tga
H
16.
Acid gymnemic XVII
H
Bz
H
H
17.
Acid gymnemic XVIII
H
H
H
Bz
β-Glucopyranosyl (β-glc )
β-gla
β-arabino-2 –Hexulopyranosyl (β-OG)