BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐOÀN THỊ THẢO

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ĐỘC TỐ VI NẤM
DEOXYNIVALENOL VÀ ZEARALENONE
TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM THỰC
PHẨM BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐOÀN THỊ THẢO

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Đặng Ngọc Lan đã định hƣớng cho tôi
trong quá trình tìm tài liệu cũng nhƣ hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên Viện an toàn vệ sinh thực
phẩm quốc gia (NIFC) đã tạo mọi điều kiện thuận lợi đề tôi hoàn thành đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trƣờng, các phòng ban,
cùng các giảng viên, nhân viên bộ môn Hóa phân tích – Độc chất và các bộ môn
khác trong Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập
tại trƣờng.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên
tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận.

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015
Sinh viên
Đoàn Thị Thảo

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về độc tố deoxynivalenol và zearalenone 2
1.1.1. Deoxynivalenol (DON) 2
1.1.2. Zearalenone (ZEA) 3
1.1.3. Giới hạn ô nhiễm DON và ZEA trong thực phẩm [2] 5
1.2. Hàm lƣợng độc tố vi nấm DON và ZEA trong thực phẩm 6

3.2.2. Khảo sát bước làm sạch 29
3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 31
3.3.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc 31
3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 33
3.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 34
3.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi 36
3.4. Kết quả xác định ZEA và DON trong một số mẫu thực phẩm ngô 39
IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu
Tiếng anh
Tiếng việt
AA
Acid acetic

ACN
Acetonitrile

AOAC
Association of Official Analytical
Community
Hiệp hội cộng đồng phân tích
chính thức
AF

LOQ
Limit of quantification
Giới hạn định lƣợng
ML
Maximum Limit
Giới hạn dƣ lƣợng tối đa
MS
Mass spectrometry
Khối phổ
PSA
Primary Secondary Amine
Chất hấp phụ amin bậc 1, bậc 2
R(%)
Recovery
Hiệu suất thu hồi
TLC
Thin Layer Chromatography
Sắc ký lớp mỏng
SPE
Solid phase extraction
Chiết pha rắn
SD
Standard Deviation
Độ lệch chuẩn
ZEA
Zearalenone


7
Bảng 1.7.
Ô nhiễm DON trong ngô và các sản phẩm từ ngô tại Indonesia
năm 2010
9
8
Bảng 1.8
Ô nhiễm ZEA trong ngô và các sản phẩm từ ngô tại Indonesia
năm 2005
9
9
Bảng 1.9.
Tóm tắt một số phƣơng pháp tiêu chuẩn xác định độc tố vi nấm
ZEA và DON trong ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc
10
10
Bảng 1.10.
Các phƣơng pháp phân tích đồng thời ZEA và DON đã thực
hiện
10
11
Bảng 1.11.
Xác định độc tố vi nấm bằng phƣơng pháp QuEChERS
12
12
Bảng 2.1.
Các độc tố vi nấm đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
17
13
Bảng 2.2.

Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của ZEA và DON
34
21
Bảng 3.8.
Độ lặp lại và độ thu hồi của DON trên nền mẫu ngô
36
22
Bảng 3.9.
Độ lặp lại và độ thu hồi của ZEA trên nền mẫu ngô
37
23
Bảng 3.10
Kết quả xác định hàm lƣợng các độc tố vi nấm trong một số sản
phẩm từ ngô tại Hà Nội tháng 5 - 2015
40 DANH MỤC HÌNH VẼ

TT
Hình
Nội dung
Trang
1
Hình 1.1.
Công thức cấu tạo của deoxynivalenol
3

Hình 3.4.
Quy trình xử lý mẫu phân tích đồng thời ZEA và
DON
31
9
Hình 3.5.
Sắc ký đồ ZEA và DON ở mẫu trắng, mẫu chuẩn và
mẫu thêm chuẩn
32
10
Hình 3.6.
Sắc đồ ZEA tại LOQ 2 ng/ml (tƣơng đƣơng 10
µg/kg trên mẫu)
33
11
Hình 3.7.
Sắc đồ DON tại LOQ 20 ng/ml (tƣơng đƣơng 100
µg/kg trên mẫu)
34
12
Hình 3.8.
Đƣờng chuẩn ZEA
34
13
Hình 3.9.
Đƣờng chuẩn DON
35
1
1.1. Tổng quan về độc tố vi nấm deoxynivalenol và zearalenone
Độc tố vi nấm là chất chuyển hóa thứ cấp độc hại đƣợc sinh ra bởi các loài
nấm: Aspergillus, Penicillium, Fusarium và Alternaria [38]. Độc tố vi nấm có thể
đƣợc định nghĩa là “chất chuyển hóa của nấm mốc mà khi ăn phải, hít vào hoặc hấp
thu qua da gây ra bệnh tật hoặc gây tử vong cho ngƣời và động vật” [26] . Độc tố vi
nấm gây ra một loạt các tác dụng độc hại. Chúng là những chất gây ung thƣ, độc với
thần kinh, gây quái thai và gây suy giảm miễn dịch [22] [25].
Chi Fusarium bao gồm nhiều loài gây bệnh cho cây nhƣ thối rễ, thân, bắp,
củ… một số loài còn sinh ra độc tố nấm lẫn tạp trong ngũ cốc. Một số chất độc gây
tác hại đến sức khỏe con ngƣời có thể kể đến nhƣ độc tố T-2 toxin, fumonisin,
zearalenone, deoxynivalenol… dƣới đây sẽ đề cập đến 2 loại độc tố hay gặp trong
ngũ cốc, cây trồng tại Việt Nam: zearalenone, deoxynivalenol.
1.1.1. Deoxynivalenol (DON)
1.1.1.1. Cấu trúc, tính chất hóa lý
DON là một loại độc tố vi nấm thuộc nhóm trichothecen. Đây là một nhóm
các hợp chất có cấu trúc liên quan đến một hệ thống vòng tetracyclic
sesquiterpenoid. Khoảng 170 trichothecen đã đƣợc xác định [16] [15] và đƣợc chia
thành bốn loại (A-D) dựa trên sự thay đổi nhóm chức hydroxyl và nhóm bên
acetoxy. Loại A, đại diện là HT-2 và T-2 toxin, loại B thƣờng gặp là
deoxynivalenol (DON), loại C và D thƣờng ít gặp hơn [21].
DON hay còn gọi là vomitoxin đƣợc sinh ra bởi các loài F. graminearum, F.
culmorum và F. cerealis [21]. DON có thể đƣợc sinh ra ở nhiệt độ từ 21-29
o
C và
độ ẩm trên 20%. DON dễ tan trong một số dung môi phân cực nhƣ methanol,
ethanol và acetonitril. DON là chất rất bền nhiệt và bền với môi trƣờng acid, không
bị ảnh hƣởng của quá trình chế biến [29].
3
ra độc tố này cũng có thể xảy ra sau khi thu hoạch trong điều kiện bảo quản kém
[4]. Những loài này có thể sinh ra một số lƣợng nhỏ các chất chuyển hóa có liên
quan, trong đó α –zearalenol và β-zearalenol là những dẫn xuất quan trọng nhất của
zearalenone [27].

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của zearalenone
ZEA tồn tại ở dạng tinh thể không màu, nhiệt độ nóng chảy trong khoảng
164-165
o
C. Do đó, ZEA rất khó bị phá hủy ở nhiệt độ chế biến thức ăn thông
thƣờng [11].
ZEA hòa tan trong dung dịch kiềm, chloroform, acetonitrile và một số dung
môi hữu cơ khác, trong khi không hòa tan trong nƣớc, carbon disulfide và carbon
tetrachloride. Nó phát huỳnh quang dƣới ánh sáng tia cực tím (UV) và bƣớc sóng
cực đại hấp thụ tia cực tím trong methanol ở 236, 274 và 316 nm [39].
1.1.2.2. Độc tính
ZEA có hoạt tính estrogen, khi vào cơ thể, ZEA và một số chất chuyển hóa
có liên quan, cạnh tranh liên kết với các thụ thể của estrogen. Nhƣ vậy, độc tính của
nó có liên quan đến vấn đề sinh sản ở các loài động vật và có thể ở ngƣời [14] [36].
ZEA là chất có độc tính cấp tƣơng đối thấp khi dùng đƣờng uống, tuy nhiên
độc tính tăng lên khi tiêm phúc mạc. Ở động vật, tác dụng độc hại khi tiếp xúc với
ZEA bao gồm ung thƣ, đột biến gen, độc tính trên sinh sản, tác động nội tiết, suy
giảm miễn dịch. Tính nhạy cảm trên sinh sản có ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sản
xuất chăn nuôi. Vì vậy, khi vật nuôi mang thai, ZEA giảm tồn phôi và trọng lƣợng
của thai nhi, ngoài ra, ZEA làm âm hộ sƣng và đỏ, viêm âm hộ âm đạo, tắc hoặc
không có sữa và sa trực tràng. Ở giống đực, ZEA có thể làm giảm nồng độ
testosterone, trọng lƣợng tinh hoàn, và sự sinh tinh [42].
5
làm thực phẩm (không bao gồm sản phẩm quy định tại mục 7)
750
5
Mỳ ống (khô - hàm lƣợng nƣớc khoảng 12%)
750
6
Bánh mì, bánh nƣớng (pastries), bánh quy, bánh snack và đồ
ăn điểm tâm (breakfast) từ ngũ cốc
500
7
Thực phẩm chế biến từ ngũ cốc và các thực phẩm khác dành
cho trẻ dƣới 36 tháng tuổi (dạng khô)
200

6
1.1.3.2. Giới hạn cho phép zearalenone trong thực phẩm
Bảng 1.2. Giới hạn ô nhiễm zearalenone trong thực phẩm
TT
Tên thực phẩm
ML
(µg/kg)
1
Ngũ cốc chƣa qua chế biến (không bao gồm ngô)
100

11022 mẫu có 57 % mẫu dƣơng tính với DON.

Hình 1.3. Tình trạng nhiễm độc tố vi nấm do Fusarium tại 11 nước
7
Trong các đối tƣợng nhiễm DON, lúa mì là đối tƣợng nhiễm cao nhất. Trong
khi đó, đối với mặt hàng ngũ cốc, ngô là mặt hàng nhiễm DON với hàm lƣợng cao
nhất. Tỉ lệ mẫu ngũ cốc và bột sống nhiễm với hàm lƣợng cao ( ≥ 750 µg/kg) là 7%,
tỉ lệ mẫu thực phẩm ngũ cốc nhiễm với hàm lƣợng ≥ 500 µg/kg là 6 % [31].
Theo báo cáo của cơ quan thực phẩm châu Âu năm 2011 [4], lúa mì và ngô là
mặt hàng nhiễm DON với tỉ lệ cao nhất, hàm lƣợng DON trung bình từ 37 µg/kg đến
594 µg/kg, có rất ít mẫu có hàm lƣợng DON vƣợt quá giới hạn cho phép là 750 µg/kg
[10].
Bảng 1.3. Hàm lượng DON (µg/kg) trong thực phẩm ở EU [4]
Mẫu
Số lƣợng
Số mẫu
dƣơng tính
Giá trị
trung bình
(µg/kg)
Giá trị
lớn nhất
(µg/kg)
Lúa mì và bột mì
6350
3891 (61%)
205


Dữ liệu về sự có mặt của các độc tố vi nấm trong ngô trong quá trình bảo
quản bao gồm cả DON và ZEA tại Argentina từ năm 1999-2010 đƣợc tổng hợp ở
bảng 1.5 và bảng 1.6 [13].
8
Bảng 1.5. Ô nhiễm ZEA trong ngô ở Argentina từ 1999-2010 [13]
Năm
Số mẫu dƣơng
tính/ tổng số mẫu
Giá trị trung bình
(µg/kg)
Giá trị lớn nhất
(µg/kg)
1999
1/54
197,5
10000
2002
2/117
24,0
916
2003
2/71
29,9
1082
2004
4/64

tính/ tổng số mẫu
Giá trị trung bình
(µg/kg)
Giá trị lớn nhất
(µg/kg)
1999
0/54
-
-
2002
0/117
-
-
2003
0/71
-
-
2004
1/64
18,1
368
2005
2/370
15,5
720
2006
0/251
-
-
2007

µg/kg
100-200
µg/kg
200-400
µg/kg
Khoảng
hàm lƣợng
(µg/kg)
Giá trị
trung bình
(µg/kg)
DON
50
21
23
6
47,5-348,0
124,6

Trƣớc đó, cũng trong nghiên cứu của Nuryono năm 2005 [23] về sự nhiễm
ZEA trong các mẫu ngô và thực phẩm từ ngô, trong tổng số 51 mẫu có 11 mẫu
dƣơng tính với ZEA và 2 mẫu trong số mẫu dƣơng tính có hàm lƣợng ZEA cao hơn
nhiều (148 và 589 µg/kg) so với giới hạn cho phép là 100 µg/kg [10].
Bảng 1.8. Ô nhiễm ZEA trong ngô và các sản phẩm từ ngô tại Indonesia năm 2005 [23]
Độc tố vi
nấm
Tổng số
mẫu
Số mẫu
dƣơng tính

Zearalenone
Ngô, lúa mạch, sản
phẩm ngũ cốc
Dự thảo TCVN
(EN 15850:2010)
IAC
HPLC-Fl
Deoxynivalenol
Ngô và sản phẩm
ngô
Dự thảo TCVN
(EN 15891:2010)
IAC
HPLC-UV

Đặc điểm chung của các phƣơng pháp này là sử dụng kỹ thuật làm sạch bằng
cột ái lực miễn nhiễm (IAC). Đây là kỹ thuật cho độ đặc hiệu cao, nhƣng chi phí
khá lớn. Hơn nữa, do mỗi độc tố vi nấm cần có một phƣơng pháp riêng nên gây
lãng phí lớn khi thực hiện phân tích nhiều độc tố vi nấm trên một loại nền mẫu, nhƣ
các nền mẫu ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc.
Do đó, các tác giả trên thế giới hƣớng đến phƣơng pháp để xác định đồng
thời nhiều loại độc tố vi nấm trong thực phẩm, đặc biệt là ngũ cốc và sản phẩm từ
ngũ cốc.
Bảng 1.10. Các phương pháp phân tích đồng thời ZEA và DON đã thực hiện
Năm
Nền
mẫu
Đối tƣợng
Dung môi
chiết

Cột MycoSep
®

#226
LC–
APCI–
MS/MS
50-99%
0,3-3,8
µg/kg
2009
[35]
Thực
phẩm
ngũ cốc
DON, ZEA và các
chất chuyển hóa
ACN –
H
2
0 –AA
(79:20:1)
Không tìm đƣợc
cột thích hợp
LC–ESI-
MS–MS
51% -
124%
0,5-100
µg/kg

MS/MS
60–100%
10 -
60µg/kg
2011
[19]
Thực
phẩm từ
ngũ cốc
Aflatoxins,
ochratoxin A,
DON, ZEA, T‐2,
HT‐2
ACN –
H
2
0
(84:16)
SPE -Oasis
®

HLB column
LC/ESI‐
MS/MS
64-114%
0,1 –
59,2
µg/kg
2012
[33]

bằng n-
hexan
Không làm sạch
LC-
MS/MS
80 -
110%
5 -13
ng/g

1.3.2. Phương pháp QuEChERS
QuEChERS là tên viết tắt của Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged và
Safe là phƣơng pháp do hai nhà khoa học Anasstasiades và Lehotay phát triển để
phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong rau quả [5].
Phƣơng pháp QuEChERS có nhiều ƣu điểm vƣợt trội so với các phƣơng
pháp trƣớc đây:
- Nhanh (với 10 mẫu có thể tiến hành xử lý mẫu trong 30 phút)
- Đơn giản, dễ thực hiện (ít tốn thiết bị, dụng cụ đơn giản, tối thiểu đƣợc
nguồn gây sai số)
- Ít tốn kém cho quá trình phân tích
12
- Tăng độ nhạy của phƣơng pháp do dung dịch chiết không bị pha loãng
nhiều lần
- Ổn định
- An toàn cho ngƣời và môi trƣờng
Các tác giả đã ứng dụng nguyên tắc của phƣơng pháp này để áp dụng đối với
độc tố vi nấm. Một số nghiên cứu đƣợc tổng hợp ở bảng 1.11.

2012
[18]

Gạo
14 độc tố vi nấm
d-SPE
(MgSO
4
, PSA,
C
18
, nhôm
trung tính)
(UHPLC–
MS/MS
70–
98%
1,5-45
µg/kg
2013
[37]
Gia vị
17 độc tố vi nấm
Không làm
sạch
HPLC–
MS/MS
75-
117%
2,3-146
- Có độ nhạy cao, đặc biệt là sắc kí lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) rất phù
hợp để phân tích các mẫu có hàm lƣợng độc tố vi nấm ở mức thấp
- Có khả năng tách các chất dựa theo m/z, do đó cùng với khả năng tách các chất
nhờ HPLC thì phƣơng pháp này có khả năng phân tích đồng thời nhiều độc tố vi
nấm trong cùng một lần chạy
- Có tính chọn lọc cao, với khả năng xác định các chất dựa vào khối lƣợng và
cấu tạo của chất nên rất đặc trƣng cho từng chất
- Có khả năng phân tích đƣợc những chất không thể phân tích bằng sắc kí khí,
nhƣ các chất kém bay hơi, các chất không bền nhiệt
Về cơ bản, sắc kí lỏng khối phổ là phƣơng pháp sắc kí lỏng sử dụng bộ phận
phát hiện là detector khối phổ.
1.3.3.1. Sắc kí lỏng (HPLC)
Sắc kí lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và
pha động là chất lỏng (sắc kí lỏng – rắn). Khi tiến hành chạy sắc kí, các chất phân
tích đƣợc phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân
tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau, nên khả năng
tƣơng tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển
với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
a. Pha tĩnh trong HPLC [1][3]
Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất
phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thƣớc hạt rất nhỏ, từ 2 – 5 µm. Tùy
theo bản chất của pha tĩnh, trong phƣơng pháp sắc kí lỏng pha liên kết thƣờng chia
làm 2 loại: sắc kí pha thuận (NP-HPLC) và sắc kí pha đảo (RP-HPLC).
- Sắc kí pha thuận: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica
trần hoặc các silica đƣợc gắn các nhóm alkyl có ít cacbon mang các nhóm chức
phân cực: -NH
2
, -CN…)

và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích
của chúng nhƣ loại bỏ electron, proton hóa, … Các ion tạo thành này đƣợc tách theo
tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lƣợng hoặc cấu trúc phân
tử của hợp chất.
Một sơ đồ tóm tắt mô hình hệ thống LC-MS đƣợc trình bày ở hình 1.4. Cấu
tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, bộ phân tích khối
và bộ phận phát hiện.

Hình 1.4. Mô hình hệ thống LC-MS/MS
Sắc kí
lỏng
Ion hóa
Bộ phân tích
khối
Detector/lƣu
giữ số liệu
Chân không
15
a. Nguồn ion hoá
Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ đƣợc dẫn tới nguồn ion để chuyển
thành dạng hơi và đƣợc ion hóa nguyên tử. Các kĩ thuật ion hóa thƣờng đƣợc sử
dụng trong sắc kí lỏng khối phổ là ion hóa phun điện tử (ESI) và ion hóa hóa học ở
áp suất khí quyển (APCI) . Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ESI.
Kỹ thuật ESI chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở dạng khí.
Dung dịch mẫu đƣợc dẫn vào vùng có trƣờng điện từ mạnh đƣợc duy trì ở hiệu điện
thế khoảng 1- 5kV. Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện
và đƣợc hút tĩnh điện tới lối vào của thiết bị phân tích khối phổ. Các giọt nhỏ trƣớc

Bộ phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ
nhạy cao. Các ion sau khi qua Q3 sẽ đập vào bề mặt diod làm bật ra các electron.
Các electron thứ cấp sau đó đƣợc dẫn tới các diod tiếp theo và sẽ tạo ra các electron
thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron. Cứ nhƣ vậy tín hiệu sẽ đƣợc
khuếch đại và đƣợc ghi lại. Tín hiệu này tỷ lệ thuận với lƣợng ion do đó tỷ lệ với
nồng độ chất phân tích ban đầu. 17
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1.1. Độc tố vi nấm
Đối tƣợng nghiên cứu là 2 độc tố vi nấm deoxynivalenol (DON) và
zearalenone (ZEA).
Bảng 2.1. Các độc tố vi nấm được sử dụng trong nghiên cứu
TT
Độc tố vi nấm
Ký hiệu
Công thức phân
tử
Khối lƣợng phân
tử
1
Deoxynivalenol
DON
C

- Máy đồng nhất mẫu HR1843, Philips
- Máy li tâm Z383K, Hermle
- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo.
- Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01 g), Metter Toledo.